基因工程总结

基因工程总结

主要内容:

第一章基因操作的基本技术

核酸制取；质粒及质粒载体；细菌的转变；凝胶电泳；核酸寻

针；限制性内切酶、酶切图谱及分子克隆用酶

第二章pcr技术

第三章核酸分析与合成第四章噬菌体载体及粘粒

第五章目的基因的准备工作和重组及重组子的鉴别第六章基因在原核仲英铀体系中的

抒发

真核基因在大肠杆菌中的表达；哺乳动物基因工程；研究dna

与蛋白质相互作用的方法第七章植物基因工程第八章基因工程研究进展

人类基因组计划；基因诊断、基因治疗和转基因；反义技术

序言：

1.什么是基因工程？基因工程是如何诞生的？

请问：在体外将核酸分子填入病毒、质粒或其他载体分子中，形成遗传物质的新组合，并使之混入至原先没这类分子的宿主细胞中，并能够持续平衡的产卵。

2.基因工程的两个基本特征？

请问：（1）横跨天然的物种屏障（2）确认的dna扩充3.基因工程的步骤和内容？请问：酶乌拆分目的基因→重组dna分子→迁移至受体细胞增殖→赢得甄选目的重组子(→

抽取目的基因可供进一步研究→重组目的基因功能抒发)

4.基因工程可以应用于哪些方面?

请问：(1)增添体外蛋白质化学的革命:甲型干扰素，红细胞生成素。（2）对检测技

术的贡献：提供更多大量高纯靶，提升准确性；病原体验出（hcvhbvhiv）；遗传病确诊。

（3）直接的遗传性疾病治疗和生物体改造：转基因动植物。

（4）推动对生命现象本质机理的研究：胰岛素基因与糖尿病、癌基因与抗癌基因。

5.什么是“安全”的宿主―载体体系？

请问：丧失自我搬迁能力，可以就是营养瑕疵性，在自然环境下无法存活。第一章基因操作方式基本技术

1、提取细胞总rna的原则是什么？如何实施？为什么?答:原则：抑制rna酶活性

实行：（1）高温：180℃，2小时，灭活rnase

（2）二乙基焦炭酸乙酯（depc）,油状有毒,是一种强烈但不彻底的rna酶抑制剂。它使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

（3）采用对rnase存有猛烈乙酯促进作用的细胞水解剂，例如盐酸胍、异硫氰胍（水解细胞、遏制酶活性、裂解核糖体）

（4）带手套、口罩：阻断rna酶来源，加少污染机会。

（5）季节因素（温度）：rnase水解rna温度高活性低，须要低温展开。

2.如何进行总rna制品质量控制？答：

1）rna的浓度和纯度测量

a260nm1od=40?g/mlrna

建议a260nm/a280nm=2.0(1.7-2.0或>2.0)a260nm/a230nm>2.02）rna的完整性

变性琼脂糖凝胶电泳检查28s：18s?2：13）总rna制品的保存

溶液法（te或0.5%sds便利但不平衡)悬液法（溶液提3v乙醇可信但不方便）

3.染色体dna制备的原则是什么？各有哪些主要试剂？作用？

请问：原则：去除蛋白及细胞碎片，去除rna，维持dna分子完备。主要试剂及促进作用：sds（毁坏细胞膜结构、变性蛋白质、裂解）edta（遏制酶活性）proteinasek（蛋白酶消化蛋白质）4.如何展开dna样品的鉴别？

答：a260nm1od=50?g/mldna

建议a260nm/a280nm>1.7a260nm/a230nm>2.0

5.有哪些方法可以进行dna片段的制备？是如何进行的？答：（1）低熔点琼脂糖（羟乙基60?c-65?c熔化，结果较纯）（2）透析袋法：需要把样品浓缩，把核酸沉淀，而去掉缓冲液。（3）苯酚抽提法

（4）反反复复冻融法：多次冻融并使凝胶接到毁坏，释放出来其中dna，但回收率高

（5）电洗脱法（6）硝酸纤维素膜离心法（7）试剂盒6.什么是质粒？质粒有几类？答：质粒是一类亚细胞有机体，存在于细胞质中独立于染色体的遗传成分，由环状双链

dna组成的复制子。分为：

①f质粒（致育质粒，可以通过切割，在供体和受体间传达遗传物质）②r质粒（抗

性质粒，具有抗性基因，可以并使宿主菌对某些抗菌素产生抗性）

③col质粒：带有编码大肠杆菌素的基因。

④水解质粒：可以并使宿主新陈代谢特定分子⑤入侵性质粒：并使宿主菌具备病原体

能力7.什么就是质粒的迁移？什么就是质粒的搬迁？搬迁原理？请问：质粒的迁移：从一个细胞自我的迁移至原来不存有这种质粒的另一个细胞回去。

质粒的迁移：由共存的接合型质粒引发非接合型质粒的转移过程。原理：当相容性的

接合质粒和非接合质粒在同一细胞中，非接合质粒中mob编码的核酸酶作用其特异位点bom，使bom位点发生单链断裂而出现缺口，构象转变为缺口环状构象。当有接合性质粒

中f因子能够导致性须的合成，提供转移装z，则可以转移。如果没有，缺口可能还原维

持两种构象的动态平衡。

8.掌控质粒拷贝数的定义？质粒的激活类型？请问：定义：生长在标准培育条件下，

每个细菌细胞中所所含的质粒dna分子的数目。非标准培育条件下，每个细菌细胞染色体

平均值具备的质粒dna分子的数目。类型：一类就是世俗性型质粒，当细胞染色体激活一

次时，质粒也激活一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类就是僵硬型质粒，当染色

体激活暂停后仍然能够稳步激活，每一个细胞内通常存有20个左右质粒。

9.什么是质粒的不相容性？答：在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同

质粒不能在同一个宿主细胞中稳定存在。

10.掌控用做克隆载体的基本条件就是什么？为什么？

答：(i)具若干限制酶单一识别位点：可提供多种选择，具有多个同一种酶切位点则

可能被切碎(ii)具有复制起点：可导入宿主细胞，也是质粒自我增值必不可少条件（iii）具有选择标记：便于筛选（iv）具有较小的分子量和较高的拷贝数：操作简单，可携带较

大片段的基因，并有利于载体的稳定。

11.掌控lacz的甄选原理就是什么？

答：是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗

生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的dna的短区段，其中有β-半乳

糖苷酶基因（lacz）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一

个多克隆位点（mcs），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶c端部分序列的宿主细胞。

因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性