细胞培养手册

hgc27细胞系培养说明书

hgc27细胞系培养说明书HGC27 细胞系培养说明书一、细胞简介HGC27 细胞系是一种人类胃癌细胞系，常用于胃癌相关的研究。

了解其特性和培养要求对于成功进行实验至关重要。

二、培养前准备（一）实验室环境1、细胞培养室应保持清洁、干燥，定期进行消毒和清洁，以减少污染的风险。

2、温度应控制在 37℃左右，相对湿度保持在 95%左右。

（二）仪器设备1、准备 CO₂培养箱，用于提供稳定的温度、CO₂浓度和湿度环境。

2、超净工作台，用于在无菌条件下进行细胞操作。

3、倒置显微镜，用于观察细胞的形态和生长状态。

（三）试剂和耗材1、细胞培养基，如 RPMI 1640 培养基，添加 10%的胎牛血清（FBS）和 1%的双抗（青霉素和链霉素）。

2、无菌 PBS（磷酸盐缓冲液），用于清洗细胞。

3、胰蛋白酶EDTA 消化液，用于细胞的传代。

4、无菌培养瓶、培养皿、移液器、移液管等。

三、细胞复苏1、从液氮罐中取出冻存的 HGC27 细胞，迅速放入 37℃水浴中，轻轻摇动，使其快速融化。

2、待细胞完全融化后，将其转移至无菌离心管中，加入适量的完全培养基，轻轻混匀。

3、以 1000 rpm 的转速离心 5 分钟，弃去上清液。

4、加入新鲜的完全培养基，重悬细胞，将细胞悬液转移至培养瓶中，置于 CO₂培养箱中培养。

四、细胞培养1、将复苏后的细胞置于 37℃、5% CO₂的培养箱中培养。

2、每天观察细胞的生长状态，包括细胞形态、密度等。

3、当细胞密度达到 80% 90%时，需要进行传代培养。

五、细胞传代1、吸出培养瓶中的旧培养基，用无菌 PBS 清洗细胞 2 3 次。

2、加入适量的胰蛋白酶EDTA 消化液，轻轻晃动培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞。

3、放入培养箱中孵育 1 2 分钟，直到在显微镜下观察到细胞变圆、开始脱落。

4、加入适量的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液。

5、将细胞悬液按照适当的比例分装到新的培养瓶中，加入新鲜的完全培养基，继续培养。

细胞培养手册1.培养基配制（如200 mL）：①胎牛血清10%（20 mL）②双抗1%（青霉素-链霉素，2 mL）③加入DMEM 至200 mL。

2.细胞复苏：①将冻存于-80℃或液氮中的细胞取出，放在37℃的温水中来回摇晃，使处于冰状的细胞解冻。

②将培养基、PBS提前预热至37℃，可增大细胞复苏成功率。

③将解冻的细胞（含培养基）移至15 mL的离心管中，1000 rpm离心10 min。

④倒掉上清液，向离心管中加入1-3 mL的完全培养基，用移液枪将细胞轻轻吹打，使得细胞均匀地悬浮在培养基中。

⑤将吹散的细胞加到装有培养基的培养皿（或培养瓶）中，再将培养皿（或培养瓶）轻轻摇晃，使细胞均匀地分布在培养基中。

⑥将接种有细胞的培养皿（或培养瓶）放入37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。

2.细胞传代①将培养瓶（皿）中的培养液倒出至废液盒中。

②向培养瓶（皿）中加入2 mL胰蛋白酶，消化细胞，让贴壁的细胞分散开来。

③加入胰蛋白酶消化2 min后，向培养瓶（皿）中加入4 mL培养基，同时轻轻吹打培养瓶（皿）壁，将贴壁生长的细胞吹散开。

④将胰蛋白酶消化过的细胞移至15 mL离心管中，1000 rpm离心10 min。

⑤将离心后的上清液倒掉，向离心管中加入4-6 mL的培养基，轻轻地将细胞吹打开，使细胞均匀地悬浮在培养基中。

再将分散好的细胞加入到培养瓶（皿），每个培养皿中加入2 mL细胞悬浮液。

⑥将接种有细胞的培养皿置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。

3.细胞冻存将经胰蛋白酶消化后的细胞1000 rpm离心10 min，去掉上清液，再向离心管中加入1-1.5 mL冻存液（冻存液配制：70%DMEM-1050μL、20%FBS-300μL、10%DMSO-150μL），先放在4℃存放1 h，再放在-20℃存放1 h，然后再放在-80℃下过夜，最后放在液氮中长期储存。

4.细胞计算。

GIBCO细胞培养基本知识操作手册(中文版)

目录引言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1手册目的 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1细胞培养简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2什么是细胞培养？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2有限细胞系与连续细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2培养条件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2冻存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2培养细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3细胞培养的应用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3细胞培养实验室 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4安全 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4生物安全性等级 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4安全数据表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5安全设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5个人防护设备 (PPE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5实验室安全规范 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5细胞培养设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6基本设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6扩增设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6其他用品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6细胞培养实验室 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7无菌工作区域 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7细胞培养通风橱 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7细胞培养通风橱布局 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8培养箱 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9储存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9低温储存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10细胞计数器 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10无菌技术 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11无菌工作区域 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11良好的个人卫生 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11无菌试剂和培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12无菌操作 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12无菌技术核对表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13目录生物污染 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14细菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14酵母 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15霉菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15病毒 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16支原体 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16交叉污染 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17抗生素的使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17细胞培养基本知识 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18选择合适的细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18获取细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18培养环境 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19贴壁培养与悬浮培养 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 pH 值 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21二氧化碳 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21温度 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21细胞形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22哺乳动物细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22哺乳动物细胞形态差异 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 293 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23昆虫细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24Sf21 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 Sf9 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26细胞培养维持指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26什么是传代？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26何时传代？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27常用细胞系推荐使用培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28贴壁细胞的解离 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 TrypLE™ 解离酶 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30贴壁细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31贴壁细胞传代流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31贴壁昆虫细胞传代的注意事项 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32目录悬浮细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33悬浮细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33悬浮培养容器 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34悬浮细胞传代流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34悬浮昆虫细胞传代的注意事项 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36细胞的冷冻 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37冻存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37细胞冻存指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37冻存培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38培养细胞冻存方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39冷冻细胞的解冻 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40细胞解冻指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40冷冻细胞解冻方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40支持技术方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41利用血球计数器进行细胞计数 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41台盼蓝拒染法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42浓缩细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42附录 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43疑难解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43细胞培养产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44哺乳动物细胞培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45昆虫细胞培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46细胞培养用血清产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46细胞培养用实验试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47抗生素和抗真菌剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48细胞培养用辅助产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49生长因子和纯化蛋白 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49转染和选择 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50转染试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51其他资源 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52哺乳动物细胞和昆虫细胞培养 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52细胞与组织分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52转染选择工具 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52安全数据表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52分析证书 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52技术支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53引言手册目的细胞培养基本知识随身手册是对细胞培养基本知识教学视频 (www .invitrogen .com/cellculturebasics) 的补充。

昆虫细胞培养手册

昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。

Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。

运输与储存：运输：置于干冰上。

储存和传代：置于液氮储存。

收到细胞即可开始，详见14页。

细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。

订购信息见下页。

细胞倍增时间细胞外观初始培养基Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。

贴壁紧。

TNM-FHSf21 24h 不同大小带有颗粒球形。

贴壁紧。

TNM-FHH5 18h 不同大小带有颗粒球形。

贴壁松。

Express Five SFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。

在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。

如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。

更多信息请联系技术支持。

用途：仅供研究使用。

禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。

Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。

此细胞系适用于InsectSelect系统。

这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。

大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。

体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。

Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。

用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。

如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。

在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。

造血祖细胞培养技术实验手册

造血祖细胞培养技术实验手册造血祖细胞是一种具有潜在造血能力的干细胞，在医学和科学研究中具有重要的应用前景。

本实验手册将介绍一种常用的造血祖细胞培养技术，旨在帮助研究人员更好地了解和应用该技术。

一、实验前准备1.1 器材准备- 培养箱和培养皿- 显微镜和玻片- 无菌离心管和移液管- 离心机和摇床- 安装有CO2气体剂量控制的培养箱1.2 试剂准备- 培养基：将DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）加入含10%胎牛血清的离心管中，并通过0.22μm的滤器灭菌。

- 培养因子：包括SCF（Stem Cell Factor）、TPO（Thrombopoietin）、Flt3-L（Fms-like Tyrosine Kinase 3 Ligand）和IL-3（Interleukin-3），按照生产商说明制备。

二、实验步骤2.1 抽取造血祖细胞- 用无菌针头针刺拟鼠尾静脉，并收集尾血到无菌离心管中。

注意避免受到外界污染。

- 将含有2ml PBS（磷酸盐缓冲液）的离心管加入正确的转速离心机中，离心10分钟。

将上清液中的红细胞抛弃，保留上清液。

2.2 培养造血祖细胞- 将步骤2.1得到的上清液分装到多个培养皿（每个皿中含有3x10^6 造血祖细胞），并加入制备好的培养基和培养因子。

- 将培养皿放入预先调节好的CO2培养箱中，保持37°C和5% CO2浓度的条件下培养。

- 每隔48小时，用显微镜观察细胞扩增情况，并记录细胞数目和形态。

2.3 细胞检测- 通过流式细胞术或染色法检测细胞分化和表型。

- 进一步检测是否形成了造血单元，例如通过CFU-GM（Granulocyte-Macrophage Colony Forming Unit）的检测。

2.4 细胞存储- 当细胞数量充足时，用低温保存液将细胞冷冻存储以备后续实验。

三、注意事项3.1 严格遵守无菌操作- 所有实验器材和试剂都需经过严格的无菌处理，避免细菌和其他污染物的干扰。

细胞培养操作指南

细胞培养操作指南细胞培养操作指南1，原代细胞培养原代培养需要严格要求：（1）取材时需要去除脂肪和坏死的组织(2)为减少对组织的损伤，需用锋利的器具(3)适度离心以去除用于解离的酶（4）由于原代培养组织细胞的存活率很低，故用于原代培养的细胞的密度应高于正常的传代培养的细胞密度。

（5）营养丰富的培养基比单一的培养基更可取，如果要添加血清，胎牛血清比牛马的血清更好。

(6)对于取材部位易于感染（如皮肤）应先用70%乙醇消毒，在无菌条件下切除组织，尽快转移入BSS或培养基中。

不要再培养室取材，因为动物可引入微生物污染。

若必须推迟，可保存在4℃，72h。

1. 剪切组织先将所取得的组织，用D-Hanks或Hanks液清洗，以去除表面血污，并用手术镊去除粘附的结缔组织等非培养所需组织。

再次清洗后，用手术剪将组织剪成若干小块，移入青霉素小瓶或小烧杯中，加入适量缓冲液，用弯头眼科剪，反复剪切组织，直到组织成糊状，约1mm3大小。

静置片刻后，用吸管吸去上层液体，加入适当的缓冲液再清洗一次。

2. 消化分离消化分离的目的是将细小的组织块消化分离成细胞团或分散的单个细胞，以利于进一步的培养，常用的消化酶有胰蛋白酶和胶原酶。

3. 培养细胞悬液用计数板进行细胞计数，用培养液将细胞数调整为2～5×105 cells／m1，或实验所需密度。

分装于培养瓶中，使细胞悬液的量以覆盖后略高于培养瓶底部为宜。

置CO2培养箱内，5％CO2，37℃静置培养。

一般3～5d，原代培养细胞可以粘附于瓶壁，并伸展开始生长，可补加原培养液量1／2的新培养液，继续培养2～3 d后换液，一般7～14 d可以长满瓶壁，进行传代。

注意事项：1. 无菌操作细菌或霉菌污染是培养失败的常见原因，必须加强各个环节的无菌操作观念，以预防为主，一旦污染，一般是很难消除。

2. 培养液所用的培养液必须满足细胞生存和生长的必要条件。

由于细胞来源的动物种类、组织类型不同，对培养液的要求有一定的差异，必要时可用预实验的方法选择适当的培养液。

细胞培养手册

TM细胞培养基手册MEDIUM HANDBOOK（2007）生物秀北京清大天一生物技术有限公司BEIJING TSINGHUA SKYWING BIO TECH Co.，LTD绪论现代生物制药技术快速发展，采用动物细胞大规模培养生产抗体药物、基因工程药物、人用以及兽用疫苗等生物制品日益增长。

据IMS Health的统计数据，2004年全球生物制药产业（基因重组产品）的市场已达450亿美元，其中哺乳动物细胞表达的产品销售额占70％。

这些生物制品生产的核心技术之一——动物细胞大规模培养技术也在快速发展，近20多年的发展焦点主要集中在细胞系、细胞培养基和细胞生物反应器等三个方面的突破。

其中，关于细胞培养基的重要作用，瑞士联邦科技学会（洛桑）生物工艺学教授Florian Wurm博士曾撰文强调：“培养基并不是细胞培养中唯一一种重要因素，但确实是最重要的一种。

”细胞是病毒、蛋白的表达载体，细胞培养的质量直接影响蛋白表达量或病毒生产效率。

所以，通过筛选、驯化等方法，获得优质的宿主细胞株是整个生产工艺的基础，而好的细胞培养基则是筛选、驯化出优质细胞的重要基础。

同样，生物反应器的不断发展也离不开细胞培养基，以转瓶、反应器为主要细胞生产设备，配合微载体培养、悬浮培养等高密度培养技术，均需要相适应的细胞培养基才能充分发挥作用。

细胞培养基实际上就是生物技术产业的一个“菜篮子"工程，它的用途是给细胞提供营养物质使细胞健康快速的成长，因此只要用到细胞的生物技术产品就必须要用到细胞培养基。

在将来细胞培养产率提高的日子里，细胞培养基将会扮演越来越重要的角色，一些国际细胞培养技术专家指出：“许多细胞的培养产率可能就是通过培养基和培养策略的最优化而得到提高的。

因此不管培养基是不是最要紧的因素，它都应引起我们足够的重视。

”细胞培养基从1903年开始发展到现在，技术革新进展非常迅猛，从199、MEM、DMEM、RPMI1640等基础细胞培养基，发展到当今的无血清细胞培养基。

人胚胎干细胞培养手册范本

干细胞之家操作指南运输和保存：人胚胎干细胞〔hESCs和PMEFi被装在含90％FCS和10％二甲基亚砜的冻存管中,hESCs4×105/管,可接种一个3.5cm培养皿〔或六孔板的一个孔,PMEFi4×106/管,可接种一块六孔板。

冻存管用干冰运输,收到后,hESCs投入液氮,PMEFi放入－80℃保存。

培养条件：温度：37±0.5℃CO2浓度：5.1±0.6％相对湿度：85-100%主要技术：1．细胞培养：当进行hESC培养时,总的培养原则必需遵守,所有的操作都应该在相应的细胞培养间和超净台内按无菌技术进行。

此外,通过安装空气处理和过滤设备减少空气颗粒制造一个相对洁净的空间。

当接触和细胞有关的一切试剂和材料时,应该带手套〔包括开冰箱门。

工作间在使用前后要用70％的异丙醇彻底消毒。

2．培养液和材料所有的培养液和试剂在使用前都要用0.2µm的滤膜过滤；培养瓶和TC材料在拿进培养间之前都应该用70％异丙醇消毒。

3．细胞处理为了便于操作,最好不要同时处理两个以上的标本。

操作时,在室温和低CO2的时间不要太长。

所有的细胞离心：室温,500－600g,5分钟。

干细胞之家培养液准备：MEF和hESCs培养液在无菌条件下进行,完成后用0.2µm的滤膜过滤。

当准备hESCs培养液时,保持一致性很重要。

如有可能,尽量使用相同的试剂。

使用满足于附录提供的血清替代品尤为重要。

生长因子应该最后添加,需要强调的是bFGF进行重悬时需要蛋白载体,在少量培养液中不要试图重悬它。

MEF培养液：hESCs培养液：冷冻培养液：90％FCS+10%二甲基亚砜, 0.2µm的滤膜过滤,4℃保存。

明胶准备：用超纯水配制0.1％明胶溶液,加热确保明胶完全溶解,使用前高压或0.2µm 的滤膜过滤。

明胶包被：干细胞之家://stemcell8接种细胞前,用0.1％明胶溶液包被培养皿,37℃至少30分钟,分别用1.5或4ml包被35mm或10cm培养皿。

最全细胞培养操作手册PDF版

1/cellculture1.0 Introduction (4)2.0 Design and Equipment for theCell Culture Laboratory (4)2.1 LaboratoryD esign (4)2.2 Microbiological Safety Cabinets (5)2.3 Centrifuges (6)2.4 Incubators (6)2.5 Work Surfaces and Flooring (6)2.6 Plasticware and Consumables (7)2.7 Care and Maintenance ofLaboratoryAreas (7)3.0 Safety Aspects of Cell Culture (7)3.1 RiskAssessment (7)3.2 Biohazards (9)3.3 GeneticallyModiﬁ ed Organisms (9)3.4 Disinfection (10)3.5 Waste Disposal (11)4.0 Sourcing of Cell Lines (12)5.0 Cell Types & Culture Characteristics (13)5.1 Primary Cultures (13)5.2 Continuous Cultures (13)5.3 Culture Morphology (13)5.4 Phases of Cell Growth (14)5.5 In Vitro Age of a Cell Culture (15)6.0 The Cell Environment (15)6.1 Basic Constituents of Media (16)6.2 InorganicSalts (17)6.3 BufferingSystems (17)6.4 Carbohydrates (17)6.5 Amino Acids (17)6.6 Vitamins (18)6.7 Proteins and Peptides (18)6.8 Fatty Acids and Lipids (18)6.9 TraceElements (18)6.10 Preparation of Media (18)6.11 Serum (19)6.12 Guidelines for Serum Use (19)6.13 Origin of Serum (20)7.0 Cryopreservation and Storage ofCell Lines (21)7.1 Cryopreservation (21)7.2 Ultra-low Temperature Storage (22)7.3 Inventory Control (23)7.4 Safety Considerations (23)8.0 Good Cell Banking Practices (24)9.0 Quality Control Considerations (26)9.1 Introduction (26)9.2 Reagents and Materials (27)9.3 Provenance and Integrity ofCellLines (27)9.4 Avoidance of Microbial Contamination (27)9.5 Environmental Monitoring (29)9.6 Aseptic Technique andContamination Control (29)9.7 What to do in the Eventof Contamination (30)10.0 Authentication of Cell Lines (31)11.0 Alternative Cell Culture Systems (31)11.1 Cell Culture Scale-up Systems (31)11.2 Scale-upSolutions (32)11.3 Roller Bottle Culture (32)11.4 MultilayerVessels (32)11.5 Disposable Solutions for Suspension Cells (34)11.6 Spinner Flask Culture (34)11.7 Other Scale-up Options (34)生命科学论坛 2ContentsCell Lines Available from ECACC (35)12.0Cell Culture Protocols ............................3612.1Basic Do’s and Don’ts of Cell Culture ........36 12.2 Protocol 1 – Aseptic Technique and GoodCell Culture Practice (37)12.3 Protocol 2 – Resuscitation of FrozenCell Lines (39)12.4 Protocol 3 – Subculture of Adherent Cell Lines (42)12.5 Protocol 4 – Subculture of Semi-AdherentCell Lines (45)12.6 Protocol 5 – Subcultureof Suspension Cell Lines (47)12.7 Protocol 6 – Cell Quantiﬁ cation (49)12.8 Protocol 7 – Cryopreservationof Cell Lines (52)12.9 Protocol 8 – Testing for Bacteriaand Fungi (54)12.10 Protocol 9 – Detection of Mycoplasma byCulture (56)12.11 Protocol 10 – Testing for Mycoplasma byIndirect DNA Stain (58)TablesTable 1 Commonly used cell lines of eachculture type (14)Table 2 Different types of culture medium andtheir uses (16)Table 3 Comparison of ultra-low temperaturestorage methods for cell lines (22)Table 4 “Half-Way House” Solutions toScale-up (33)Table 5Cell Culture Reagents availablefrom Sigma-Aldrich .......................65Figures Figure 1 Diagram of Microbiological Safety Cabinet Airﬂ ow Patterns .....................5Figure 2 Examples of Cell Morphology ...........13Figure 3 Schematic Representation of a Tiered Cell Banking System .........................25Figure 4 Bioreactor ........................................31Figure 5 Hyperﬂ ask & T Flask ..........................31Figure 6 Shake Flasks .....................................31Figure 7 Roller Deck .......................................32Figure 8 Roller Bottles .....................................32Figure 9 Spinner Flasks ...................................32Figure 10 Flow Scheme for Bacteria and Fungi Testing ..............................................54Figure 11 Flow Scheme for Detection of Mycoplasma by Culture ....................56Figure 12 Typical ‘fried egg’ colonies, Mycoplasma pneumoniae ......................................57Figure 13 Flow Scheme for Detection of Mycoplasma by Indirect DNA Stain ....58Figure 14 Testing for Mycoplasma by Indirect DNA Stain ........................................60 (a) Hoechst Positive Culture(b) Hoechst Negative Culture 生命科学论坛 The European Collection of Cell Cultures (ECACC) was established in 1984 as a cell culture collection to service the research community and provide an International D epository Authority recognised patent depository for Europe. Over the last three decades ECACC has expanded and diversiﬁ ed to become one of the premier collections of authenticated cell cultures in the world and this remains the core of ECACC’s business. The collections currently hold over 40,000 cell lines representing 45 different species, 50 tissue types, 300 HLA types, 450 monoclonal antibodies and at least 800 genetic disorders.The development and maintenance of such a diverse collection has inevitably produced a high level of specialist knowledge and this, combined with the support of the Health Protection Agency, has enabled ECACC to position itself as a centre of expertise in all aspects of cell culture. ECACC has developed a comprehensive range of cell culture services and diversiﬁ ed into new product areas such as high quality genomic DNA extracted from cell lines.ECACC is one of the four collections which constitute the HealthProtection Agency Culture Collections (HPA Culture Collections).A sAs has been the case since its inception, ECACC continues tooperate out of the Porton Down site, which is now the Centre forEmergency Preparedness and Response (CEPR), Health ProtectionAgency, UK.*See page 35 for more information on the cell lines available.Culture Collectionsemail: hpacultures@rg..u k The European Collection of Cell Cultures (ECACC)Visit for more information!l Cell Lines and Hybridomas l Primary Cells l Neuron Culture Kits l HepaRG Cells l DNA & RNA Products l Bacteria, Plasmids, Transposons l Mycoplasmas l Fungil LENTICULE Discs l Viruses Cell Culture Management Services Contract Cell Culture Assay Ready Cells Cell Line Identity Veriﬁ cation DNA Extraction Genetic Support Services Contract Freeze-Drying ProductsServices www.hp p a c u l .u ne s a nd Hybrid omasy C y n C G & R ia ia, pl a s C UL s l Ce S e l Co l As l Ce l DN l Ge l Co C ell ells sCu u lt ltu re Ki Kit s® C C e Ce lls sl NA A N Pr r odu o cts tsct P l as s m a d ds id s T , T ran ranspo spo o son s on sm sm as sLE E D D i scs cs sProducts and Services available from the HPA Culture Collections:e informa t i o n!e nt a ti es t o n l Mycoplasma Testing l Virus Contract Services l Patent Deposits l Safe Deposits l Sterility Testing l Training生命科学论坛 Introduction 4 1.0 IntroductionOver ten years ago, Sigma ® Life Science and the European Collection ofCell Cultures (ECACC) formed a working partnership to bring togetherthe most diverse selection of cell culture products and services availablecommercially. We did this with researchers like you in mind, to ensure thatyou have the necessary quality products to further your research goals.We continue to expand upon this partnership, and now are able to offeran even greater array of cell lines, cell culture products, knowledge, andservices to the global research community.The ﬁ eld of cell culture has advanced greatly over the years. For morethan 25 years, Sigma and ECACC have both been part of and contributedto that advancement. Early cell culture research focused on discoveringmethods for culturing a diverse array of cells from many species. Today cellculture methods are vital to broad areas of life science research. With thenumber of researchers adding cell culture to their repertoire of techniquesexpanding daily, we believe there are many who can beneﬁ t from Sigma’sand ECACC’s combined knowledge and experience in cell culture.To that aim, we have assembled this updated laboratory handbook of cellculture techniques. For the researcher new to cell culture, this handbookprovides a wealth of information from the sourcing of cell lines, safetyand laboratory design to aspects of cryopreservation and quality control.Additionally, a series of 10 detailed protocols are provided, which areroutinely used in the ECACC laboratories. For the “expert” cell culturist, itaddresses a number of important, yet often overlooked topics in cell culturesuch as cell line authentication and contamination issues, to help ensurethat the results obtained from cell culture experiments are both accurateand reproducible. The handbook is intended as a guide rather than an in-depth text book of cell culture and you are encouraged to consult relevantspecialised literature to obtain more detailed information.2.0 Design and Equipment for the CellCulture Laboratory2.1 Laboratory DesignPerhaps one of the most under-rated aspects of tissue culture is the needto design the facility to ensure that good quality material is produced in asafe and efﬁ cient manner. Most tissue culture is undertaken in laboratoriesthat have been adapted for the purpose and in conditions that are notideal. However, as long as a few basic guidelines are adopted this shouldnot compromise the work.There are several aspects to the design of good tissue culture facilities.Ideally work should be conducted in a single use facility which, if at allpossible, should be separated into an area reserved for handling newlyreceived material (quarantine area) and an area for material which is 生命科学论坛 /cellculture5 known to be free of contaminants (main tissue culture facility). If this is notpossible work should be separated by time with all manipulations on cleanmaterial being completed prior to manipulations involving the ‘quarantinematerial’. Different incubators should also be designated. In addition, thework surfaces should be thoroughly cleaned between activities.All new material should be handled as ‘quarantine material’ until it hasbeen shown to be free of contaminants such as bacteria, fungi andparticularly mycoplasma. Conducting tissue culture in a shared facilityrequires considerable planning and it is essential that a good technique isused throughout to minimise the risk of contamination occurring.For most cell lines the laboratory should be designated to at leastCategory 2 based on the Advisory Committee on D angerous Pathogens(ACDP) guidelines (ACDP, 1995)†. However, the precise category requiredis dependent upon the cell line and nature of the work proposed. Theguidelines make recommendations regarding the laboratory environmentincluding lighting, heating, the type of work surfaces and ﬂ ooring andprovision of hand washing facilities. In addition, it is recommended thatlaboratories should be run at air pressures that are negative to corridors tocontain any risks within the laboratory.† Advisory Committee on Dangerous Pathogens (1995) Categorisation ofBiological Agents According to Hazard and Categories of Containment,4th edition, Health & Safety Executive (HSE) books, Sudbury, UK,().2.2 Microbiological Safety CabinetsA microbiological safety cabinet is probably the most important piece ofequipment for cell culture since, when operated correctly, it will provide aclean working environment for the product, whilst protecting the operatorfrom aerosols. In these cabinets operator and/or product protection isprovided through the use of HEPA (high efﬁ ciency particulate air) ﬁ lters.The level of containment provided varies according to the class of cabinetused. Cabinets may be ducted to atmosphere or re-circulated through asecond HEPA ﬁ lter before passing to atmosphere see ﬁ gure 1.Class I Class 2Class 3known to be free of contaminants(main tissue culture facility)If this is notFigure 1. Diagram ofmicrobiological safetycabinet airﬂ ow patterns 生命科学论坛 6Environmental monitoring with Tryptose Soya Broth agar settle plates insidethe cabinet for a minimum of four hours is a good indicator of how cleana cabinet is (refer to ‘9.5 Environmental Monitoring’). There should be nogrowth of bacteria or fungi on such plates.In most cases a class 2 cabinet is adequate for animal cell culture.However, each study must be assessed for its hazard risk and it is possiblethat additional factors, such as a known virus infection or an uncertainprovenance may require a higher level of containment.2.3 CentrifugesCentrifuges are used routinely in tissue culture as part of the subcultureroutine for most cell lines and for the preparation of cells for cryopreservation.By their very nature centrifuges produce aerosols and thus it is necessaryto minimise this risk. This can be achieved by purchasing models that havesealed buckets. Ideally, the centrifuge should have a clear lid so that thecondition of the load can be observed without opening the lid. This willreduce the risk of the operator being exposed to hazardous material if acentrifuge tube has broken during centrifugation. Care should always betaken not to over-ﬁ ll the tubes and to balance them carefully. These simplesteps will reduce the risk of aerosols being generated. The centrifuge shouldbe situated where it can be easily accessed for cleaning and maintenance.Centrifuges should be checked frequently for signs of corrosion.A small bench-top centrifuge with controlled braking is sufﬁ cient for mostpurposes. Cells sediment satisfactorily at 80 – 150 x g . Higher gravitationalforces may cause damage and promote agglutination of the cell pellet.2.4 IncubatorsCell cultures require a strictly controlled environment in which to grow.Specialist incubators are used routinely to provide the correct growthconditions, such as temperature, degree of humidity and CO 2 levels in a controlled and stable manner. Generally, they can be set to runat temperatures in the range of 28o C (for insect cell lines) to 37o C (formammalian cell lines) and set to provide CO 2 at the required level (e.g. 5-10%). Some incubators also have the facility to control the O 2 levels. Copper-coated incubators are also now available. These are reported toreduce the risk of microbial contamination within the incubator due to themicrobial inhibitory activity of copper. The inclusion of a bactericidal agentin the incubator water trays will also reduce the risk of bacterial and fungalgrowth. However, there is no substitute for regular cleaning.2.5 Work Surfaces and FlooringIn order to maintain a clean working environment the laboratory surfacesincluding bench-tops, walls and ﬂ ooring should be smooth and easyto clean. They should also be waterproof and resistant to a variety ofchemicals (such as acids, alkalis, solvents and disinfectants). In areas usedfor the storage of materials in liquid nitrogen, the ﬂ oors should be resistantto cracking if any liquid nitrogen is spilt. Refer to Section 7.4 for safety 生命科学论坛 /cellculture7 considerations on the use of liquid nitrogen. In addition, the ﬂ oors andwalls should be continuous with a coved skirting area to make cleaningeasier and reduce the potential for dust to accumulate. Windows shouldbe sealed. Work surfaces should be positioned at a comfortable workingheight.2.6 Plasticware and ConsumablesAlmost every type of cell culture vessel, together with support consumablessuch as tubes and pipettes, are commercially available as single use, sterilepacks. Suppliers include Sigma-Aldrich, Nunc, Greiner, Bibby Sterilin andCorning. The use of such plasticware is more cost effective than recyclingglassware, enables a higher level of quality assurance and removes theneed for validation of cleaning and sterilisation procedures. Plastic tissueculture ﬂ asks are usually treated to provide a hydrophilic surface to facilitateattachment of anchorage dependent cells.2.7 Care and Maintenance of Laboratory AreasIn order to maintain a clean and safe working environment tidiness andcleanliness are key. All spills should be dealt with immediately. Routinecleaning should be undertaken involving the cleaning of all work surfacesboth inside and outside of the microbiological safety cabinet, the ﬂ oors andall other pieces of equipment e.g. centrifuges. Humidiﬁ ed incubators area particular area for concern due to the potential for fungal and bacterialgrowth in the water trays. This will create a contamination risk that canonly be avoided by regular cleaning of the incubator. All major piecesof equipment should be regularly maintained and serviced by qualiﬁ edengineers, for example:• Microbiological safety cabinets should be checked every six monthsto ensure that they are safe to use in terms of product and userprotection. These tests conﬁ rm that the airﬂ ow is correct and that theHEPA ﬁ lters are functioning properly.• The temperature of an incubator should be regularly checked with aNAMAS (National Accreditation of Measurement and Sampling, UK),or equivalent calibrated thermometer and temperature adjusted asnecessary.• Incubator CO2and O2levels should also be regularly checked to ensurethe levels are being maintained correctly.3.0 Safety Aspects of Cell Culture3.1 Risk AssessmentThe main aim of risk assessment is to prevent injury, protect propertyand avoid harm to individuals and the environment. In many countriesthe performance of risk assessment is a legal requirement. For example,this is the case in the UK under the Health and Safety at Work Act, UKconsiderations on the use of liquid nitrogen In addition theﬂoors andT ﬂ asks available fromCorning 生命科学论坛 8(1974). There are also European Community directives covering Health andSafety at work. You can visit the European Agency for Safety and Healthat Work website (www.europe.osha.eu.int) for information on legislationand standards or you should contact your on-site Health and Safetyrepresentative. Consequently risk assessments must be undertaken prior tostarting any activity. The assessment consists of two elements:1. Identifying and evaluating the risks.2. Deﬁ ning ways of avoiding or minimising the risk.For animal cell culture the level of risk is dependent upon the cell line tobe used and is based on whether the cell line is likely to cause harm tohumans. The different classiﬁ cations are given below:Low risk - Non human/non primate continuous celllines and some well characterised human continuouslines.Medium risk- Poorly characterised mammalian cell lines.High risk- Primary cells derived from human/primate tissue or blood.- Cell lines with endogenous pathogens (the precisecategorisation is dependent upon the pathogen) – referto ACDP guidelines, for details †.- Cell lines used following experimental infection wherethe categorisation is dependent upon the infectingagent – refer to ACDP guidelines, for details.†Advisory C ommittee o n D angerous P athogens (ACD P) (1995) C ategorisationof Biological Agents According to Hazard and Categories of Containment,4th edition, HSE books, Sudbury, UK. The second supplement to the 1995document was produced in 2000 - ‘Second supplement to: Categorisationof biological agents according to hazard and categories of containment(Fourth edition, 1995) Second Edition 2000’. Crown copyright 2000, UK.An update to the Approved List of Biological agents was issued in 2004,available at: /pubns/misc208.pdfNote: The U.S. D epartment of Health and Human Services (Centers forDisease Control and Prevention) publishes a similar list, in its Biosafety inMicrobiological and Biomedical Laboratories (BMBL) document (2007).The U.S. system uses Biological Safety Levels in place of the UK ACD Phazard groups.A culture collection such as ECACC will recommend a minimumcontainment level required for a given cell line based upon its riskassessment. For most cell lines the appropriate level of containment isLevel 2 requiring a class 2 microbiological safety cabinet. However, thismay need to be increased to containment Level 3 depending upon the(1974). There are also European Community dir 生命科学论坛 /cellculture9 type of manipulations to be carried out and whether large culture volumesare envisaged. For cell lines derived from patients with HIV or HumanT-Lymphotropic Virus (HTLV) Level 3 containment is required.Containment is the most obvious means of reducing risk. Other less obviousmeasures include restricting the movement of staff and equipment into andout of laboratories. Good laboratory practice and good bench techniquessuch as ensuring work areas are uncluttered, reagents are correctly labelledand stored, are also important for reducing risk and making the laboratorya safe environment in which to work. The risk of exposure to aerosols orsplashes can be limited by avoiding rapid pipetting, scraping and pouring.In addition, it is recommended that people working in laboratories whereprimary human material is used are vaccinated against Hepatitis B. Stafftraining and the use of written standard operating procedures and riskassessments will also reduce the potential for harm. Cell culture trainingcourses covering the basics of tissue culture safety are offered by ECACC.3.2 BiohazardsViruses pathogenic for humans are one of the most likely biohazardspresented by cell cultures. Where infection with an agent pathogenic forhumans is known or suspected, the cell culture should be handled at acontainment level appropriate for the agent concerned. Other potentialbiohazards should also be considered. These relate to components ofthe cell culture medium, other adventitious agents (e.g. contaminatingmycoplasmas), and cell products, some of which may be biologicallyactive molecules with pharmacological, immunomodulating or sensitisingproperties. In addition, the generation and use of modiﬁed cells, forexample, hybrids, transformed cells and cells containing recombinantD NA can be hazardous. These procedures could potentially result in theappearance of modiﬁ ed or reactivated viruses, novel fusion/hybrid proteins(especially in cross-species hybrids) and the expression of viral or cellularoncogenes.Laboratory workers should never culture their own cells. In vitrotransformation or genetic modiﬁcation could result in malignant diseaseor expression of an unusual pharmacologically active protein if they wereto be accidentally inoculated into the donor. Therefore, human cells shouldbe obtained from individuals having no association with the experimentalwork.Biohazardous waste should be disposed of according to the methodsdescribed under ‘3.5 Waste Disposal’.3.3 Genetically Modiﬁ ed OrganismsThe generation and use of genetically modiﬁ ed organisms (GMOs) shouldbe strictly controlled and regulated. Most countries have regulatoryorganisations to ensure the risks posed by GMOs are minimised. Forexample, in the UK all institutions that carry out work using and/orgenerating GMOs are required by law to have a Genetic Modiﬁ cationtype of manipulations to be carried out and whether large culture volumes生命科学论坛 10Safety Committee (GMSC). Prior to any work commencing proposals forthe intended work should go through the committee and , if necessary, beapproved by the Health and Safety Executive (HSE). There is a EuropeanDirective governing the regulation of GM work. Visit the European Agencyfor Safety and Health at Work website (www.europe.osha.eu.int) forinformation on legislation and standards, or contact your on-site Healthand Safety representative.It is the responsibility of the individual cell culture user and institutionto ensure compliance with the regulations set by the authorities of thecountry they are operating in.3.4 DisinfectionMethods designed for the disinfection/decontamination of culture waste,work surfaces and equipment represent important means for minimisingthe risk of harm. Always wear appropriate personal protective equipment(PPE) such as gloves and eye protection when using concentrated formsof disinfectants. The selected gloves should protect against the substancebeing handled and meet the European standard EN374-3. Manufacturers’’charts will help to identify the best gloves for the work.The major disinfectants fall into four groups and their relative merits canbe summarised as follows:Hypochlorites (e.g., Sodium Hypochlorite)• Good general purpose disinfectant• Active against viruses• Corrosive against metals and therefore should notbe used on metal surfaces e.g. centrifuges• Readily inactivated by organic matter and thereforeshould be made fresh daily• Should be used at 1000ppm for general use surfacedisinfection, 2500ppm in discard waste pots fordisinfecting pipettes, and 10,000ppm for tissue culturewaste and spillages Note: When fumigating a cabinet or room using formaldehyde all thehypochlorites must ﬁ rst be removed as the two chemicals react together toproduce carcinogenic products.PhenolicsPhenolic based disinfectants should never be used as they are notsupported as part of the EU Biocidal Products Directive reviewprogramme.Alcohol (e.g. Ethanol, Isopropanol)• Effective concentrations: 70% for ethanol, 60-70%for isopropanol • Their mode of activity is by dehydration and ﬁ xation Safety Committee (GMSC). Prior to any work 生命科学论坛 /cellculture11• Effective against bacteria. Ethanol is effectiveagainst most viruses but not non-enveloped viruses• Isopropanol is not effective against virusesAldehydes (e.g. Formaldehyde)• Aldehydes are irritants and their use should belimited due to problems of sensitisation• Should only be used in well ventilated areas.Formaldehyde is used to fumigate laboratories. The formaldehye isheated in a device so it will vaporise and all exposed surfaces arecoated with the disinfectant.Generally the use of aldehydes for disinfection and fumigationpurposes can be hazardous. Check local regulations and with yoursafety advisor.3.5 Waste DisposalAny employer has a ‘duty of care’ to dispose of all biological waste safelyin accordance with national legislative requirements. Given below is a listof ways in which tissue culture waste can be decontaminated and disposedof safely. One of the most important aspects of the management of alllaboratory-generated waste is to dispose of waste regularly and not toallow the amounts to build up. The best approach is ‘little and often’.Different forms of waste require different treatment.• Tissue culture waste (culture medium) – inactivate for at least 2 hoursin a solution of hypochlorite (10,000ppm) prior to disposal to drainwith an excess of water.• Contaminated pipettes should be placed in hypochlorite solution(2500ppm) overnight before d isposal by autoclaving and incineration.• Solid waste such as ﬂ asks, centrifuge tubes, contaminated gloves,tissues, etc., should be placed inside heavy-duty sacks for contaminatedwaste and incinerated.• If at all possible waste should be incinerated rather than autoclaved.• Waste from specially licensed laboratories e.g. those handlinggenetically modiﬁ ed level 3 (GM3) organisms requires speciﬁ ctreatment and tracking.•Effective against bacteria Ethanol is effectiveSafety Aspects of Cell Culture生命科学论坛。

细胞培养操作指南

细胞培养操作指南1.实验室准备：在开始细胞培养之前，准备好所有所需的实验室设备和试剂：培养皿、细胞培养基、胎牛血清、无菌移液器、无菌离心管、显微镜等。

2.个人准备：进入实验室前，务必穿戴好个人防护装备，包括实验室服、手套和口罩。

确保双手清洁，并使用含酒精的消毒液消毒工作台。

3.细胞培养基准备：根据实验需求，配制适当的细胞培养基。

将细胞培养基加热至37摄氏度，使其变得温暖。

4.细胞扩增与传代：a.从冷冻保存的细胞存储管中取出细胞，并将其转移到一只预先加热的离心管中。

b.离心管轻轻离心，使细胞沉淀在管底。

c.弃去上清液，加入预先加热的新鲜培养基，轻轻悬浮细胞沉淀。

d.将细胞悬液转移到一个新的培养皿中，确保细胞均匀分布。

e.将培养皿放入恒温培养箱，并根据细胞类型和实验要求设置合适的温度和湿度。

f.观察细胞生长情况，并根据需要传代细胞。

传代细胞时，将细胞悬液转移到新的培养皿中，注意细胞定植的密度不要太高。

5.细胞分裂与凝聚度检测：使用显微镜观察细胞培养的生长情况，检查细胞的形态和凝聚度。

正常细胞应该呈现光滑、扁平、并且凝聚在一起的形态。

6.细胞的移植和收获：当细胞生长到适当的数量时，可以进行细胞的移植或收获。

使用无菌移液器将细胞转移至其他试管或培养皿中，确保操作环境和使用器皿都是无菌的。

7.细胞冻存：根据实验的需要，将细胞制备成冻存物。

将细胞悬液转移到冻存保存培养基中，并加入适量的冷冻保护剂（如DMSO），在-80摄氏度的冰箱中快速冷冻。

8.废弃物处置：在培养过程中产生的废弃物（例如培养皿、试管等），必须按照实验室的规定进行处理。

通常情况下，将废弃物放入带有生物危险标识的废物箱中。

9.清洗和消毒：在培养工作完成后，清洗并消毒实验室工作台和使用的器皿。

使用含酒精的消毒液对工作台表面进行擦拭，并将使用过的器皿彻底清洗，并经过高温高压灭菌。

10.实验记录：进行细胞培养时，要详细记录每个操作步骤，包括使用的细胞类型、培养方法、检测结果等。

细胞培养完整手册

细胞培养完整手册引言细胞培养是现代生物学和医学研究领域必不可少的一环。

本文将介绍细胞培养的基本原理、操作步骤、培养常见问题及解决方法。

细胞培养基本原理细胞培养是指利用人工制备的培养基以及适当的生长因子、激素和营养物质等对细胞进行体外培养和扩增，从而使细胞可以在体外连续增殖并保持原有的生物学特性。

细胞培养是现代细胞生物学、免疫学、病毒学、分子生物学以及药学研究的基础。

细胞培养的操作步骤实验前准备实验前要准备工具、试剂和消毒物品等，以确保实验的顺利进行和细胞的纯度与无菌。

细胞解冻1.从低温冻存罐中取出样品，将其放在37℃恒温水浴中解冻，不要使用冷却液或热盘等快速解冻方式。

2.用培养基缓慢悬浮细胞，宜加入10% FBS卡死细胞，避免冷冻完再活化产生过多氧化物等致细胞杀伤性的物质。

3.对细胞悬浮液进行离心，弃掉上清液，用适量的完整培养基重悬细胞沉淀，充分混匀后接续培养。

细胞传代1.用 PBS 泡洗清除细胞上附着的蛋白质和细胞碎片等杂质。

2.加入胰酶 0.05% 消化 3~5 分钟，让细胞分离迅速、均匀，切勿长时间消化。

3.将消化细胞在上清液中轻轻悬浮，检查细胞的分离和体积大小。

4.将细胞上清液转移至新的培养瓶中，鉴定细胞标记和污染情况。

5.加适量的完整培养基，并放入 CO2 培养箱中进行培养，定期观察细胞的生长情况，每两到三天定期更换培养基。

技巧提示1.培养瓶应洗涤干净，并喷壁消毒剂。

2.常用的培养基配方包括 DMEM 培养基、RPMI 1640 培养基、F12 培养基等，根据不同的实验需要进行选择。

3.培养箱应定期清洗和消毒，保证无菌环境。

4.细胞的传代次数不应过多，避免引起细胞特性的变化和突变。

细胞培养常见问题及解决方法细胞失活或死亡1.培养基中缺失营养物质如血清、氨基酸等，应加入完整培养基进行补充。

2.细胞感染，需要添加抗生素，如青霉素、链霉素等。

3.培养条件不适宜，如 CO2 浓度、温度等，应适当调节。

细胞培养完整手册[指南]

细胞培养完整手册常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。

配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH 计（测量培养用液PH 值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。

培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。

必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2 孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum 和培养用液）。

无菌操作基本技术无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰ 来苏尔或者新洁尔灭或者0.5 ％过氧乙酸擦拭。

2.CO2 孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰ 新洁尔灭擦拭，然后用75 ％酒精擦拭或者0.5 ％过氧乙酸，再用紫外灯照射。

3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30 分钟。

4.实验后灭菌：用75 ％酒精（3‰ 新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

5.定期检测下列项目：钢瓶之CO2 压力；CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)；无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。

6.水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。

实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。

2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75 ％酒精棉球擦净双手。

无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS 、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75 ％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。

3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。

ips培养技术手册

ips 培养技术手册IP细胞培养技术手册1. 引言细胞培养技术是一种重要的生物学研究方法，用于研究细胞生物学、药理学、毒理学等领域。

IP细胞培养技术是一种特殊的细胞培养方法，通过使用IP细胞培养基和特定的培养条件，可以有效地培养和维持细胞。

本手册将介绍IP细胞培养技术的基本步骤和注意事项。

2. 材料与设备2.1 材料•IP细胞培养基•细胞培养皿•细胞培养瓶•双抗（青霉素和链霉素）•细胞培养相关试剂2.2 设备•CO2培养箱•细胞培养超净工作台•细胞计数仪3. 细胞培养步骤3.1 细胞复苏1.从-80°C冰箱中取出细胞冻存管。

2.将冻存管放入37°C水浴中快速融化。

3.轻柔地将细胞悬液转移至离心管中。

4.加入适量培养基，轻轻吹打细胞，使其均匀分散。

5.将细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入适量培养基，混匀。

3.2 细胞培养1.将细胞悬液转移至细胞培养皿中。

2.将细胞培养皿放入CO2培养箱中，37°C、5% CO2条件下培养。

3.每隔一天更换一次培养基。

3.3 细胞传代1.弃去培养皿中的培养基。

2.加入适量胰蛋白酶，轻轻摇晃，使细胞分散。

3.等待细胞消化至适当程度后，加入适量培养基终止消化。

4.使用细胞刮刀将细胞从培养皿壁上刮下。

5.离心收集细胞，弃去上清。

6.加入适量培养基，轻轻吹打细胞，使其均匀分散。

7.将细胞悬液转移至新的培养瓶中，加入适量培养基，混匀。

4. 注意事项1.操作过程中应严格遵守无菌操作原则，避免污染。

2.使用新鲜、合格的细胞培养基和试剂。

3.细胞培养过程中应避免剧烈震荡，以免损伤细胞。

4.定期观察细胞生长状况，如细胞密度、形态等，及时调整培养条件。

5.细胞传代时，应注意控制胰蛋白酶的浓度和消化时间，避免过度消化。

5. 结语IP细胞培养技术是一种有效的细胞培养方法，通过遵循正确的操作步骤和注意事项，可以获得高质量的细胞。

希望本手册对您的研究工作有所帮助。

如有其他问题，请随时与我们联系。

WAVE细胞培养手册原理和方法

新一代的光纤电极技术实时反馈控制可选的 UniБайду номын сангаасorn 工作站可以对细胞培养过程实时监测，全方位掌握细胞培养各个参数的变化趋势，Logo book 可以自动记录整个实验过程，自动 Evaluation处理和比较实验数据和报告打印，通过 FDA CFR Part 11 认证，符合 cGMP 的要求。
Xcyte 公司的 Hami 等人成功的在 WAVE生物反应器中培养免疫 T 细胞治疗慢性淋巴细胞性白血病。免疫 T 细胞具有抗肿瘤、恢复机体免疫功能等潜在功效，从而显著降低白血病患者的感染风险。在 10L 的培养规模下，分别以不同淋巴细胞白血病患者的 PBMC 为来源实现 T 细胞体外扩增。结果表明：相比静态培养方式，WAVE 培养方式使细胞密度提高 5 倍，培养体积比传统方式减少 83%，培养袋数量从 60 个减少为 1 个，劳动力成本降低 33%，从而显著简化操作提高效率。最终得到 188± 50 x 109 T cell，各项检测指标均符合临床要求，成为无菌封闭 GMP 免疫 T 细胞培养的大规模临床生产技术。
WAVE 生物反应器用于细胞治疗规模化培养
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除免疫 T 淋巴细胞外，WAVE 反应器还适合骨髓间充质干细胞(mesenchymalstromal /stem cells, MSCs) 等贴壁治疗性细胞的规模培养。骨髓间充质干细胞(MSCs) 需要贴壁到合适的表面以进行扩增，通常使用大量 T 型瓶进行培养，属于劳动密集型操作，需要较大的存储空间。Linnea Pauler 等人的研究表明，WAVE 微载体细胞培养和 T 型瓶的细胞生长速度相似。然而，WAVE 微载体培养可以提供更大的可贴附表面积，细胞密度得以提高，因此获得同样数量贴壁细胞所需的培养基体积仅为常规 T 型瓶培养系统的一半，有效降低培养基的成本。从操作上讲，使用 WAVE 反应器时，约 80 个 T 型瓶可以被减少为一个 WAVE 培养袋，操作非常简便，劳动强度显著降低。

(新)实用哺乳动物细胞培养手册

实用哺乳动物细胞培养手册细胞培养基本概念细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。

细胞培养的培养物可以是单个细胞，也可以是细胞群。

细胞培养目的与用途1、科学研究：药物研究开发与基础研究药物研究与开发(1) 新药筛选：如化学合成药物药效研究、中药有效成分筛选与鉴定等。

(2) 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。

(3) 基因工程药物研究与开发：如干扰素研究与开发，细胞生长因子研究与开发等。

(4) 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开发，人参皂甙、紫杉醇等生物活性成分研究与开发。

(5) 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体，治疗用单克隆抗体。

基础研究(1) 药物作用机理(2) 基因功能(3) 疾病发生机理2、生物制药(1) 疫苗生产：如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。

(2) 基因工程药物生产：如在临床医学中具有治疗价值的一些细胞生长因子如干扰素、粒细胞生长因子、胸腺肽等(3) 诊断用和药用单克隆抗体生产(4) 细胞工程药物生产：生物细胞内的一些生物活性多肽，生物活性物质等细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。

2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。

血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。

13、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。

在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。

因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。

GIBCO细胞培养基本知识手册中文版.pdf

目录引言 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1手册目的 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1细胞培养简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2什么是细胞培养？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2有限细胞系与连续细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2培养条件 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2冻存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2培养细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3细胞培养的应用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3细胞培养实验室 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4安全 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4生物安全性等级 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4安全数据表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5安全设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5个人防护设备 (PPE) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5实验室安全规范 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5细胞培养设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6基本设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6扩增设备 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6其他用品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6细胞培养实验室 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7无菌工作区域 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7细胞培养通风橱 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7细胞培养通风橱布局 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8培养箱 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9储存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9低温储存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10细胞计数器 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10无菌技术 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11无菌工作区域 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11良好的个人卫生 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .11无菌试剂和培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12无菌操作 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12无菌技术核对表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13目录生物污染 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14简介 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14细菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .14酵母 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15霉菌 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15病毒 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16支原体 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .16交叉污染 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17抗生素的使用 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .17细胞培养基本知识 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18选择合适的细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18获取细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .18培养环境 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19贴壁培养与悬浮培养 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .20 pH 值 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21二氧化碳 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21温度 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .21细胞形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22哺乳动物细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22哺乳动物细胞形态差异 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .22 293 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .23昆虫细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24Sf21 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 Sf9 细胞的形态 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25方法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26细胞培养维持指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26什么是传代？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26何时传代？ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .27常用细胞系推荐使用培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .28贴壁细胞的解离 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30 TrypLE™ 解离酶 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .30贴壁细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31贴壁细胞传代流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .31贴壁昆虫细胞传代的注意事项 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .32目录悬浮细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33悬浮细胞的传代 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33悬浮培养容器 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .33所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34悬浮细胞传代流程 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .34悬浮昆虫细胞传代的注意事项 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .36细胞的冷冻 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37冻存 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37细胞冻存指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37冻存培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .38所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38培养细胞冻存方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .39冷冻细胞的解冻 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40细胞解冻指导原则 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40所需材料 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40冷冻细胞解冻方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40支持技术方案 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41利用血球计数器进行细胞计数 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41台盼蓝拒染法 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42浓缩细胞 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42附录 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43疑难解析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43细胞培养产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44细胞系 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .44哺乳动物细胞培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .45昆虫细胞培养基 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46细胞培养用血清产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .46细胞培养用实验试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47抗生素和抗真菌剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .48细胞培养用辅助产品 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49生长因子和纯化蛋白 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .49转染和选择 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .50转染试剂 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51其他资源 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52哺乳动物细胞和昆虫细胞培养 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52细胞与组织分析 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52转染选择工具 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52安全数据表 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .52分析证书 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52技术支持 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .53引言手册目的细胞培养基本知识随身手册是对细胞培养基本知识教学视频 (www .invitrogen .com/cellculturebasics) 的补充。

昆虫细胞培养手册

昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。

Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。

运输与储存：运输：置于干冰上。

储存和传代：置于液氮储存。

收到细胞即可开始，详见14页。

细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。

订购信息见下页。

细胞倍增时间细胞外观初始培养基Sf9 72h 规则的带有颗粒球形。

贴壁紧。

TNM-FHSf21 24h 不同大小带有颗粒球形。

贴壁紧。

TNM-FHH5 18h 不同大小带有颗粒球形。

贴壁松。

Express Five SFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。

在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。

如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。

更多信息请联系技术支持。

用途：仅供研究使用。

禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。

Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。

此细胞系适用于InsectSelect系统。

这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。

特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。

大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。

体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。

Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。

用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。

如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。

在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。

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