细胞培养基本知识
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧细胞培养技术是现代生物学和医学领域中不可或缺的技术之一。
利用细胞培养技术，我们可以研究细胞生长、发育、分化、疾病等方面的基本问题，也可以应用于药物筛选、细胞治疗、工程组织等领域。
本文将向您介绍一些细胞培养技术中的基础知识和操作技巧。
一、选择培养物在进行细胞培养之前，首先需要选择合适的细胞种类和培养物。
常见的培养物包括DMEM、RPMI1640、MEM等等，不同的培养物适用于不同类型的细胞，具体应该根据细胞种类和实验需求来选择。
此外，培养物中一般也会添加一些重要的成分，如胎牛血清、人血清、靶向蛋白、激素等等，这些成分的含量和种类也会影响细胞的生长与生理状态。
二、细胞培养的基本步骤细胞培养的基本步骤包括细胞的分离、细胞的培养和细胞的观察与分析。
1. 分离细胞分离细胞是细胞培养中的关键步骤之一，通常采用酶消化法和机械法两种方式。
通过酶消化法，可以使细胞与培养皿表面解离，从而得到单个或小团细胞；而机械法则是通过振荡或刮擦来达到分离细胞的目的。
2. 细胞的培养将分离好的细胞加入到预先涂覆有培养物的培养皿中，并将培养皿置于恒温箱（37℃，5% CO2）中培养。
在细胞生长的过程中需要定期更换或添加培养物。
3. 细胞的观察与分析细胞的观察可以通过显微镜来实现，观察细胞形态、大小、数量、移动等生长状态；而细胞的分析则可以利用细胞计数仪、细胞分选仪、PCR等技术，对细胞进行数量统计和功能评估。
三、细胞培养常见问题及应对方法在进行细胞培养的过程中，常会遇到一些问题。
例如，细胞不能够生长或生长缓慢；细胞死亡严重；细胞感染等等。
以下是一些常见问题以及针对问题的解决方法：1. 细胞不能够生长或生长缓慢这种情况可能是培养物失活或者浓度不足，这时候需要更换新鲜的培养物，或者调整培养物的含量。
2. 细胞死亡严重细胞死亡可能是由于细胞抗性引起的，这时候可以根据细胞类型来调整培养条件和细胞密度；另外，也有可能是由于感染、缺氧等过程中引起的，需要及时采取相应的处理措施。
实验室细胞培养基本知识
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
• 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 • 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2
环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。
• 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各 种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须 用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。 • 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
细胞培养技术总结
细胞的生长特点
体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴壁型和 悬浮型。 贴壁细胞的主要代表是成纤维细胞，一般在接种 后24h内贴壁，刚开始时细胞多呈圆形，随贴 壁时间延长，逐渐伸展成梭形或多边形。传代 后的成纤维细胞12h开始贴壁，24h内完全贴壁。 上皮细胞型、游走细胞型和多形型都属于贴壁 型细胞。 悬浮型细胞包括血液白细胞和癌肿瘤细胞，不需 要附着于底物而于悬浮状态下生长良好。
四、细胞的冻存与复苏
• 细胞冻存和复苏的基本原则：慢冻快融， 可以最大限度的保存细胞活力。 • 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作 保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的 通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分 渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从 而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。 • 冻存的细胞浓度：正常人的成纤维细胞浓 度： 5×106~1×107细胞/ml
细胞生长的三个阶段
• 潜伏期 ：细胞接种后先悬浮在培养液中，此时细胞 质回缩，胞体呈圆球形，继续培养便开始贴壁， 24h内便可长满瓶壁。 • 对数生长期 ：细胞增殖最旺盛的时期，随细胞数量 不断增多，生长空间逐渐减少，最后细胞互相接触 汇成一片。 • 停滞期：细胞数量达到饱和密度之后，停止增殖， 细胞数量不再增加，但仍有代谢活动，因而培养液 中的营养逐渐耗尽，代谢产物积累，此时需要分离 培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变或者 脱落死亡，故传代应在细胞长满瓶壁80%的时候传 代最好。
注：细胞培养液要贮存在4℃冰箱，避免光照， 试验前放入37℃水浴中温热。
加血清的高糖培养液存放期为六个月，期间 谷氨酰胺会分解，若细胞生长不佳，可以 再添加适量谷氨酰胺。 环境条件：95%空气和5%CO2 的气体； 温度：37℃
三、细胞的消化传代
成纤维细胞生长至高密度时，须分殖至新的培养瓶中， 一般稀释比例为1:3 至1:6。 1.PBS缓冲液、0.25%的胰蛋白酶和含10%的DMEM预先 放入37℃水浴中温热； 2.倒掉培养瓶内旧的培养液，加入4~6ml PBS缓冲液洗 涤残留培养液； 3.加入2~3ml胰蛋白酶，放入37℃ CO2孵箱中消化2~3 分钟，镜检观察，如有细胞间隙变大，细胞质回缩 现象，加入培养液终止消化。 4.用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，加入 离心管中，800rpm离心5min； 5.倾去上清液，加少量培养液重悬细胞，计数后调整 细胞浓度为1×107 /ml，在新的或者灭菌好的培养瓶 加入6ml左右新鲜培养液，将调整好浓度的细胞液 滴入培养瓶中，混匀，做好标记，放入37℃ CO2孵 箱培养。隔天换液。
细胞培养基本技术
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
细胞培养基本知识
（2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到一定 程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常 二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代， 此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、
停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。
这一转折点有人称之危象临界点（crisis），有 些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞 可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们 称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。
（3） 细胞作为生命活动的基本单位的共同特点： 首先所有细胞 表面均有一层脂蛋白成分的生物 膜，即细胞膜，使细胞能与周围环境保持相对独 立性； 其次，所有细胞都有两种核酸，即DNA和RNA 作为遗传信息的复制和转录的物质基础； 第三作为蛋白质合成的“机器”-核蛋白，是一 切细胞不可缺少的基本结构； 第四所有细胞都是以一分为二的分裂方式增殖。 第五，细胞具有多样性，形状、大小悬殊很大， 结构复杂程度也很不一样。
株（Cell strain)
4. 组织（细胞）培养的医学生
物学意义
（1） 培养的组织器官或细胞，能在一定范围和 程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养 的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物
质基础
（2） 细胞培养与生物工程：细胞培养技术已经 成为商品化生物技术的核心。如目前可提供的产 品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗、乙肝疫苗； 非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素、集落刺
（3） 衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生 增殖缓慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡， 多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所
谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，
这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人 胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人 的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。
细胞培养必备知识
注意：
1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。
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传代
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。
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三、在肿瘤学中的应用
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肿瘤细胞生物特性学研究
–比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生 长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改 变，对于建立诊断标准有益。 肿瘤细胞体外生长形态学研究 肿瘤细胞生长特性 细胞接触抑制实验
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肿瘤发病机制研究
–肿瘤产生诱发因素的研究 –肿瘤细胞侵润机制和过程的研究 –肿瘤与正常细胞 共同培养法
研究肿瘤药物筛选
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异种移植研究
裸鼠发现与应用 建立了动物移植瘤模型
抗肿瘤药物筛选
研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化 又成为新热点
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生物治疗
–活细胞---体细胞---体内
–活化细胞（LAK）---患者
–组织---悬液---培养---回输机体
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细胞培养：
一、原代培养
二、传代培养
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一
原代培养
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6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内. 注意： 步骤2中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过24小时后一定要换液；
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6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出；
细胞培养相关知识点
细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。
常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。
常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。
2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。
3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。
细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。
4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。
常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。
5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。
常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。
6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。
7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。
注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。
细胞培养技术
二、培养细胞的特性
培养细胞的生长特点
贴附
贴附
贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一 以成纤维细胞为例，一般在细胞接种后，很快
（5-10min）便可见细胞以伪足初期附着，与底物
形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展
开，细胞体的中心部分亦随之扁平；最后细胞成
为成纤维细胞的形态。
1. 培养细胞的生长方式及类型
五 细胞冷冻保存
1. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，
冷冻方法： 传统方法8小 时(或隔夜)--> 液氮槽蒸汽相中长期储存。
2. 材料用品
1） 2） 3） 4） 生长良好的培养细胞 新鲜培养基 DMSO (Sigma D-2650) 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
四、细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一 般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料用品： PBS,0.25%胰酶, 新鲜培养基
3. 步骤：
3.1. 贴壁型细胞 1） 吸掉旧培养液。
2） 用PBS 洗涤细胞一至二次。
3） 0.25%胰酶37℃ 作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细 胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。
1. 细胞培养(cell culture)概念
从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在 无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存
和生长并维持其结构和功能的技术。
体内、外细胞的差异
体内细胞：
机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能
3. 操作步骤：
细胞培养基本知识基本技术
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
细胞培养基本知识 基本知识1培养细胞的生长特点和生长过程
2023/10/18
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3.每代细胞的生长过程
• 细胞的一代：从接种开始到下一次再传代接种的 时间。
• 每代细胞的生长过程分三个阶段 1)滞留期(latent phase) ：生长缓慢 2)指数生长期(logarithmic growth phase)又称对 数期，试验用 3)平台期又称生长停滞期(stagnate phase)。传代
S :DNA合成期，易受致癌物影响。 G2：DNA合成后期 ，进行RNA和蛋白质合成。
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9（2）Biblioteka 裂期:M期（前，中，后，末）：时 间短，主要是分裂。
细胞周期=间期+M期=G1+S+G2+M
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单个细胞的细胞周期
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– 正常细胞：接触抑制保证培养过程中不重叠。 – 转化和肿瘤细胞：无接触抑制现象，能继续移动
和增殖，细胞发生堆积。
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• 不受正常生长调控系统的控制，能持续的分裂与增殖。 • 许多癌细胞具有变形运动能力，并且能产生酶类，使血管基底 层和结缔组织穿孔，使它向其它组织迁移
培养细胞的生长特点和生长过程
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一、细胞的生长特点
1、贴附并伸展 • 是体外培养细胞的基本生长特点； • 大多数哺乳动物细胞在体内、体外均附着
底物生长。
细胞培养基本知识
细胞培养在基因治疗方面也有很大作用。本实验室利用 培养的SY5Y细胞，通过将早老素基因PS-1转染入SY5Y细胞；而后，用RT-PCR证明转染有PS-1基因的细胞内部有PS-1 mRNA转录，用单抗检测细胞PS-1蛋白的表达。而后可用以检测细胞是否有早老现象。再用类似方法，我们可以研究细胞的钙通道以及其它药物作用的膜通道，从而指导临床药物应用，并据此来研究新的药物。
1.2 细胞培养的实验室要求
细胞培养要求较高，目的是使细胞能在无菌条件下存活。提取细胞的手术器具在每次使用之前应高温、高压消毒，配培养液的水要求用灭菌双蒸水并加入双抗。所用培养瓶、离心管等器皿最好为一次性。要在无菌室超净台上操作。每次操作之前，要用紫外灯照射工作台20-30min，然后将手洗干净，换拖鞋进入无菌间，将手用新洁尔灭喷洗一遍再操作。
2 以人血管内皮细胞为例说明细胞培养
由于细胞本身性质不同，其分离和培养方法也会有差异。其来源一般是新鲜脐带的脐静脉（来自于产后24h以内），具体的分离方法是：取新生儿脐带血(25 cm左右)，放入含青、链霉素各100U/mL的灭菌PBS中，4C保存，24h内进行实验。
2.1. 取材和原代培养
2009-05-29 17:35回复
白港人 ☆Gabri液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？
要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月~ 一年。
2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用及使用方法。
几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ?C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ?C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-20?C保存。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
细胞培养的基本知识
第一章细胞培养的基本知识第一节前言细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，包括单个细胞的培养。
具体说来，是指在无菌条件下，把动物或植物的细胞从有机体中分离出来，置于培养器皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和生长的方法。
广义上的细胞培养包括器官培养(organ culture)、组织培养(tissue culture)和细胞培养(cell culture)。
但因从组织块生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时发生移动，使得培养中的组织难以长时间保持其原有的结构，因此三者并无严格的区别。
一般所说的细胞培养，即包括器官培养、组织培养和细胞培养三层含义。
细胞培养的发展历史已近百年。
最初的细胞培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则的基础上，用天然体液(如胎汁、血浆)来维持从整体切下的组织块，以对细胞进行形态和功能的观察。
Harrison和Careel(1907, 1910)首创了盖片覆盖表玻璃的悬滴培养法，建立了离体培养组织和细胞的基本模式。
后来许多学者在培养容器、培养液和培养操作技术方面加以改进和革新：在卡氏瓶的启示下，设计出多种类型的培养瓶；培养基由天然动物血浆改进为合成培养基；促细胞生长物质从胎汁改为动物血清；Dulbecco(1957)等采用胰蛋白酶消化处理组织，获得了单层培养物，对细胞培养的发展起了积极的推动作用，单层培养遂成为细胞培养普遍采用的技术。
采用单层培养法建立了各种细胞系和细胞株，现在全世界储存的细胞株约有万种以上。
Sanford(1948)创立了单细胞分离培养法，应用这一技术可建立遗传性状相同的克隆细胞株(clone strain)。
今天的组织培养已可把多细胞机体中各种完整的细胞和组织从错综复杂的体内影响和相互关系中分离出来，置于离体因素的直接作用下，长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动过程，并可利用不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、同位素标记以及缩时显微电影等观察、记录和研究细胞。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。
这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。
以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。
一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。
2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。
其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。
3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。
4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。
1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。
2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。
3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。
5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。
6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。
7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。
传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。
总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
细胞培养基本知识
3.血清
◆常用血清类型：
胎牛血清（剖腹产）
新生牛血清（生后24H内）
小牛血清（10-30天）
兔血清
马血清
(三)细胞培养的无菌要求
1.细胞室的无菌要求 2.细胞培养物品的无菌要求 3.操作人员的无菌要求 4.操作过程中的无菌要求
1.细胞室的无菌要求
结构要求：更衣间、 缓冲间、 操作间三部分组成。 使用前：紫外照射（1小时）
细胞培养板
常见规格 6孔 12孔 24孔 48孔 96孔
细胞培养皿
常见规格 35mm 60mm 100mm
冻存管
常用规格
1.5ml 2ml 5ml
离心管
常用规格 15ml 50ml
滤器
大多数无法高压灭菌消毒的培养用液，如人工 合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。
为细胞操作提供
无菌环境
利用鼓风机
净化空气
观察细胞生长状况
拍摄细胞生长相关资料
细胞生长的主要场所
设定条件为37
℃
95%空气 5％CO2
细胞培养用品的消毒
分离细胞
细胞培养瓶
常见规格: 25平方厘米(50ml) 75平方厘米(250ml) 150平方厘米(550ml)
滤器
四、细胞培养的基本条件
(一)细胞的生存环境
(二)细胞的营养需要
(三)细胞的无菌要求
(一)细胞的生存环境
温度37˚C 氧气 CO25% PH7.2-7.4 渗透压
(二)细胞的营养需要
1.细胞培培养基
分天然培养基和合成培养基两类 天然培养基： 血清 血浆 组织提取液 合成培养基: RPMI-1640 DMEM
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悬浮型
概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，
易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长 (尤以正常细
胞)
HL-60 分化细胞Giemsa染色
成纤维细胞
HUVECs人脐静脉内皮细胞
1.细胞种类：人脐静脉内皮细胞； 2.培养的天数：4d；原代培养； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：DMEM+15％胎牛
血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭
形，扁平形或多角形，贴壁生长。
骨髓间充质干细胞
1.细胞种类：人骨髓间充质干细胞原代； 2.培养天数：7天； 3.放大倍数：200倍，倒置显微镜； 4.培养基种类：DF12+10％FBS； 5.细胞状态与特征简述：使用 percoll 密度 梯度离心法分离人骨髓细胞。首次换液 48h， 这是7天后的骨髓间充质干细胞扩增情况。
细胞培养
2019/11/11 申艳娜
shenyannasina
? 教材 细胞培养 （Cell culture） 司徒镇强 ? 任教老师 申艳娜 shenyannasina
岳丹 yuedan1980yahoo 李晓蕾 leileili1225yahoo ? 授课 6次理论课+2次实验课
细胞培养
? 细胞培养(cell culture): 动植物细胞在体外培养 的条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。
1. 细胞种类：HL-60； 2. 培养的天数：ATRA 1 微摩尔作用5天； 3. 放大倍速：倒置显微镜 X10； 4. 培养基种类：1640+8％胎牛血清； 5. 细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或
消失，胞核呈杆状或分叶状。
KU812
1.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系； 2.培养的天数： 5d ； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。
第一章 细胞培养的基本知识
1.掌握培养细胞的生长特点和生长条件。 2. 熟悉培养细胞的特性。
第二章 细胞培养室的设置、设备和准备工作
1.掌握细胞培养实验室的设备使用方法和保养。 2.掌握实验器材的清洗和消毒灭菌方法。 3.了解细胞培养实验室的设置。
细胞培养的基本知识
体外培养细胞的分型
贴附型
大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依 赖性细胞，大致分成以下四型：
HeLa细胞
1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养； 2.培养的天数： 7d ； 3.放大倍速：倒置显微镜 X200； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。
K562细胞
1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）； 2.培养的天数：传代后 2天； 3.放大倍数：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine； 5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。
3、游走细胞型：
呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游
走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以
和其他细胞相区别。
CNE1
1.细胞种类：高分化鼻咽癌细胞系； 2.培养的天数： 3d； 3.放大倍速：相差 100； 4.培养基种类： PMI1640+10%CS； 5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，
梭型成团生长。
4、多型细胞型
? 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和 稳定的形态，可统归于此类。
SD大鼠神经元 原代
1.细胞种类：脑皮质细胞； 2.培养的天数：4-5天； 3.放大倍速：电镜 20000； 4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清+10% 马
血清； 5.细胞状态与特征简述：贴壁细胞，有多量轴
? 细胞培养分为动物细胞培养和植物细胞培养， 其中动物细胞培养是指在体外无菌条件下，模拟 体内正常生理状态下的基本条件和环境，分离培 养机体组织细胞或建立细胞系，并使得细胞在体 外培养容器中长期生长或繁殖的方法。
应用领域广泛
? 病毒学 ? 免疫学 ? 遗传学 ? 肿瘤学 ? 分化及发育 ? 细胞毒试验 ? 临床医学及生物技术
? 成纤维细胞 ? 上皮型细胞 ? 游走细胞型 ? 多型细胞型
1、成纤维细胞型
名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：
真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞， 血管内皮 形态：胞体梭形或不规则三角形，胞质向外伸出 2—3个长短不 等 的突起，中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状 细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤 维 样细胞，常有几个伸长的细胞突起
每代贴壁细胞的生长过程
? 游离期 ? 贴壁期 ? 潜伏期 ? 对数生长期 ? 停止期（平台期）
? 游离期
悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。
? 吸附期
贴附底物，一般 24小时内贴壁。
? 潜伏期
此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为 6～24ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ时。
SKOv3 （卵巢癌细胞）
1.细胞种类：SKOv3（卵巢癌细胞） 2.培养的天数：传代后3d； 3.放大倍速：倒置显微镜 X10； 4.培养基种类：DMEM+5%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞贴壁生
长，生长速度较快。
CCL-149
1.细胞种类：大鼠肺泡上皮细胞； 2.培养的天数：1d（种在48孔板中）； 3.放大倍速：倒置显微镜 X20； 4.培养基种类：F12K+10%胎牛血清； 5.细胞状态与特征简述：细胞呈梭形，透 亮贴壁生长，3－4天传代一次，Giemsa 染色。
2、上皮型细胞
名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如：
皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆
形核 生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状
生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动
上皮型细胞