细胞培养基本方法.docx
细胞培养基本技术
培养细胞的观察
１．肉眼观察培养物颜色及混浊度 ２．倒置显微镜观察细胞生长状态
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。 2．半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3．贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台
面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒 时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降 低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试 管 架 等 用 75% 酒 精 擦 洗 后 置 于 台 内 同 时 紫 外 线 消 毒 。
外部引物为： Ｆ1 5′-ＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＡＴ-3′， Ｒ1 5′-ＧＴＴＣＡＴＣＧＡＣＴＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＡＧＧＣＡＴ3′； 内部引物为： Ｆ2 5′-ＧＴＴＣＴＴＴＧＡＡＡＡＣＴＧＡＡＴ-3′， Ｒ2 5′-ＧＣＡＴＣＣＡＣＣＡＡＡＡＡＣＴＣＴ-3′。
无菌试验和测定菌数用培养基
液中，然后培养指示细胞再作萤光染色。正负反应对照组亦可以接种于
indicator cell内作为对照。 待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作荧光染色。有 些细胞易有荧光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。 特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。可以侦测不 易培养之支原体， 缺点：有时仍会有荧光背景，影响判读。
有损伤作用。复苏后的细胞也要检查活力，了解冻存和
复苏的效果。
细胞培养技术的使用方法
细胞培养技术的使用方法细胞培养是生物学研究中常用的一种实验方法，广泛应用于生物医学、药物研发、基因工程等领域。
通过细胞培养，研究人员可以研究和观察细胞的生长、分化、增殖以及与外界环境的相互作用。
因此，掌握细胞培养技术的使用方法对于进行相关研究具有重要意义。
细胞培养的基本步骤如下：1. 培养基的准备：培养基是支持细胞生长的基础，不同类型的细胞需要不同成分的培养基。
常见的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，还需要添加胎牛血清或人血清、抗生素等。
培养基的配制需要严格按照实验室标准操作程序进行，确保培养基的成分和浓度准确无误。
2. 细胞的处理：细胞可以来源于人体组织、动物器官或细胞系。
在使用之前，细胞需要进行分离和处理。
常用的细胞分离方法包括胰蛋白酶消化、机械分离、酶解组织等。
处理后的细胞可以直接进行培养，也可以进行冻存以备后续使用。
3. 细胞的培养：将获得的细胞加入到预先准备好的培养基中。
根据细胞类型的不同，有时需要调整培养基中的血清和生长因子的浓度。
将培养好的细胞转移到培养皿或培养瓶中，保持适宜的湿度、温度（通常为37°C）和二氧化碳含量。
培养皿或培养瓶需要事先进行消毒处理。
4. 细胞生长和观察：培养过程中，细胞会进行增殖和生长，我们可以通过显微镜观察细胞的形态和数量的变化。
在此过程中，需要定期更换培养基以提供养分，并监测细胞的生长状态。
此外，还要注意避免细胞发生交叉污染，以保持实验的准确性。
5. 细胞传代：细胞的生长有限，当细胞达到一定密度时，需进行传代。
传代是将细胞从一种培养容器转移到新的培养容器中，以维持细胞的活性和生长能力。
传代时，需要对细胞进行分离，常用方法包括胰蛋白酶消化、机械分离等。
传代前还需要对培养容器进行彻底清洗和消毒处理，避免细胞污染。
6. 细胞冻存：细胞培养中，有时会遇到细胞数量过剩或需长期保存的情况。
此时，可以将细胞冻存以备后续使用。
冻存细胞需要用冷冻保护剂保护细胞，并在低温下长期保存。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
细胞培养方法
细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
细胞培养一般方法
细胞培养一般方法1.玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：高压蒸汽灭菌15分钟以上；2.无菌工作台先用75%酒精擦拭干净,紫外线照射30分钟；3.培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。
分装后置4℃保存；4.消化液(pH7.8)或其它加入液，应用高压蒸汽灭菌或一次性无菌滤器过滤除菌，分装成支置-20℃保存；5.进入操作时应佩带手套，然后用75%酒精擦拭，操作时注意无菌台内空间层次，手及物品不要在暴露的瓶口上方来往。
复苏1.应遵守慢冻快融的原则：先将水温锅调至37-37.5℃,取出冻存的细胞迅速放入后交细胞面浸至水面以下不断摇动至融化；2.在无菌台内将完全培养基加入15ml的离心管内，约5ml左右，然后用无菌吸管从冻存管内取出细胞，放入离心管中，离心机平衡后800rpm离心3分钟。
（目的是去除冻存液中的DMSO，减少其对细胞生长的影响）；3.离心后，弃去培养基，重新加入5ml左右培养基，轻轻吹匀后，取出放于培养皿/瓶，并根据培养皿/瓶的大小补入相应的培养基，轻轻左右上下晃动，使细胞均匀平铺于底物，然后平放于二氧化碳培养箱内培养。
传代1.贴壁细胞：对于贴壁细胞应先吸(倒)尽培养基,加入PBS洗一次，去除血清对胰酶抑制作用，加入胰酶，晃动使胰酶铺均匀置37度培养箱约1分钟,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻拍打培养皿/瓶,使细胞全部脱落,加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮,然后分置其它无菌培养皿/瓶内,加入完全培养基后继续培养或实验。
2.悬浮细胞：一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内，加入完全培养基继续培养，如要高浓度可先离心800rpm,3min后加入完全培养基，轻轻吹匀后，分置其它培养皿/瓶内加入完全培养基继续培养。
冻存1．细胞：选对数生长期细胞，收集细胞24h前换液一次。
细胞培养的基本方法
细胞培养中常用旳染色措施-活体染色
一、活体染色
体外活体染色就是在体外条件下用某种活体染料对活旳组织或细 胞进行染色，而不影响活细胞旳生命活动旳一种措施。 1、活体染料旳类别
可分为碱性和酸性活体染料两大类。 碱性：噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝），亚喷类（亮焦 油蓝、亮焦油 紫），吖嗪类（中性红、詹纳斯绿），三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利 亚蓝）。 酸性：台盼蓝、刚果红、吡咯蓝。
化，然后再加入被支原体污染旳细胞培养液中混合培养。为检测支原体 是否被消除洁净，可利用支持物培养法验证。取出支持物逐日染色、镜 检观察，直至支原体被消除洁净。
细胞培养旳污染与检测-污染排除
除了上述旳措施之外，还有诸多其他消除支原体旳措施。例如， 向受污染旳培养中加入溴尿嘧啶，因支原体旳DNA也摄取溴尿嘧啶，然后 用光照射，经过光敏效应杀死支原体。近来国外有厂家生产微孔滤膜系 统，能滤除支原体在内旳粒子，也可用于处理受污染旳培养液或血清， 但不足旳是，不能去掉附着于细胞表面旳支原体。
3、动物体内接种除菌法 此措施合用于在连续传代培养中旳肿瘤细胞和杂交瘤细胞中，
清除细菌和支原体污染旳措施。 把支原体污染旳肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借助
其免疫系统消灭支原体，待肿瘤细胞在体内生长一段时间后取出细胞再 进行培养繁殖。
细胞培养旳污染与检测-污染排除
4、巨噬细胞吞噬法 从动物腹腔采用巨噬细胞，为排除其他细胞成份，可先进行纯
为有效预防交叉污染，应该做到： 1）器具严格区别，做好标识； 2）换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及培养液瓶瓶口。 3）从别处转来旳细胞或自己建立旳细胞系都要早期留有充分旳冻存贮备。
细胞培养旳污染与检测-污染旳预防
三、污染旳预防
1、培养操作前旳准备 1）定时清洗或更换超净工作台旳空气滤网，定时检验超净工
细胞培养步骤范文
细胞培养步骤范文细胞培养是指将一定数量的细胞种子进行培养，通过提供合适的培养基和培养条件，使细胞可以不断分裂和增殖，以获得足够多的细胞用于进一步研究。
细胞培养可应用于多个领域，如生物医学研究、生物制药和生物工程等。
1. 细胞准备：选取合适的细胞株进行培养，常用的细胞株有人类胚胎肾细胞（HEK293）、肝癌细胞（HepG2）和小鼠成纤维细胞等。
细胞应该在无菌条件下进行处理，防止细胞的污染和感染。
2.培养基准备：培养基是细胞生长所需的营养物质和因子的混合物。
培养基的选择取决于所培养细胞的类型和性质。
通常，培养基主要包括基础培养液、补充物和生长因子。
3.细胞接种：将细胞种子接种到培养皿中，培养皿表面要进行预处理，以提供适宜的附着条件。
接种时需注意密度的控制，以便细胞能够在培养皿上均匀分布，并且有足够的空间进行生长和分裂。
4.细胞培养：培养皿放置在细胞培养箱中，以提供适宜的环境条件。
常规培养条件一般为37摄氏度和5％二氧化碳气氛。
定期检查细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康和良好的分裂能力。
5.细胞传代：当细胞达到一定密度时，需要进行细胞传代，以避免过度密度和减少细胞活力。
细胞传代时，将细胞从原来的培养皿中取出，用胰酶等消化酶进行细胞解聚，然后转移到新的培养皿中。
6.应用实验：经过一定时间的培养，细胞数目会不断增加，可以进行各种实验研究，如药物筛选、细胞毒性测试和基因表达分析等。
虽然细胞培养过程看似简单，但其中涉及很多细节和关键点需要注意：1.精确的操作：细胞培养需要保持无菌操作，避免细胞的污染和感染。
操作时要注意使用无菌仪器和培养用品，并将一切接触细胞的工具进行消毒处理。
2.培养基的配制：培养基的配制要根据实验需求和细胞特性进行优化。
不同细胞株对营养物质和生长因子的需求不同，所以需要根据细胞株的特性进行具体调整。
3.适宜的密度控制：细胞接种时应掌握适宜的密度，过低的密度会导致细胞生长缓慢，过高的密度会造成细胞过于密集而影响细胞的健康和生长。
第三章细胞培养的基本方法
•.
二、培养室和超净台的消毒
（一）、无菌与有菌范畴 灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，首
先应建立有菌和无菌的概念。 有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表 面都是有菌的。如植物表面、超净工作台的台面， 未处理的工具、手等。
•.
无菌的范畴：
Ø物理或化学处理的物体（工具、器皿、培养
•.
培养细胞的生长过程
• 1） 原代（初代）培养期：从机体取下组织培 养到第一次传代，此代细胞保持异质性，细胞 种类较多，接近原组织细胞种类。维持时间， 因细胞种类不同，一般1-4周。
•.
• 2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到 一定程度，即可连接传代，使其连续生长。
• 一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可 传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突 变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退 期，我们称之有限细胞系。这一转折点有 人称之危象临界点（crisis）
•.
• A. 细菌的污染及检测 取悬液培养，培养液颜色变黄，混浊。
• B. 真菌的污染及检测 可见菌丝，显微镜下可观察到链状排
列的菌珠，散在细胞周围和细胞之间生 长。
•.
• C. 支原体污染 常见而棘手，与细胞共存。借助显微
镜、电镜、DNA荧光处理法等观察。 • D. 病毒的污染及检测
•.
• E. 细胞交叉污染及检测 操作不当、共同培养导致不同种类之间发生
正确
错误
接种完一瓶用火烧用具以防止交叉污染产生
种子和分生组织：培养时通常将其贴放在培养基表 面，而不是插到培养基内部，以免供氧不足
正确
错误
接种茎段：注意形态学下端插入培养基内，而形 态学上端露于空气中
细胞培养方法范文
细胞培养方法范文细胞培养是一种将体外的细胞从一个生物体中取出并放入培养皿或培养室中，提供适宜的环境因素（如温度、湿度、营养物质）使其继续生长和分裂的技术。
细胞培养是生物学研究和生物技术应用中必不可少的一项技术。
下面将介绍常用的细胞培养方法。
1.动物细胞培养方法（1）悬浮培养：适用于悬浮生长的细胞如淋巴细胞、白血病细胞等。
主要是将细胞悬浮在培养基中，通过培养皿的旋转或培养室的搅拌来提供充足的营养物质及氧气。
（2）附着培养：适用于贴壁生长的细胞如肝细胞、肾细胞等。
将细胞悬浮在含有酶的消化液中，提取细胞后将其直接培养在具有黏附性的培养皿中，培养基中含有足够的营养物质以支持细胞正常的生长和分裂。
（3）无血清培养：通过去除培养基中的胎牛血清，使用一些替代品如人血清蛋白、胎儿牛血清等来提供细胞所需的营养物质，减少胎牛血清中可能存在的病毒、细菌等污染物质。
2.植物细胞培养方法（1）培养基选择：对于不同的植物细胞种类，需要选择不同的培养基。
通常的基础培养基有MS培养基、B5培养基等，根据不同的需要可以添加不同的激素和抗生素来调整培养基的组成。
（2）组织培养：将植物的种子、叶片、茎尖、根尖等组织切碎，放入含有培养基的培养皿中，使组织生长、分化和再生。
（3）离子膜培养：将植物细胞分散在带正/负电离子的离子交换膜上，通过电场刺激细胞的分裂和生长，用于增加植物细胞产量和代谢产物。
3.细菌培养方法（1）液体培养：将细菌接种到含有足够营养物质的培养基中，适当控制培养基的pH值、温度和氧气供应，通过转动培养瓶或转座培养容器等方式提供足够的氧气和营养物质。
（2）平板培养：将细菌接种到含有琼脂的平板上，使细菌在琼脂上生长和分裂形成菌落，通过菌落的形态和数量来判断细菌的菌种和数量。
（3）巢式培养：将小量的细菌接种到含有琼脂的小巢中，瞬间加热使琼脂溶化后迅速冷却凝固，细菌会在巢内扩展形成单个菌落，便于鉴定和分离。
4.真菌培养方法（1）固体培养：将真菌菌种接种到含有琼脂的培养瓶中，使其在琼脂上生长和分裂形成菌落。
【精选】细胞培养的基本方法
橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头
细胞培养的条件
（1）适宜的温度和PH 37℃，pH7.2~7.4。
培养瓶底可摆布20~30块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞，
置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少
许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞的复苏
悬浮细胞和贴壁细胞的复苏方法一样，区别在于复苏后死细胞的清除方法。 复苏流程：（1）取一支离心管，加入3ml的新鲜培养基备用。
（2）取出冻存的细胞，于37℃的温水中，1min之内迅速融化。 （3）迅速将解冻后的细胞加入预先准备好的离心管中，1000转/分钟，离
心1分钟。 （4）弃上清，加入新鲜培养基重悬细胞。 （5）接种到培养皿（瓶）内，补足培养基，放入温箱培养。
二、(科1) 学新研药究筛2:选:如药效研究,中药有效成分筛选等.
(2) 疫苗研究与开发:如肝炎疫苗, 艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等. (3) 基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发 (4) 单克隆抗体制备
细胞培养主要的设施器材
设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。 二、塑料器材
细胞培养基本技术和操作方法
细胞培养基本技术实验概要无菌操作基本技术1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。
实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。
2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。
实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。
实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。
3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。
勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。
容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。
对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少Class II)。
操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心毒性药品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。
5. 定期检测下列项目：a: CO2 钢瓶之CO2 压力b: CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。
c: 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。
6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。
实验原理主要试剂培养基1. 液体培养基贮存于4 oC 冰箱，避免光照，实验进行前放在37 oC 水槽中温热。
常规细胞培养方法
常规细胞培养方法（原代培养和传代培养）初代培养原理将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。
仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：动物组织块试剂：1640培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank′s液，碘酒初代消化培养法1.准备：取各种已消毒的培养用品置于净化台面，紫外线消毒20分钟。
开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2.布局：点燃酒精灯，安装吸管帽。
3.处理组织：把组织块置于烧杯中，用Hanks液漂洗2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。
4.剪切：用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块，以便于消化。
加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞。
5.消化：或用恒温水浴，或置于37℃温箱消化均可，消化中每隔20分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好。
消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。
6.分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。
低速（500~1000转/分）离心消化液5分钟，吸出上清，加入适量含有血清的培养液。
7.计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中。
对大多数细胞来说，pH要求在7.2~7.4范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用NaHCO3调整。
8.培养：置于36.5℃温箱培养，如用CO2温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞。
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1•操作台基本要求:S ii. ⅛⅛*SΛl-≤手的工作A通冈禹基也布局α *!!崗左芋£丄fTAβ^WLJt禺整丄fl-⅛⅛' 上豹品矿播班苗2•随着传代次数的增加，连续培养细胞系遗传物质不稳定，不得将细胞存放于-20C 或-80C冰柜中，因为细胞存在次低温条件下活力迅速降低。
3.细胞污染：(1)细菌污染A S佛3相差&Λ凰示旳螯主长的丄S ⅛⅛tfΛ⅛t i li⅞⅛- 1EfeS¾⅛T可见Iii垦壬庭司的区14存査■ ⅛⅛S⅛⅛⅛⅛⅛^ffi⅛1但是⅛<⅛≡TSS⅛CAffiJ*贩色育框重∣⅛总一步施大后可快显示出吿个址≠÷aw. Ii垒空魁兰第为聊秋” ⅛2∣ιmtt.直轻国口μru SA申黑鱼方滙的巷边怅度国为t∞μ∏ι.(2)酵母污染阴站.M栢差圉煙昱示J½壁增齐的23」迄無蛍醉母污果・陌集的H*⅞⅛ffl胞呈髓兀电貶也⅛⅞!⅛⅛⅛生屮转Ke e JH* I(3)霉困污染初期PH值维持稳定，污染严重后PH值迅速升高，导致培养基浑浊。
(4)病毒污染一般不会对与其宿主物种不同的细胞培养物造成不良影响，通过电子显微镜检查、一组抗体的免疫染色，ELISA实验或者采用适当病毒引物的PCR技术可以检测出细胞为病毒污染。
(5)支原体污染唯一检测支原体污染的方法是采用荧光染色、ELISE PCR免疫染色、放射自显影4.抗生素只能作为对付污染的最后手段而且只能短期使用，并应尽快撤出5 •适合贴壁的细胞和悬浮的细胞6.基础培无血清培养基7.PH值：大多数正常哺乳动物细胞系PH为7.4; 成纤维细胞系适合轻度偏碱（pH747∙7）Sf9和sf21等昆虫细胞系最适合在PH值为6.2的环境中生长8.温度：大多数人和哺乳动物细胞系在36C至37C最佳昆虫细胞在27C为最佳禽类细胞在38.5C最佳冷血动物（15C -26C）9.动物细胞形态划分：成纤维细胞，贴附生长上皮样细胞呈多角形，贴附淋巴母细胞样细胞呈球形，不贴附特殊形态：I型有长突触U型没有轴突10.细胞增长模式天数 倒芥宰庖比⅛ι⅞⅛.长議式稱.Jt 半时數囲显示了毛部戛厦与皓齐IrrNKlf 厂up -：秆范両坝通臂质斡耗 ⅛⅛⅛tf⅛m⅛* ⅛S⅛⅛ΦJ63E→⅛K⅛⅛½⅛ff≡, ftHfr⅜∣aft⅛¾≡tt.处于楚曲养网.⅛⅛a⅛κ 旬也花的农査.延粛踊赶肓悬对am⅛nfr⅛iH⅛⅛⅛⅛f⅛a.溝継生長JaIHi 中的营养靠.⅛sf 有生壬培那臺 ⅛⅛ft^ （Sp ： -⅛⅝⅛⅛⅛3^⅛fi⅛或若鋼熬已占拥所有町用基駅时一 ⅛⅛E⅛AmLΛ^ T⅛*）τ却t ⅛J⅛SAX⅛t!Lfi^ Λ⅛Slt*11•何时传代？哺乳动物：生长的PH 值通常表示乳酸储积，且有毒性，当 PH 迅速降低（） 0.1-0.2PH 单位），同时细胞浓度增大，则应对细胞进行传代。
昆虫细胞PH 值会上升但不超过6.412. 贴壁细胞的解离方注F⅜第4S⅛⅛S^*ffi, ⅛≠J⅛. FilRn≡*站■艇植.⅞tt ⅝÷fi 细龍 ≡KH 对蛋白髓軾般眄同嵐乘.可⅛J⅞*5 -⅛ffi⅛曠蛋口斷丫戢理■帝爭反乐能、己好王逋年慝皓吋旳 细.到.特別最Mit 鈿Jl⅛ifcκ隹耀礎完蟹、r⅛⅛⅛β⅛≡⅛⅛⅛ 从堵神叩五《1説蒲下朿而不辭 TFyUE' 解■箱sa⅛4⅛≈⅛: a⅛w⅛κsa K 豊葬倩需辛利m 譚哼试輒的 ÷β⅛ h Io J8 10 ------- M I lBV 0 2 4 613.贴壁细胞的传代•的Ii齐AL•⅛⅛^^⅛ff≡. ⅛⅛⅛ ire*■'攻隹无二1百∙ml. ΛH L・3ΓC S?r?a. F^-≡,⅛⅛⅛^SΛ5⅝^>fi⅛S e k・巫曲帘靜懣，聖茹巴毎叽科36恫艺第书5｛呼勺，幵音弟，铸和離∏■ Sw叭Affifl;集SE日龍或TryPLE~txp<ess. ^⅛fl⅛U・用于≡Sfc⅛S⅛ftrf⅛的泣叩祷亂ff⅛∏: C(MJr1««-自站⅛fiBħi+β⅛r ⅛KKftI- - ?n.J:H+ S . ⅛E≠ CaUIter Cajr∣ter∙ (BeCIiman Cojfter^胞传代董程所有与创施播融的若iff輒此哥均应为无闇較芒“建狗采阎正谓的元前抒木.幵目齐尿耳JS冈蝎内H作・K AUB弄春器中眠出用过的⅛⅛⅛≠⅛F盂哥L堆不含號相携的丰墨艮博崔彳渎基堪√也伯⊂rτ√博算喪面齐壅秦2mL⅛J两）■ ⅛⅛j⅛⅛tlfe≡⅛^κs⅛⅛-ιι⅛轻加入冲⅛⅛. ⅛ιem⅛i≡s. m⅛ι⅛⅛n⅛⅛;V・⅛: niftn A p]⅛⅛∏JffifJl⅛.⅜ ⅝mju的少■血:Ir ⅛w-1. ⅛U⅛*H≠≠0⅛⅛4=⅛S^⅞^.*÷[5IiS苒h-中H入预魁料JB禹拒（洌埔：世盍日KI並下界JlEU: Zf⅛≡H足且理芒主驰屈（⅛ 10m<M-JOSrnL Ji⅛⅛⅛S⅛*.c乩将⅛s÷⅛ffi⅛圭品T弼匸鵲王舟郸。
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