细胞培养基本操作
细胞实验的基本操作
细胞实验的基本操作【细胞培养】一、细胞的复苏：非原代培养的细胞一般冻存于液氮之中，需要培养时要先从液氮中取出使之复苏。
细胞复苏的原则——快速融化：必须将冻存在－196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。
具体操作如下：1、实验前准备：1.1、将水浴锅预热至37℃，并将含10%FBS的培养液置于其中预热；。
1.2、用75％酒精擦拭紫外线照射30min的超净工作台台面。
1.3、在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。
2、取出冻存管及迅速解冻：2.1、根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。
2.2、从液氮罐中取出细胞盒，取出所需的细胞，同时核对管外的编号。
2.3、迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，约1-2min后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。
3、平衡离心将细胞悬液吸到离心管中，1000～1500rpm离心3分钟；4、制备细胞悬液吸去上清液，加入10 ml培养液，用吸管轻轻吹打均匀，使细胞悬浮；5、细胞计数细胞浓度以5×105/ml为宜。
6、培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液吸到培养瓶中，将培养瓶放入37℃和5％CO2的培养箱内培养（略微拧松培养瓶盖），换液的时间由细胞情况而定。
通常，除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有10-15ml（5－10倍）新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。
二、细胞的传代：培养的细胞生长至一定密度之后，由于培养液中营养逐渐消耗、代谢物逐步积累（可见到培养液变黄），而且细胞的生长空间也受到限制，就会影响到细胞的继续生存。
这时就需要分离出一部分细胞和更新培养液，这一过程就叫做传代。
细胞培养注意事项大全
细胞培养注意事项大全一、细胞培养实验室的基本要求细胞培养实验室必须具备以下设施和基本条件，以确保实验的准确性和可靠性，同时为研究人员提供一个安全、舒适的工作环境。
1.实验室布局：实验室应合理布局，功能明确，便于清洁和消毒。
室内布局包括细胞培养区、仪器设备区、试剂储存区、清洗区、办公区等。
各区域应相对独立，避免交叉污染。
2.实验室温度和湿度：实验室应保持恒定的温度和湿度，通常温度为20-26℃，湿度为40%-60%。
3.空气洁净度：细胞培养对空气洁净度要求较高，建议配备高效空气过滤器（HEPA），确保室内空气洁净。
4.光照和空气流通：实验室应有良好的自然光照或人工照明，同时具备良好的空气流通性。
5.电源和插座：实验室应提供稳定的电源和充足的插座，以满足各种仪器设备的需要。
6.实验台和储存柜：实验台应具备防震、防腐、防火等功能，储存柜应具备防潮、防尘、防霉等功能。
7.清洁和消毒设施：实验室应配备适当的清洁和消毒设施，如紫外线灯、酒精灯、灭菌器等。
8.防护设备：实验员应佩戴防护设备，如实验服、一次性手套、口罩等，以防止细胞培养过程中的污染和交叉污染。
二、细胞培养的基本操作细胞培养是一项技术性很强的工作，需要掌握各种基本操作技能，以保证实验的准确性和可靠性。
以下是细胞培养的一些基本操作。
1.细胞复苏：将冷冻保存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中融化，然后离心洗涤、消化，最后加入新鲜的细胞培养基中。
2.细胞传代：当细胞密度达到一定程度时，将细胞从培养瓶中取出，消化成单个细胞，然后分种到新的培养瓶中继续培养。
3.细胞冻存：将处于对数生长期的细胞消化成单个细胞，然后与冷冻保护剂混合后放入低温冰箱中冷冻保存。
4.细胞观察：定期观察细胞的生长状况，包括生长速度、形态、颜色等方面。
5.细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪对细胞数量进行计数，以评估细胞的生长速度和密度。
6.细胞分离：根据细胞的密度、大小、表面电荷等特性，通过离心、过滤等方法将不同细胞分离出来。
细胞培养基本操作技能
细胞培养基本操作技能无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。
操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300 小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验用品1. 种类︰1.1. 细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteur pipet 外，其它均为塑料无菌制品。
细胞培养的过程及注意事项
3 6 细胞培养的过程及注意事项细胞的培养过程及注意事项；根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种；1、组织块培养法；（1）基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪；2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞的培养过程及注意事项根据培养过程中是否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种及培养等步骤。
原代培养的方法很多，基本和最常用的是组织块培养法和分离细胞法。
1、组织块培养法（1）基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料，并用锋利的眼科剪将附在其上的脂肪和结缔组织去除干净。
再用平衡液（PBS）或Hanks 液漂洗；用锋利的眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks 液漂洗多次，直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润的吸管吸取切碎的组织块，清清吹到培养瓶皿中，并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上，量不要过多，要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转，使瓶底朝上，在种植了组织块一侧的对侧面加足培养液，勿使组织块与培养液接触，塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块的一侧朝上，静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1h到3h 后翻瓶，使贴壁的组织块浸没与培养液中，静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液，或者根据培养瓶种颜色的变化确定换液时间。
2、注意事项1）、组织块接种后的前3 天，从组织块向外迁徙的细胞数很少，组织块的黏附不牢固，在观察和移动的过程中，注意不要引起液体的振荡。
要避免经常翻动和振动，否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入的培养液不宜过多，避免浸泡的组织块受轻微的波动而脱落下来。
3）、用组织块培养时，要及时观察，当细胞向外迁徙出来后要注意记录并去除漂浮的组织块和残留的细胞，因为已漂浮的组织块和那些细胞碎片已经死亡，它们产生的有毒物质会影响原代细胞的生长，要及时清除。
细胞培养无菌操作基本技术
细胞培养无菌操作基本技术细胞培养是现代生物学研究中常用的一种实验技术，能够使细胞在体外条件下生长和繁殖。
无菌操作是细胞培养过程中非常重要的一项技术手段，可以保证细胞培养环境的无菌纯净，避免细胞被外部微生物污染。
本文将介绍细胞培养中常用的无菌操作基本技术，并结合实例进行详细说明。
无菌操作基本技术主要包括以下几个方面：1.实验前准备在进行无菌操作前，首先需要准备好实验所需的培养基、培养器具和其他实验工具。
这些器具和工具需要经过高温高压灭菌处理，以确保其无菌。
此外，实验人员还需佩戴无菌手套、穿戴无菌实验服，并对实验台面进行彻底的清洁消毒，保持实验环境的无菌。
2.灭菌操作在进行无菌操作前，需要对培养器具进行灭菌处理。
常用的灭菌方法有干热灭菌和湿热灭菌两种。
干热灭菌是将培养器具置于高温烘箱中，持续加热若干小时，以达到灭菌目的。
湿热灭菌则是将培养器具置于高压高温的蒸汽中，进行高压灭菌。
此外，对于一些无法耐受高温高压的培养器具，还可使用化学灭菌方法，如使用过氧化氢和酒精进行消毒。
3.无菌操作技术在进行无菌操作时，需要遵循一定的操作规范。
首先，实验人员应将实验器具放入无菌工作台中，在UV灯的照射下进行灭菌处理。
然后，实验人员需要将自己的双手放入无菌手套中，并使用无菌皮培养工具进行操作。
接下来，需要准备好含有培养基的培养皿，并用无菌注射器将细胞转移到培养皿中。
在操作过程中，需要注意避免造成培养基的污染，尽量减少对培养基的接触时间，以防止细菌或其他微生物的污染。
4.维持无菌操作环境在进行细胞培养过程中，需要维持无菌操作环境。
实验人员应避免在实验台面上散落细胞培养基、细胞碎片或其他可能造成污染的物质。
细胞培养箱和无菌安全柜的门不可长时间打开，以防止空气中的微生物进入工作区域。
并且需要定期对无菌安全柜和细胞培养箱进行清洁和消毒。
同时，实验室人员需要经常进行手部清洁，并定期更换无菌手套和实验服，保持实验环境的无菌。
细胞培养中的无菌操作是进行细胞培养实验的基础，能够产生可靠的实验数据，并在细胞学研究中发挥重要作用。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
CELL-基本培养方法
（二）双盖玻片悬滴培养法
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双盖玻片图解： 1、载体盖玻片 2、带培养物盖玻片
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与单盖玻片不同之处：
1、载体盖玻片加一滴消毒纯水贴到 带有组织块的另一面。
2、再培养时：直接取下带培养物的 盖玻片漂洗，换一张新的载体盖玻片 ,可减少污染。
细胞培养操作前及操作中应注意事项
无菌操作贯穿细胞培养的始终
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一、培养操作前注意
1.培养用物品的灭菌消毒（写出物品清单）。 2.操作台消毒（各物品布局合理进行紫外线
消毒30分钟）。 3.洗手和着装（原则上与外科手术相同）。 4.火焰消毒（酒精灯使用、金属器械、吸过
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四.灌注小室培养法 优点 1.连续观察活细胞的动态变化 2.研究理化性质对培养细胞的
影响和作用 3.活细胞的反应.
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不锈钢培养小室图 A 中央切面图 B侧面图 (mm)
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灌注小室及灌注系统示意图 A.排液瓶 B.受液瓶 C.不锈 钢灌注小室 D.扁锥型小孔道 E、F、J .2号注射针头 G 、H.塑料导管 I玻璃导管 K、L.14号注射针头(塞以棉花)
弱的细胞在接种后放置于CO2 培养箱中培养3-5 小时，使细胞黏附牢靠后再补加充足的营养液， 继续培养） 5、每隔2-3天换液，换液时先将旧的培养液吸出， 加入平衡盐溶液洗涤，吸出平衡盐溶液，再加入 新的培养液。盖上盖子继续培养。
细胞培养基本操作
细胞培养基本操作细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。
细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。
取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。
取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。
水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。
整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。
注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。
然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。
二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。
上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。
离心：1000rpm，室温离心3min。
注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。
三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。
向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。
培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。
24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。
四、注意事项1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。
细胞培养的基本操作方法
细胞培养的基本操作方法
1. 制备培养基：按照实验需求配制好所需的培养基，并进行质量控制和滤过处理。
2. 细胞的筛选与取样：选择适合实验需要的细胞进行培养，并从中分离出所需数量的细胞。
3. 细胞的接种：将取出的细胞均匀地分布到培养皿或培养板上，并加入足量的培养基使其充分生长。
4. 细胞的观察和记录：观察细胞在培养基中的生长情况，并及时记录。
5. 细胞的维护和传代：在适当的时间点及条件下，通过传代将细胞扩增并保持其良好的生长状态。
6. 细胞的冻存：在一定的条件下，将细胞进行保存和冻存，以备后续实验使用。
7. 细胞的再生：在需要时，重新接种冻存细胞并恢复其生长状态。
8. 细胞的应用：根据实验需求，将细胞用于不同的实验设计中。
细胞培养的方法及注意事项
细胞培养的方法与注意事项细胞培养是将动物某一器官、组织如肝脏、肺、肾脏等取出，将其分散成单个细胞，在人工条件下，使之存活、生长和增殖的技术。
细胞培养可分为原代培养和传代培养。
原代培养：第一次培养，将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物，不更换培养物的生长器皿的培养过程。
传代培养：在培养过程中培养物分裂生长，长满培养空间，细胞之间相互接触而发生接触抑制，生长速度减慢甚至停止。
在这种情况下，需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿中，再进行培养一、原代培养的方法：1、取材对于水产动物，取材的方法为：无脊椎动物取材用消毒海水或淡水暂养24小时；用酒精棉消毒体表；解剖需培养的组织和器官，放到消毒液中处理一段时间；取出，用灭菌BSS清洗3次鱼的取材用酒精棉消毒体表；打开腹腔（注意不能碰破肠道）；体表组织，处理方法同无脊椎动物。
原代培养过程技术路线图：①准备工作：实验台面用紫外灯照、70%酒精棉球擦；所用各种器械、培养液无菌；操作者用新洁尔灭和酒精擦手，穿衣、戴帽、口罩；实验动物体表用酒精消毒或放入无菌海水中。
②取材：在无菌条件下取出需要培养的器官或组织；如果是有菌的器官或组织需进行灭菌处理；取材要准确③培养材料的制备：欲培养的器官或组织洗去血污，剔掉多余成分。
剪成1mm3大小，用于外置块培养。
用胰蛋白酶消化，终止消化后，机械法吹打组织块，筛网过滤，过滤液离心1000rpm,10min，用培养液悬浮细胞，计数细胞密度，用于细胞培养。
④接种：外植块：用吸管将小的组织块均等地在培养瓶底排列好；反过培养瓶加入培养基，或5-6h后再加培养基；放入CO2培养箱培养；2-3d更换培养液或颜色变黄时更换；记录、每2-3d观察。
结果：1-3d，细胞从外植块中迁移出来分离细胞：将已分散的细胞悬液加到培养瓶或培养板中，并加少量培养液,细胞浓度为105-106个/ml。
不能少于5000个。
24h后加足培养液（防漂浮）。
细胞培养操作规范
4.一次将所有的所需要试剂、工具放入工作 台。不要半路走出工作间拿东西，传递东西 进工作室需酒精擦拭灭菌
CO2 培养箱：
1.设定的条件为 37℃ ， 5 ％CO2 。 2.使用 CO2 培养箱应注意的问题： ▫ 用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证 通气。 ▫ 保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。
▫ 箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000毫升 ，以保持箱内湿度。
控制水盘内污染的方法： 1、 定期(至少每两周一次)，更换水盘内的无菌 蒸馏水或无菌去离子水。 2、 在水盘内添加适量硫酸铜，预防真菌污染。 配制方法：20g无水硫酸铜＋5ml浓硫酸＋1L 灭菌纯水。 3、 水盘内添加适量抗生素。 4、定期为培养箱（含水盘）进行一次高温灭菌 。
细胞消化时间的控制：
4:细胞冻存： 吸出旧培养液加PBS冲洗两次 胰酶消化 加培养基中止消化，（以上步骤同细胞传代 ） 细胞计数 离心收集细胞，吸弃上清，加入冻存液调整细 胞密度至1×106个/ml
将细胞移入冻存管，写好标签（细胞种类，冻存时间 ）4 ℃15-30分钟，-20 ℃1-2小时，-80 ℃
消毒： 消毒前常用的包装：牛皮纸、棉布、铝饭盒包 装 高压蒸汽消毒：121℃ ，维持20-30分钟。
三：细胞培养方法
1.细胞复苏方法：
从 液 氮 中 取 出 冷 冻 管 ， 迅 速 投 入 37℃ 水 浴中，甩动冻存管，使其融化（1分钟左右）； 5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； 1000转低速离心5分钟； 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。
血清： 常用血清种类：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 使用浓度：5%-20%，一般10% 血清的消毒：过滤除菌 血清解冻步骤：–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一 天，至室温下全溶后再分装，一般用15ml无菌 离心管分装。
细胞培养和实验操作技巧
细胞培养和实验操作技巧一、细胞培养基本操作：1、基本试剂：培养基、血清、双抗、L-Glutamine、PBS（或D-Hanks）、胰酶。
有些培养基中含有L-Glumamine，因此可不必加，不然需加入2mM L-Glutamine。
血清对于维持培养细胞的生存和促进细胞增殖起着关键性作用。
常见的血清有胎牛血清和小牛血清，胎牛血清是品质最高的，因为胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。
一般选用血清种类可以根据ATCC及实验需要来选择。
胎牛和小牛血清可选择多种不同批号的小牛血清进行小样分析。
一旦确定某一厂家的某一批号小牛血清后，就保持应用至实验完成。
可保证细胞状态和实验条件的稳定性。
2、培养耗材：包括培养瓶、培养皿等，选择TC-treated 培养耗材，保证细胞贴壁良好，一些特殊细胞需要培养耗材经特殊处理，如明胶、胶原包被。
成像耗材包括6、12、24、48、96、384、1536孔板，也需要相应处理。
普通多孔板厚度约为1um，适合于20倍及以下镜头。
为达到更好的成像效果，当需要使用40倍、63倍镜时推荐用薄底板，PerkinElmer的CellCarrier 板，板底厚度只有0.19um，可满足所有物镜的需要。
3、设备：培养箱、超净台等4、细胞均匀铺板的“秘密”：细胞加入微孔板后应立即振匀，振匀方法推荐“前后-左右”法。
即把培养板方在桌面上，两手扶住板，先快速前后振动8-10次，振幅在15cm-20cm。
然后将板水平转动90度，重复刚才的动作。
振动完后平拿板，轻轻放入培养箱内。
2小时内不要碰触。
二、常用染料选择：1、细胞核染料：DAPI（Ex/Em：358nm/461nm）、hoechst33342（Ex/Em：350nm/461nm）、DRAQ5 （Ex/Em：647nm/681nm）。
2、细胞骨架：Actin一般选用 phalloidin 标记FITC、或AlexaFluo系列荧光基团，tubulin 用抗体标记。
细胞培养技术基本操作步骤
细胞培养
（1）超净台准备：穿好隔离衣，拖鞋后，进入细胞培养室。
带好手套，紫外线消毒30分钟，点
燃酒精灯，烘烤仪器架，将要使用的滴管烘烤大
约四分之三的长度，并配好胶头，放在仪器架上
备用。
（2）细胞复苏：将准备复苏的细胞，快速送入细胞室后，放入37℃的温箱，大约1分钟左右，
至冻存管解冻大约五分之四时取出，进入超净台，开始复苏。
将冻存管中的液体用一号吸管取出放
入准备好的离心管中，放入离心机中离心5分钟
／1000R，弃去上清，用2号吸管放入适量的培
养液用一号吸管充分吹打后分装在培养瓶中，并
用2号吸管注入适量培养基，于细胞培养箱中培
养（松开瓶口）。
（3）细胞换液：用1号吸管吸取液体，紧贴细胞生长的壁吸液，用2号吸管吸取新的培养液。
（4）细胞传代：用1号吸管弃去废液，并用PBS 液冲洗两遍，用枪头取胰酶约800ul入培养瓶,
震荡一分钟左右,当有片状脱离时,用培养液终止
反应,取出离心,后弃去上液,加入新的培养液吹
打充分后,分装.
（5）细胞冻存:如细胞传代,将细胞分离后,加入冻存液,分装到冻存管中(1.5ml),放入冻存室.。
细胞培养室标准操作规程
细胞培养室标准操作规程一、器皿清洗1. 玻璃器皿清水浸泡——洗衣粉刷洗——自来水冲洗，烘干——浸酸过夜——自来水冲洗10次以上——蒸馏水浸泡，荡洗——三蒸水冲洗2次，烘干——包装，灭菌，备用。
2. 胶塞﹑塑料制品清水浸泡——洗洁精超声15分钟——清水超声15分钟——自来水冲洗，烘干——2%NaOH浸泡30分钟——自来水冲洗，烘干——1%HCl浸泡30分钟——自来水冲洗——蒸馏水浸泡，荡洗——三蒸水冲洗2次，烘干——包装，灭菌，备用。
3. 培养板*用后立即浸入水中——洗洁精超声20分钟——清水超声20分钟——自来水冲洗，烘干——浸酸6小时——自来水冲洗10次以上——蒸馏水浸泡，荡洗——三蒸水冲洗2次，烘干——浸入70%乙醇（盖盖以防乙醇挥发）消毒。
临用前取出，置超净台中，紫外照射过夜。
* 注意: 1．不宜用毛刷刷洗，如残留有附着物，可用脱脂棉蘸水拭掉，流水冲干净。
2．浸酸时间不要超过12小时,以防板被腐蚀。
3. 烘干温度不要太高。
二、灭菌1. 使用前，先检查主体内水位是否超过电热管。
2. 在加热开始时，放气阀垂直，使空气随加热由桶内逸出。
待有较急的蒸汽喷出时，即将放气阀拨回水平位置。
3. 当压力到达所需的范围时，调节调压器使压力稳定，并开始计时。
瓶皿 121-126℃ 15min器械 121-126℃ 10min橡胶 121℃ 15min溶液 121-126℃ 20-40min4. 灭菌完，要迅速使之干燥者，将灭菌器内的蒸汽通过放气阀迅速排出。
等压力为0时，再稍等1-2分钟，然后将盖打开，继续加热10-15分钟，使物品上残留的水蒸汽得到蒸发，随后关掉。
5. 灭菌液体时，应将液体装在玻璃瓶中，以不超过2/3体积为好，瓶口用胶塞封好，并用绳子把牛皮纸扎在瓶颈上，最后在上面扎根针，使瓶内的空气能自然泄出。
灭菌完，先关电源，等压力自然降为0时，再稍等几分钟，打开放气阀，排出余气后，才能将盖开启，开盖的同时迅速拔掉针头。
1.细胞基本操作
一、细胞冻存（慢冻）1.细胞在培养基中，培养至对数生长期2.预先配置好冻存液：含20%血清培养基+10%DMSO+70%培养基（避免临时配置产热伤害细胞）3.取对数生长期细胞，吸弃培养液4.PBS润洗1-2次（放置培养基降低胰酶的消化能力）5.消化1-2min，至细胞不再贴壁，轻轻敲击培养皿，震落细胞6.加入适量冻存液，终止消化7.枪头吹打细胞悬液（106-5×106）至均匀8.加入1ml细胞于冻存管中，标记：细胞名称/冷冻时间/操作者等信息9.程序性降温：4℃10min，-20℃30min；-80℃16-18h, 液氮槽中长期存储二、细胞复苏（快融）1．提前准备好水浴锅，水浴加热2．液氮中取出冷冻管，迅速投入至37-38℃水浴锅，使其在1min快速融化3．温育PBS/血清/抗生素等，37℃10-20min4．配制10%胎牛血清(1ml)+90%DMEM培养基（9ml）于培养皿中进行5．打开冻存管，小心倾倒至培养皿内，呈倒8字摇晃至均匀6．倒置显微镜观察细胞生长状况，细胞未贴壁。
7．6-8h后，细胞贴壁，更换细胞培养基（去除冻存时DMSO）另一种方法：复融后，加入10倍体积的培养液，1200r/min，4min离心去除DMSO，再加入培养基，培养细胞三、细胞传代1.37℃温育DMEM/血清/PBS等，10-20min2.倒置显微镜观察细胞状态（是否长满？）3.真空泵吸弃培养基，加入1mlPBS润洗细胞（清除DMEM，否则浪费胰酶）4.加入1ml胰酶消化2-3min,CO2培养箱37℃5.加入培养基终止消化，移液枪吹打至均匀（轻柔，否则细胞容易损伤）6.按照需要传代（2-4皿），控制细胞密度不要太大，否则很容易又长满了。
多余的可以真空泵吸弃7.培养箱培养。
一般2天换液四、细胞换液1、观察细胞状态，培养基颜色。
吸弃原有培养基2. 加入9mlDMEM+1ml胎牛血清（后加血清，转圈圈式轻柔加入，均匀不伤害细胞）3.呈倒8字，混匀培养基即可五、细胞铺板（简易版）1.吸弃培养基2.PBS清洗2-3次，胰酶消化2-3min，DMEM，终止消化3.收集消化后的细胞，加入1ml胰酶和4mlDMEM至离心管内。
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细胞培养基本操作无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以75 % 酒精擦拭无菌操作台面。
操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以75 % 酒精擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。
操作过程中，应避免引起气溶胶之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
实验用品1.细胞培养实验用品均为无菌，分玻璃容器和塑料无菌制品。
2.种类：培养瓶，培养皿，多孔培养板，巴氏管，离心管（15ml,50ml）,玻璃血清瓶等。
3.清洗和消毒3.1．玻璃器皿：A.浸泡：新玻璃器皿，自来水初步清洗；使用后玻璃器皿立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸黏附于玻璃上导致难以清洗。
浸泡使器皿完全浸入水中，使水进入器皿内而无气泡空隙遗留。
B.刷洗：浸泡后用毛刷加洗涤剂洗涤，刷洗后要将洗涤剂彻底冲洗干净，晾干。
C.清洁液浸泡：清洁液（重铬酸钾+浓硫酸+蒸馏水配成的次强酸）浸泡，可将玻璃器皿残留未刷干净微量杂质完全清除，浸泡时，应使器皿内部完全充满清洁液，不留气泡，一般浸泡过夜，或起码为6H以上。
D.冲洗：浸泡后器皿流水彻底清洗，每个器皿用流水灌满，倒掉，重复十次以上，直到清洁液完全洗干净，用蒸馏水漂洗2—3次，最后三蒸水漂洗一次，烘干待用。
3.2．塑料器皿：用后立即清水清洗，晾干，2%NaOH浸泡过夜，自来水清洗，5%盐酸浸泡30min，流水彻底冲洗，蒸馏水漂洗（浸泡30min）。
但塑料用品不宜反复使用次数太多。
3.3.胶塞、盖子等杂物：新的胶塞、盖子等杂物因带有活石粉，自来水洗净后，常规清洗；使用后的浸泡于清水中洗涤剂刷洗；晾干备用。
清洗过的器皿包装后，高压蒸汽灭菌121℃，20min，烤箱烘干。
有效期1~2周。
培养基1. 液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。
2. 液体培养基(加血清) 存放期为六个月，期间glutamine 可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
3. 粉末培养基配制(以1 升为例)：3.1. 细胞培养基通常须添加10 % 血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为7.2 - 7.4。
NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成pH 之误差，或局部过碱。
因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。
3.2. 材料：3.2.1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)3.2.2. 粉末培养基3.2.3. NaHCO3 (Sigma S-4019)3.2.4. 电磁搅拌器3.2.5. 无菌血清瓶3.2.6. 0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜3.2.7. pH meter3.2.8. 真空泵3.2.9. CO2 气体3.3. 步骤：3.3.1. 取粉末培养基溶于700 ml milli-Q 水中，搅拌使其溶解。
3.3.2. 称取适量之NaHCO3 粉末(数量依培养基种类而异，表一)溶于200mlmilli-Q 水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2 气体至饱和，约3-5 分钟。
3.3.3. 将溶解且含饱和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液体培养基中混合。
混后溶液之pH 应为7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。
若为太碱，可再通入CO2 气体调整pH。
培养基以真空泵通过过滤膜时，pH 会升高0.1-0.2。
3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4 ℃。
抗生素1. 细胞库之细胞培养基不加抗生素2. 寄送活细胞时，须将培养液充满整个培养瓶时，则须添加抗生素(青霉素100 units/ml+链霉素100 ug/ml)。
3. 去除细菌污染之抗生素混合配方:青霉素250 units/ml,链霉素250 ug/ml,新霉素（neomycin ）250 ug/ml, 杆菌肽（bacitracin）2.5 units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。
5. 抗生素使用种类与浓度：工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌Penicillin青霉素100 units/ml -20℃G(+) bacteriaStreptomycin链霉素100 ug/ml -20℃G(+) and G(-) bacteriaChlotetracycline金霉素50 ug/ml -20℃G(+) and G(-) bacteriaGentamicin庆大霉素50 ug/ml -20℃G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma amphotericin B两性霉素B 2.5 ug/ml -20℃yeast and molds酵母和霉菌nystatin制霉菌素50 ug/ml -20℃yeast and moldsfungizone 2.5ug/ml -20℃yeast and molds血清1. 血清必须贮存于-20 ～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。
如果一次无法用完一瓶，可将40～45 ml 分装于无菌50 ml 离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2. 一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。
若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
3. 瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50 ml 无菌离心管可分装40～45 ml。
在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。
勿直接由20 ℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。
4. 热灭活是指56 ℃, 30 分钟加热已完全解冻之血清。
加热过程中须规则摇晃均匀。
此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement) 去活化。
除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。
5. 勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。
6. 血清之沈淀物6.1. 凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin) 造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。
若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000 rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。
不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。
6.2. 显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。
有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37 ℃中欲培养此“微生物”，但在37 ℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。
一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。
收到细胞的处理方式细胞活化：1.收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，若有请立即通知。
细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保存(置于-70℃，隔夜后，移到液氮)。
2.冷冻细胞解冻程序:2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。
绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，若因实验需要，必须有所不同时，务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，方进行所需之实验。
2.2.FBS(fetal bovine serum, 胚牛血清),CS (calf serum, 小牛血清)和HS(horse serum,马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。
2.3.将培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以75%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
取出冷冻管，立即放入37°C水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，否则易发生污染。
轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化后，以75% ethanol 擦拭冷冻管外部，移入无菌操作台内。
2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10 ml 培养基加至T25 或T75 flask 中。
取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入T25 或T75 flask 内之培养基，混合均匀，放入37℃，5 % CO2 培养箱培养。
2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂DMSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。
惟对极少数因对DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除DMSO 者，则可将解冻后之细胞悬浮液放入5 - 10 ml 培养基中，离心300 xg (约1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，转移至培养瓶中，再放入37℃，5% CO2 培养箱培养。
收到T25 flask 细胞时，处理方式为：1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。
请检查flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。
2. 将原封之T25 flask 静置于37℃，5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至37℃，并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。