细胞培养基本知识基本技术
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缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含 个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加 组分两大部分。
观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他 生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子； 又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、 生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获 得它们的分泌产物。
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。
• 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
• 测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞 活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本 参数之一。
• 饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能
达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞 群体停止繁殖。
• 潜伏期/滞留期 • 指数增长期 • 平台期/停滞期 • 退化或死亡
• 细胞系的生长过程
• 细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
• 目前常用的三维培养模型： 基质覆盖培养 旋转烧瓶培养 微载体培养 预置支架培养 旋转细胞培养系统 自发性细胞聚集
细胞培养技术的特点及应用
优点： 1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
• 1907 年 -Harrison用细胞培养解决一个难题 • 盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法
悬滴培养法基本步骤
1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和 植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。
2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向 下压向盖玻片
3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。 放入培养箱培养
• 1910 至 1923年 – Carrel 和早期的组织培养 • 卡氏瓶培养法
培养板培养法
方法：将培养细胞接种在培养 板的孔内，然后在CO2培养箱 内培养。应培养量较小也称为 微量培养。
悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早
建立的体外培养技术
基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖
玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使 植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹 形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中 培养。
• 大多数的二倍体细胞为 有限细胞系。无限细胞 系大多已发生变异。
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
培养细胞的特性3 -生长过程
• 单个细胞增殖：细胞周期
• 高等生物体，细胞周期时间的长短变化主 要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳 定。
• Hela 8-16h 5-9h 2-8h
20-28h
一群细胞的增殖：细胞生长曲线
• 接种后，每天进行检测计数，以细胞数为 纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。
往往针对性很强，价格偏高。
三维细胞培养技术
• 将具有三维结构不同材料的载体与各种不 同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能 够在载体的三维立体空间结构中迁移、生 长, 构成三维的细胞-载体复合物。
• 普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失 了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在 体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境 相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且Hale Waihona Puke Baidu以研究中 间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验 之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现 细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
• 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
细胞增殖密度抑制
• 当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比 较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在 静止状态下维持存活一段时间，但不会继 续分裂生殖。
• 转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们 的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以 增殖至较高的终末细胞密度。
细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。
• 细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞
系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。
• 细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状
上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系
• 有限细胞系：如果不能
继续传代或传代有限， 可称为有限细胞系。
• 连续细胞系：能够连续
传代的细胞叫做“连续 细胞系或无限细胞系。 可培养50代以上并无限 培养下去。
细胞培养的基本知识、 基本技术
医学院 中心实验室
谷景义
主要内容： • 1、细胞培养基本知识 • 2、培养细胞生长的条件 • 3、细胞培养的基本技术
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含 个别蛋白或大量蛋白组分。基本成分为基础培养基及添加 组分两大部分。
观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他 生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子； 又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质（抗体、 生长因子）的能力；或者要大规模的培养某种细胞，以获 得它们的分泌产物。
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。
• 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
• 测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞 活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本 参数之一。
• 饱和密度：在特定条件下，培养器皿内能
达到的最高细胞数，当细胞达到饱和密度后细胞 群体停止繁殖。
• 潜伏期/滞留期 • 指数增长期 • 平台期/停滞期 • 退化或死亡
• 细胞系的生长过程
• 细胞系：原代培养细胞经首次传代成功后即成为
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
• 目前常用的三维培养模型： 基质覆盖培养 旋转烧瓶培养 微载体培养 预置支架培养 旋转细胞培养系统 自发性细胞聚集
细胞培养技术的特点及应用
优点： 1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
• 1907 年 -Harrison用细胞培养解决一个难题 • 盖玻片覆盖凹型载玻片悬滴培养法
悬滴培养法基本步骤
1、在盖玻片上滴加胚胎提取液、血浆和 植块，混匀。培养基凝固后将植块包埋。
2、在凹载片周围涂凡士林。将凹载片向 下压向盖玻片
3、将凹载片反转，盖玻片周围涂溶蜡。 放入培养箱培养
• 1910 至 1923年 – Carrel 和早期的组织培养 • 卡氏瓶培养法
培养板培养法
方法：将培养细胞接种在培养 板的孔内，然后在CO2培养箱 内培养。应培养量较小也称为 微量培养。
悬滴培养法也称植块悬滴培养法，是最早
建立的体外培养技术
基本要点：将组织或器官植块接种在一张盖
玻片上，滴上一滴培养液，然后翻转盖玻片使 植块及营养液悬挂在盖玻片下，再放置于一凹 形载片之上，最后用溶蜡密封后放入培养箱中 培养。
• 大多数的二倍体细胞为 有限细胞系。无限细胞 系大多已发生变异。
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
培养细胞的特性3 -生长过程
• 单个细胞增殖：细胞周期
• 高等生物体，细胞周期时间的长短变化主 要集中在G1期，S，G2和M期基本保持稳 定。
• Hela 8-16h 5-9h 2-8h
20-28h
一群细胞的增殖：细胞生长曲线
• 接种后，每天进行检测计数，以细胞数为 纵坐标，以时间为横坐标，绘制成曲线。
往往针对性很强，价格偏高。
三维细胞培养技术
• 将具有三维结构不同材料的载体与各种不 同种类的细胞在体外共同培养, 使细胞能 够在载体的三维立体空间结构中迁移、生 长, 构成三维的细胞-载体复合物。
• 普通的细胞培养由于细胞在体外改变的环境下增生逐渐丧失 了原有的性状，往往和体内情况不相符，而动物实验完全在 体内进行, 但由于体内的多种因素制约以及体内和外界环境 相互影响而变得复杂化, 难以研究单一过程，且Hale Waihona Puke Baidu以研究中 间过程。三维细胞培养技术是介于单层细胞培养与动物实验 之间的一种技术，既能最大程度的模拟体内环境，又能展现 细胞培养的直观性及条件可控性的优势。
• 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
细胞增殖密度抑制
• 当细胞生长汇合形成单层时，细胞变得比 较拥挤，这时其分裂停止，这种细胞可在 静止状态下维持存活一段时间，但不会继 续分裂生殖。
• 转化细胞或恶性肿瘤细胞与正常细胞不同，他们 的接触抑制和增殖密度抑制常常降低，因而可以 增殖至较高的终末细胞密度。
细胞系，可泛指一般可以传代的细胞。
• 细胞株：通过筛选或克隆化，从原代细胞或细胞
系中获得具有特殊性质或标志物的细胞。
• 细胞系亚系：由某一细胞系分离出来，在性状
上与原细胞系不同的细胞系，称该细胞系的亚系
• 有限细胞系：如果不能
继续传代或传代有限， 可称为有限细胞系。
• 连续细胞系：能够连续
传代的细胞叫做“连续 细胞系或无限细胞系。 可培养50代以上并无限 培养下去。
细胞培养的基本知识、 基本技术
医学院 中心实验室
谷景义
主要内容： • 1、细胞培养基本知识 • 2、培养细胞生长的条件 • 3、细胞培养的基本技术
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。