中国仓鼠卵巢细胞及其表达载体的改造

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人源化单克隆抗体的构建技术

人源化单克隆抗体的构建技术摘要：单克隆抗体从问世到现在已广泛应用于临床,经历了一段曲折的发展历程。

其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR 技术、抗体库技术、转基因动物等。

抗体技术从最初的嵌合抗体、改型抗体逐渐发展为今天的人源化抗体。

本文综述了人源化单克隆抗体的构建技术。

关键词：人源化,单克隆抗体,构建从20世纪7０年代英国学者Milsteｉn和德国学者Koｈler利用细胞融合技术首次成功地制备出单克隆抗体以来[1],单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。

单克隆抗体可用于分析抗原的细微结构及检验抗原抗体未知的结构关系,还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和治疗等。

然而,单克隆抗体技术在临床治疗应用中的进展却很慢,主要原因是目前单克隆抗体大多是鼠源性的，而鼠源性单克隆抗体应用于人体治疗时存在诸多问题：一是不能有效地激活人体中补体和Fｃ受体相关的效应系统；二是被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体（human anｔiｇｅn mｏuｓe ａnｔiboｄy,ＨAMA）；三是在人体循环系统中被很快清除掉。

因此，在保持对特异性抗原表位高亲和力的基础上进行人源化改造,减少异源抗体的免疫原性,成为单克隆抗体研究的重点[2]。

随着对抗体基因的研究和ＤNＡ分子重组技术的应用,通过基因改造获得特异性抗体成为可能。

１989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体的研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第3代抗体—基因工程抗体技术的发展。

至此,抗体的产生技术经历了三个阶段：经典免疫方法产生的异源多克隆抗体;细胞工程产生的鼠源单克隆抗体及基因工程产生的人源单克隆抗体。

人源化抗体就是指抗体的可变区部分（即Ｖh和Vl区）或抗体全部由人类抗体基因所编码。

人源化抗体可以大大减少异源抗体对人类机体造成的免疫副反应。

人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人源化抗体。

新教材高考生物二轮复习大题分析与表达练7基因工程类大题突破含答案

大题分析与表达练7基因工程类大题突破1.新型冠状病毒主要通过其表面刺突蛋白(S蛋白)与人体细胞膜上的ACE2蛋白结合实现感染。

截至2021年4月12日,中国成为全球首个能提供三种生产新型冠状病毒疫苗技术路线(灭活疫苗、重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗)的国家。

三种新型冠状病毒疫苗研发途径的技术原理如下:灭活疫苗是用各种理化方法灭活病原微生物及其代谢物,再通过纯化等步骤制备出相应疫苗;重组蛋白疫苗是将病毒的目标抗原基因整合到表达载体中,然后将表达载体转化到中国仓鼠卵巢细胞中,经诱导表达出大量的抗原蛋白,再通过纯化而得到的疫苗;腺病毒载体疫苗是以腺病毒作为载体,将目标抗原基因重组到载体病毒基因组中得到的疫苗。

回答下列问题。

(1)上述灭活疫苗中的“灭活”是使新型冠状病毒失去,但并不破坏该病毒的。

(2)制备重组蛋白疫苗和腺病毒载体疫苗均需要获取S蛋白基因,获取过程是提取新型冠状病毒总RNA,在酶的作用下合成DNA,再采用PCR技术选择性扩增出S蛋白基因。

PCR技术的前提是要有一段,以便根据这一序列设计出特异性的引物。

(3)腺病毒载体疫苗是将S蛋白基因重组到改造后的腺病毒内,导入人体,在体内产生S蛋白,刺激人体产生相应抗体。

改造后的腺病毒载体应具备的条件是(答出两点即可)。

与重组蛋白疫苗相比,腺病毒载体疫苗的优点体现在。

(4)腺病毒载体疫苗注入人体后,其发挥作用的机理是。

2.基因工程抗体又称重组抗体,是指利用重组DNA及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配,经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。

下图为某研究所制备小鼠抗甲型肝炎病毒抗体的流程图。

回答下列问题。

(1)实验室构建重组质粒时,为保证目的基因与载体的正确连接,过程①最好选择的限制酶是。

(2)在重组质粒中,目的基因首端的启动子能够,从而驱动目的基因的转录。

除启动子之外,重组质粒还应该包含等。

(3)为了筛选出导入目的基因的骨髓瘤细胞,可以在过程③的培养液中添加,过程③所获得的细胞具有的特点。

cho细胞表达系统及筛选原理

cho细胞表达系统及筛选原理Cho细胞表达系统及筛选原理一、引言Cho细胞表达系统是一种常用的哺乳动物细胞表达系统，被广泛应用于重组蛋白的生产。

本文将介绍Cho细胞表达系统的原理以及其在蛋白质筛选中的应用。

二、Cho细胞表达系统的原理Cho细胞是一种中国仓鼠卵巢细胞系，具有较高的生长速度和蛋白质表达能力。

Cho细胞表达系统主要包括以下几个关键步骤。

1. 转染将目标基因导入Cho细胞中，通常使用质粒转染法或病毒载体转染法。

质粒转染法通过将目标基因插入质粒DNA中，然后利用转染试剂将质粒DNA导入细胞内。

病毒载体转染法则通过构建携带目标基因的病毒载体，将其感染到Cho细胞中。

2. 选择性筛选为了确保只有转染成功的细胞能够表达目标蛋白，通常在培养基中添加适当的选择性抗生素，如G418或葡萄糖酸钾。

只有转染成功的细胞才能抵抗抗生素的作用，存活下来。

3. 扩增和表达经过筛选的细胞将被扩增培养，以获得足够数量的细胞进行大规模蛋白质表达。

通常选择合适的培养基和培养条件，以提高细胞的生长速度和蛋白质表达水平。

4. 蛋白质纯化经过表达的目标蛋白质需要进行纯化，以去除其他杂质。

常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

通过这些方法，可以获得高纯度的目标蛋白质。

三、Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中的应用Cho细胞表达系统在蛋白质筛选中具有以下优势。

1. 高表达水平Cho细胞具有较高的蛋白质表达能力，能够快速产生大量目标蛋白。

这对于需要大量蛋白质的研究和工业应用非常有利。

2. 真核细胞表达与原核细胞表达系统相比，Cho细胞表达系统能够实现真核细胞蛋白质表达。

这使得Cho细胞表达系统适用于需要进行正确的蛋白质翻译修饰、蛋白质折叠和组装的蛋白质研究。

3. 可选择性筛选通过添加适当的选择性抗生素，可以筛选出成功表达目标蛋白的细胞。

这样可以确保筛选后的细胞具有较高的表达水平和纯度。

4. 灵活性Cho细胞表达系统可以应用于多种类型的蛋白质，包括单链抗体、重组蛋白、酶等。

CHO细胞无血清培养基的筛选与优化

CHO细胞无血清培养基的筛选与优化在生物制药领域，CHO 细胞（Chinese Hamster Ovary Cell，中国仓鼠卵巢细胞）因其能够高效表达重组蛋白而被广泛应用。

然而，传统的含血清培养基存在诸多问题，如血清成分复杂且批次间差异大，易引入外源病毒和支原体污染等。

因此，开发和优化 CHO 细胞无血清培养基成为了提高生物制品质量和安全性的关键环节。

一、CHO 细胞无血清培养基的重要性血清在细胞培养中曾被广泛使用，但其存在的问题不容忽视。

血清中的成分复杂且不稳定，这使得细胞培养过程难以控制和标准化。

不同批次的血清质量差异较大，可能影响细胞的生长、代谢和产物表达。

此外，血清中可能携带的病毒、支原体等污染物会给生物制品带来潜在的安全风险。

相比之下，无血清培养基具有明显的优势。

它的成分明确且稳定，便于质量控制和优化。

无血清培养基可以减少外源污染物的引入，提高生物制品的安全性。

同时，它能够为细胞提供更适宜的生长环境，促进细胞的生长和产物表达，从而提高生产效率和产品质量。

二、筛选 CHO 细胞无血清培养基的方法1、基础培养基的选择首先需要选择合适的基础培养基作为起点。

常见的基础培养基如DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜氏改良伊格尔培养基）、RPMI 1640 等，它们在营养成分和离子浓度等方面有所不同。

需要根据 CHO 细胞的特性和培养需求，初步筛选出几种可能适用的基础培养基。

2、添加剂的筛选在基础培养基的基础上，需要添加各种营养成分、生长因子、激素等添加剂来满足 CHO 细胞的生长和代谢需求。

例如，胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺等对于细胞的生长和存活至关重要。

通过单独或组合添加这些添加剂，并检测细胞的生长情况、代谢指标和产物表达水平，来筛选出最优的添加剂组合。

3、化学成分的优化除了添加剂，培养基中的化学成分如氨基酸、维生素、无机盐等的浓度和比例也需要进行优化。

pcDNA3.1／hTSHR1043-1354bp重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

维普资讯
生垦垫塑与临０７月第７床２０年５卷第５ｈｅｅｅｉ＆ＣｉｃＭｙ０７０７０期ＣｉｓＲｍｄｓｌｉ，ａ２０，１，．ｎｅｅｎｓＶＮ５
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３５・２
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ｐＤＡ．ｈＳ１删ｂｃＮ３１ＴＨＲ／ｐ重组体的构建及在中国仓鼠卵巢细胞中的表达
ｅｔｄｍａｎａｎｎｓｏｔｉｅｙＰＲａｌｃｔｎＰｍｐｉｉｇＨｉｄＩｒｓｒｔｎｅｚｍｅｄｇｓｉｎａｄｃｏｏｉｍｉｏｅｄｗａｂａｎｄｂＣｍｐｉａｉ．ＣＲａｌｙｎ，ｉｆｏｆｎＩｅｔｃｉｎｙｉｅｔｎＩｉｏｏ
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2022版高考生物一轮复习第十单元现代生物科技专题专题二十五基因工程2试题含解析

专题二十五基因工程考点1 基因工程的基本工具与操作程序1.[2021某某某某阶段训练,12分]超氧化物歧化酶(SOD)具有抗衰老作用。

研究人员培育了能合成SOD的转基因酵母菌。

结合下图回答下列问题。

注:Hin d Ⅲ和Apa LⅠ是两种限制酶,箭头表示酶的切割位置。

(1)将图中的重组DNA分子用Hin d Ⅲ和Apa L Ⅰ完全酶切后,可得到种DNA片段。

(2)作为受体细胞的酵母菌缺失URA3基因,必须在含有尿嘧啶的培养基中才能存活,为了筛选出成功导入表达载体的酵母菌,所使用的培养基(填“需要”或“不需要”)添加尿嘧啶,理由是。

(3)目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程,称为。

为了确定受体细胞中SOD基因是否转录,可用标记的作探针与从受体细胞中提取的RNA进行分子杂交检测,分子杂交的原理是。

(4)利用蛋白质工程获得活性更高的SOD时,需根据所设计蛋白质的结构推测其氨基酸序列,最终确定相对应的脱氧核苷酸序列并经获得所需的基因。

2.[2020某某示X高中联考,15分]南极某种鱼含有抗冻基因,如图是获取转基因抗冻番茄植株的过程示意图。

请回答下列相关问题:(1)利用①过程的方法获取目的基因需要用到酶。

②过程中常需要用到的工具酶是。

(2)通过①、②过程成功构建的重组质粒,除目的基因外,还应该具备等。

(3)将目的基因导入番茄体细胞的方法是利用农杆菌的作用,其原理是。

(4)要确认抗冻基因是否在转基因番茄植株中表达出相应的蛋白质,可以采用方法,除进行分子检测外,有时还需要进行的鉴定。

考点2 基因工程的应用与蛋白质工程3.[2021某某某某质量检测,12分]植物基因工程技术的发展为人类更好地利用盐碱地提供了可能。

请回答下列问题:(1)欲培育转基因耐盐水稻,需要完成的基因工程的核心步骤是,一个基因表达载体的组成,除了目的基因和复制原点外,还必须有、以及标记基因。

(2)用PCR技术扩增耐盐基因的原理是,目前将耐盐基因导入双子叶植物最常用的方法是。

CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗

CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗来源：易生物实验浏览次数：533 网友评论0 条CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗关键词：细胞疫苗CHO细胞表达体系CHO细胞表达分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。

在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。

它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。

本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。

1、CHO细胞表达体系及其特点CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。

也可以悬浮生长。

目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) 突变株CHO。

近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。

另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。

与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。

且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。

2、CHO细胞表达疫苗（1）乙肝疫苗CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。

目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。

2023北京高三二模生物汇编：基因工程的基本操作程序

2023北京高三二模生物汇编基因工程的基本操作程序一、单选题1．（2023·北京房山·统考二模）草甘膦是无选择性除草剂的有效成分，施用时也会“误伤”作物致死，其机理是抑制与植物多种代谢途径有关的EPSP合酶的活性。

研究人员试图培育抗草甘膦作物，如图。

相关说法正确的是（）A．①过程的目的基因是抑制EPSP合酶的基因B．①过程可利用农杆菌将重组DNA导入矮牵牛细胞C．①过程运用植物体细胞杂交技术培养成转基因矮牵牛D．转基因矮牵牛存活说明EPSP合酶表达水平下降有利于抗草甘膦2．（2023·北京西城·统考二模）医生可利用分子生物学技术检测受检人是否携带HIV。

下列叙述错误的是（）A．可根据HIV的RNA序列合成小段DNA作为引物B．血液样品中HIV的RNA经逆转录后进行PCR检测C．可通过抗原-抗体杂交技术检测血液样品中HIV抗原D．与检测抗原、核酸相比，检测抗体能更早诊断HIV感染3．（2023·北京昌平·统考二模）转座子是基因组中可移动的DNA片段，玉米Ac转座子能编码转座酶而自主转座，Ds转座元件只有与Ac转座子同时存在时，才能从原位点切离并插入到新位点中。

研究者利用玉米转座子系统构建烟草突变体，下列叙述错误的是（）A．推测Ds转座元件不具有编码转座酶功能B．可构建同时含有Ac/Ds的基因表达载体C．利用农杆菌转化法将基因表达载体导入烟草细胞D．Ds与其被插入的基因间发生基因重组4．（2023·北京朝阳·统考二模）下列生物学实验中，观察实验现象时需借助仪器的是（）A．利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物B．提取和分离菠菜叶片中光合色素(2)为协调菌体生长与产物生产之间的关系，将构建好的重组质粒转入经______处理后的枯草芽孢杆菌（D(4)对三种枯草芽孢杆菌进行培养，结果如图3，请选择适宜工业发酵生产的菌种并阐明理由________。

重组融合蛋白Tumstatin-TNF-α分泌型真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

Ｒ７；４；９－３Ｒ３４２３Ｒ３１Ｒ３２３；９．
加了柔性连接臂（ｉｅ）因片段，１ｋｒ基ｎ构建了重组人ｔｔｉｕａｎ融合蛋白的表达载体，望产生一种双功ｍｓｔ希
能蛋白，能特异地杀伤肿瘤组织血管内皮细胞和肿瘤细胞。利用体外实验方法观察了重组ｓ — ｍｔ－ｉｔｓｇｕａｔ．ｎｅ．Ｎｉ１ｋｒＦ在中国仓鼠卵巢细胞－１（ｈｎｓｎｉＴＫＣｉｅｅ
ＴＦ真核表达载体和转染ｐＲＳｅ３的ＣＯＫＮｌＥｎｏＨ — １比未转染的ＣＯＫ细胞的生长速度要慢。结论成功地构建了重Ｈ —１组人肿瘤抑素融合蛋白的真核表达载体，并获得能稳定表达人肿瘤抑素融合蛋白的ＣＯ— １ＨＫ。主题词
核细胞
检测。结果所获得的ｓ — ｍｓｔ —ｎｅ—ＮｉｔｔｉｌｋｒＦ片段（．２ｇｕａｎｉＴ１３
瘤血管内皮细胞的生长，使原发和转移瘤处于休眠状态，而抑制肿瘤生长，从被认为是最有前途的肿瘤生长抑制剂之一。大量的动物试验表明肿瘤坏死因子（Ｎ）ＴＦ具有强大的抗肿瘤活性Ｊ它可触发肿瘤，微环境中肿瘤细胞和正常细胞造成相关血管的破坏
ｓ — ｍｔｉ—ｎｅ—ＮｉｔｓｔｌｋｒＦ片段，ｉｔｍｔｉ—ｎｅ．ＮｇｕａｎｉＴｓ — ｓｔｌｋｒＦ片段经ｇｕａｎｉＴ
序列结合于整合素ＯＢ受体并影响其活性，ｔ，抑制肿

改造中国仓鼠卵巢细胞

中国仓鼠卵巢细胞（ＨＯ是目前最成功的生物制品表Ｃ）
达宿主细胞 … 。工业化规模生产生物制品需要对ＣＯ细胞Ｈ
绍。
进行大规模培养。有血清培养基由于受成本昂贵，次间存批在差异，污染病毒等有害物质的可能以及供应渠道不畅等有多种因素的限制，之血清的存在会给下游纯化工作带来困加难。有血清培养基在工业规模的细胞培养中，使已让位于无
近其天然构象，而ＣＯ细胞表达系统是生物工程制药最为理想的表达系统。但这种系统也存在诸多缺点。如因Ｈ
在大规模培养中ＣＯ细胞会面Ｉ对无血清培养基的适应性差、胞无限度增殖以及细胞凋亡等很多难题。所Ｈ临着细
来大志齐连权于长明王海涛陈薇
（京微生物流行病研究所，京１０７）北北００１
摘
要
与原核细胞、母细胞以及昆虫细胞相比，国仓鼠卵巢细胞（Ｈ作为宿主）
悬浮生长。ＳＭ或ＰＭ中培养的ＣＯ细胞，于无黏附因ＦＦＨ由
子的存在，胞往往以悬浮方式生长。若加入黏附因子，细如纤粘连蛋白（ｉｏｅｔ）层粘连蛋白（ａｉｎ、原（ｏＦｂｎｃｎ、ｒｉＬｍｎ）胶ｉＣ１．

CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达系统

CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。

在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。

它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。

本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。

CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。

1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。

各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。

基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。

针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。

随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。

大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。

此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。

真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。

但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。

Tumstatin—EGFP真核表达载体构建及稳定转染CHO细胞系的建立

ｔｉｔ（８ｕｔｔ．ＧＦｘｒｓｉｎｗｓｄｔｃｅｙＲＰｄＷｅｔｒｌｔ．ＥＧＰｗｓｄｔｃｅｙｉｖｒｕｉｏｉ１．ｔｍｓａｉＥＰｅｐｅｓｏａｅｅｔｄｂＴ— ＣＲａｓｅｂｏｂｃｎｎｎＦａｅｅｔｄｂｎｅｔｆ．ｄｅｌ
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ｔｓｔ —ＧＰ的表达，ｕｔｉＥＦｍａｎ用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果重组真核表达载体正确构建并在
ＣＯ细胞获得稳定表达，ｍｔｉ．ＧＰ基因整合入细胞基因组ＤＡ，ＨｔｓｔＥＦｕａｎＮ培养液上清有融合蛋白ｔｍｓｔ —ＧＰ的分ｕｔｉＥＦａｎ泌，绿色荧光蛋白的表达高达９％以上。结论５
ＥＦＧＰ的细胞系。
成功构建了质粒ＰＲＳｅ３ＳＬＥＦ获得稳定表达ｔｍｓｔ — ＩＥｎｏ一Ｔ — ＧＰ，ｕｔｉａｎ

动物细胞表达蛋白操作流程

动物细胞表达蛋白操作流程
动物细胞表达蛋白操作流程：
①目的基因获取：选择要表达的目标蛋白，并获取其对应的基因序列或表达载体。

②构建表达载体：选择适当的表达载体，通常为质粒或病毒载体，将目的基因插入其中。

③细胞系选择：根据蛋白性质和表达需求，选择适合的动物细胞系，如CHO （中国仓鼠卵巢细胞）、HEK293（人胚肾细胞）等。

④转染前准备：准备细胞，确保细胞处于对数生长期，同时准备好转染试剂和表达载体。

⑤转染细胞：使用化学、物理或病毒介导的方法将构建好的表达载体导入动物细胞中。

⑥诱导表达：在转染后，根据载体的设计，使用适当的诱导剂启动蛋白表达。

⑦细胞培养：在适宜条件下培养细胞，包括温度、pH、CO2浓度和营养成分，以促进蛋白表达。

⑧表达监测：通过Western blot、ELISA等技术监测蛋白表达水平和完整性。

⑨收集细胞或培养上清：在蛋白表达达到预期水平后，收集细胞或培养上清液用于后续纯化。

⑩细胞裂解（如果需要）：使用机械或化学方法裂解细胞，释放细胞内表达的蛋白。

⑪蛋白纯化：使用各种层析技术和过滤方法纯化蛋白，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。

⑫蛋白鉴定与分析：使用质谱、电泳等技术验证蛋白的纯度和正确性，以及进行功能和结构分析。

⑬蛋白冻存或使用：将纯化的蛋白冻存于适宜的缓冲液中，或立即用于下游实验或生产。

CHO表达系统的遗传改造

CHO表达系统的遗传改造CHO表达系统的遗传改造哺乳动物细胞表达系统具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化蛋白药物在分子结构、理化性质和生物学功能方面最接近天然蛋白分子，是目前重组糖蛋白药物生产的首选体系。

对于较复杂的分子如基因工程抗体，以及基因治疗用病毒载体，哺乳动物细胞更是首选的表达宿主。

但哺乳动物细胞表达系统的缺点也很明显，如表达量低、大规模培养困难、生产成本高昂等。

一株成功的工程细胞除了要求目的蛋白的表达量高外，还必须适应无血清培养基培养；必须具有对不利环境的抵抗能力，即抗凋亡能力；对于非直接悬浮培养的细胞，还必须具备在无血清培养条件下的贴壁能力。

工程细胞上述能力的获得仅由培养基配方和培养条件优化设计很难实现，必须从工程细胞本身着手，对细胞本身的生理特征进行改造，才有可能实现。

鉴于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是目前基因工程制药最常用的哺乳动物宿主细胞，本研究集中对CHO细胞的部分基因进行了过表达或抑制，以期获得上述能力。

实验分成四部分：1．高效哺乳动物细胞表达载体的构建表达载体对于外源基因的高效表达十分重要。

本研究首先构建了含有人延伸因子1α亚基启动子(P_(EF-1α))和小鼠二氢叶酸还原酶(DHFR)加压扩增基因的表达载体pED5，用于外源基因的常规表达。

应用人β-干扰素(IFN-β)和人分泌型碱性磷酸酶(SEAP)基因作为报告基因，对含有巨细胞病毒即早期启动子(P_(CMV-IE))的表达载体pCdhfr1和pED5表达外源蛋白的能力进行了比较，发现对于瞬时表达，pED5略好于pCdhfr1；在稳定表达中，通过降低血清浓度，使细胞增殖缓慢，这时pED5表达外源蛋白的能力较pCdhfr1高3.1倍。

表明P_(EF-1α)启动子受细胞周期时相的影响较小，比较适于外源重组蛋白的稳定表达。

为了进一步提高表达载体表达外源蛋白的能力，我们把两个人工转录激活结构域AH和VP2分别通过一个柔性的Linker融合到λ噬菌体cI蛋白的C末端，构建了两个人工转录激活因子。

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ｔｎｌｉａｍｏｉｃｔｎ．ＨｗｖｒＣｉｅｅｈｍｔｖｒ（Ｈ）ｃｌｏｆｎｒｍｅｄｕｉｃｌｅｈｎｃｌｒｄｎｒｓｔｎｌｄａｉｓｏｅｅ，ｈｎｓａｓｒｏａｙＣＯｅｌｃｎｒｔｔｎｏｓｄｆｕｔｓｗｅｕｔｅｉａａｏｉｆｏｅｓｏｅｉｆｉｕ
ｍａｃｉｒａｔｒｃｎｇｒｔｎ．Ｉｍｕｔｏｂｃｎｉｅｅｎｔｅｗｏｅｅｐｅｓｎｙｔｒａｄｔｅｍｏｔｃｉｃｌｉｏｉｎｅｂｏｅｃｏｏｆｕａｉｓｉｏｔｓｅｏｓｄｒｄｏｈｈｌｘｒｓｉｓｓｅｍｎｈｓｒｉａｓｔｍ— ｔｏｔｐｏｅｔｅＣｒｖｈＨＯｅｌａｄｅｔｒｃｌｎｖｃｏ．ｓ
1991年bailey提出了代谢工程metabolicengineering的概念即通过dna重组技术和分子生物学手段改变酶系功能或物质转运功能以改进细胞某些方面的代谢活性进行精确目标的遗传操作如解除细胞对血清源性生长因子的依赖使细胞可合成自身所需的生长因子或扰乱细胞增殖周期调控提高细胞活性等
维普资讯
８２５
ＬＥＴＩＲＳＮＢ１ＥＩ０ＴＥＣＨＮ０Ｌ０ＧＹＶｏ．Ｎｏ５１１８．Ｓｅ．ｐ，２００７
生
物
技
术
通
讯
文章编号：０９００（０）５０５ — ４１０－０２２７０ — ８２００
综
述
中国仓鼠卵巢细胞及其表达载体的改造
造，中ＣＯ细胞本身和表达载体的改造最为关键。其Ｈ
［键词］中国仓鼠卵巢细胞；关细胞凋亡；血清培养基；无细胞周期；动子；启位置效应
［图分类号］Ｑ１中８３
［献标识码］Ａ文
ＭｏｉｃｔｎｏｉｅｅＨａｓｅａｙＣｅｌｎｐｅｓｏｃｏｄｆａｉｆＣｈｎｓｍｔｒＯｖｒｌａｄＥｘｒｓｉｎＶｅｔｒｉｏｓ
ＧＵＯＪｎｗｅ，Ｚｕ－ｉＨＡ０ＸｉｇｈｉＨＥＮｉｎ－ｕ，ＣＷｅ
ｍｎｉｅｂｖａｎｔｂｂａｎｄｊｓｂｐｉｉｔｎｏｅｉｍｆｍｕａｏｓａｄｔｅｉｐｅｅｔｉｎｏｉ－ｅｆｒｅｔｎｄａｏｅｃｎｏｅｏｔｅｕｔｙｏｔｚｉｆｍｄｕｏｌｔｎｎｈｍｌｍｎａｏｆｈｇｐｒ — ｏｉｍａｏｒｉｔｈｏ
ｌｒｅｓａｅｕｈｓｌｗｒｄｃｉｎｈｇｏｔ，ａｏｔｓｓａｄｏｅ－ｒｗｔｗｔｏｔｌｔｔｎａｇｃｌｓｃａｏｐｏｕｔ，ｉｈｃｓｓｐｐｉｎｖｒｇｏｈｉｕｉａｉ．Ｔｅｏｖｆｔｅｅｐｏｌｍｓｏｏｈｍｉｏｈｓｌｅｏｈｓｒｂｅ
［ｙｗｒｓＣｉｅｅｈｍｓｒｏａｅｓｐｐｓ；ｓｒｍｆｅｍｄｕ；ｃｌｃｃｅｐｍｔ；ｐｓｉｆｃＫｅｏｄ］ｈｎｓａｔｖｒｃｌ；ａｏｔｉｅｕ —ｒｅｉｍｅｙｌ；ｒｏｒｏｉｏｅｅｔｅｙｌｏｓｅｌｏｅｔｎｆ中国仓鼠卵巢细胞（ｈｎｓａｓｒｏａｅｓＣＯ）目Ｃｉｅｈｍｔｖｒｃｌ，Ｈ是ｅｅｙｌ前应用最为普遍的生物制品表达宿主细胞。在ＣＯ细胞规模化Ｈ培养过程中，常会面临对无血清培养基的适应性差、胞无限常细度增殖及细胞凋亡等难题。这些问题仅从培养基和培养环境优
ＩｓｔｔｏｃｏｉｏｙａｄＥｉｅｉｏ，ｃｄｍｆＭｉｔｙＭｉｌＳｉｃｓｅｉｇ１０７，ＣｉａｎｔｕｅｆＭｉｂｏｇｎｐｄｍｏｇＡａｅｙｏｌａｄｃｃｎｅ，Ｂｉｎ００１ｈｎｉｒｌｌｙｉｒａｅｊ［ｂｔａｔＡｓｒｃ］Ｍａｍａａｅｓａｅａｏｇｔｅｂｓｓｓｍｏｉｈｒｃｕｉｌｐｏｕｔｎｄｅｔｔｅｘｅｅｃｎｐｓｍｌｎｃｌｒｍｎｈｅｔｙｔｓｆｂｐａｍａｅｔａｒｃｉｕｏｈｉｅｃｌｎｅｉｏｔｉｌｅｒｏｃｄｏｒｌ —
郭俊伟综述；赵兴卉，陈薇审校
军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室（０４Ａ０２４．京１０７２０ＤＶ０１）北００１
［要］哺乳动物细胞因其表达的外源蛋白最接近天然构象，摘已成为生产重组蛋白药物的理想系统。其中，国仓鼠卵巢中细胞（Ｈ是目前最为常用的表达系统，这种系统也存在很多缺点，大规模培养中表达量低、ＣＯ）但如凋亡等。目前，过优化培养基配方和培养条件很难从根本上解决上述问题，须从整个表达系统着手进行改通必