细胞培养的基本方法
第二节细胞培养方法及应用实例
配比
分包
疫苗产品
①原始种子——基因重组病毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细
胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于
亲代的可遗传的子代，称为基因重组。
基因重组病毒有“活病毒基因重组”、“灭活
病毒基因重组”及“死活病毒基因重组”。重组病
毒株原始种子属于死活病毒间的重组。
世卫组织提供的6支甲 型H1N1流感原始毒株
⑷包埋法 包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞
不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。 包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的
活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微 胶囊型两种。
二、植物细胞培养方法
常见的植物组织细胞培养有愈伤组织培养、原生质体培养、花粉培养
一、动物细胞培养方法
根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培 养及固定化培养等三种方法。
1.贴壁培养
所谓贴壁培养是指细胞贴附在 一定的固相表面（如：培养皿、培 养瓶等）进行的培养。 ⑴生长特性
贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴 壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后 就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。
HGPRT 骨髓瘤细胞
使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞 二者合二为一，得到杂种的骨髓 瘤细胞。这种杂种细胞继承两种
融合
(HAT)培养基
亲代细胞的特性，既具有 B淋巴 细胞合成专一抗体的特性，又有
由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的 旋涡。
2.贴壁培养反应器——中空纤维反应器
常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反 应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝 状反应器等类型。
细胞工程--C3 细胞培养的基本方法
无菌操作技术
5. 实验中的操作要求：进行培养时，动作要准备敏捷， 但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用 受触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取 备用品更换。为拿取方便，工作台面上的用品要有合理 的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手 用品在左侧，酒精灯置于中央。工作由始至终要保持一 定的顺序，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露于 空气中。同时，培养液在未用前，不要过早开瓶；打开 的瓶口要顺风斜放在支架上或远处；试剂用过之后如不 在重复使用，应立即封闭瓶口，因直立可增加落菌机会。
定期检查下列项目:
• CO2钢瓶内的CO2压力; • CO2培养箱内的CO2浓度,温度,及水盘是否有污
染;
• 无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外 灯管及HEPA过滤器滤膜,预滤网（300小时/预 滤网,3000小时/HEPA).
相差显微镜观察 培养细胞的观察
相差显微镜的工作原理及应用
无菌操作技术
3. 洗手和着装：在利用超净工作台时，因整个前臂 要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操 作前用肥皂洗手，再用75%酒精擦拭。
洗手和着装
作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套 后才进行实验.
对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心, 并选择适当等级的无菌操作台(至少两级).
只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细 胞生长变化的实验中应用。
在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长 曲线的测定是最为基本的指标。
细胞分裂指数
细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的 百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般要计 算和观察1000个细胞中的细胞分裂相数。
细胞贴壁率
无菌培养操作
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法可以包括以下步骤：
1. 细胞培养：将待实验的细胞株从冷冻保存中取出，放入无菌培养皿内，并加入适宜的培养基。
设置适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等。
定期观察细胞生长情况并进行细胞的传代。
2. 细胞传代：当细胞培养达到一定密度时，将细胞通过酶消化方法从培养皿中取出，然后转移到新的培养皿中重新培养。
该方法可以获得更多的细胞数量，以维持细胞培养的供应。
3. 细胞分离：对于某些实验需要用到单独的细胞的情况，可以采用细胞分离的方法，如通过胰蛋白酶消化细胞外基质、抑制细胞黏附等，使细胞单个分散。
4. 细胞检测：使用显微镜观察细胞的形态变化，细胞生长情况和细胞颜色等。
也可以利用荧光显微镜观察细胞内的特定荧光标记物，如细胞核染色剂、蛋白质荧光探针等。
5. 细胞培养基交换：定期更换细胞培养基，以保持细胞的生长状态和代谢活性。
6. 细胞处理：根据实验需要，在培养皿中添加不同浓度或种类的化合物，如药物、抗生素等，对细胞进行处理。
7. 细胞采集：根据实验需求，利用细胞刮刀、吸球等方法将细胞从培养皿中收集起来。
8. 细胞冻存：将细胞保存在液氮中，以便长时间保存和后续使用。
9. 细胞裂解：对于某些实验需要提取细胞内的特定分子或蛋白质，可以使用细胞裂解液将细胞内组分释放出来。
10. 细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪等方法，对细胞数量进行计数和测定。
请注意，具体细胞实验的操作方法可能因不同的实验目的和细胞类型而有所差异，上述仅为一般的基本操作方法。
在进行细胞实验时，应严格遵守相关实验室规范和安全操作指南。
细胞培养的基本方法
由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却 不被排出，因而细胞显示一定颜色。而活细胞由于能排出进入细胞的 染料，故不易着色。 1、台盼蓝排除检测法
细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法
2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法 EB和PI均为荧光染料，可与DNA特异性结合。
细胞培养的污染与检测
体外活体染色一般用碱性活体染料，酸性活体染料只用于体内活体染色。
细胞培养中常用的染色方法-活体染色
2、活体染色方法 （1）台盼蓝染色 1）用Hank’s液（最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于洗涤细胞和组 织的，也是合成培养基的基础液。如果含有钙镁离子的话，当用消化液消化细 胞时，钙镁离子会破坏消化液的活力。）配制0.1%台盼蓝溶液； 2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培养的贴壁细胞； 3）加入适量Hank’s液制成细胞悬液； 4）每毫升细胞悬液加入10μl0.1%台盼蓝溶液，混匀； 5）用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，并在显微镜下计数； 6）计数1000个细胞中的活细胞（折光性强且不着色）和死细胞（染上蓝色） 数目。
培养细胞的观察
二、细胞计数法
1、细胞计数法是利用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数 目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。 2、细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。只 有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。
培养细胞的观察
3、细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百 分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般取1000个细胞 中的细胞分裂相数。 4、细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长 细胞，主要反映细胞的生存能力（只有活细胞才贴壁）和 部分底物材料的生物相容性。
细胞培养基本方法从体内到体外优秀课件
导致酶的变性而失活
破坏细胞膜的类脂质
高热
细胞核分裂异常
破坏纺锤体
细胞浆外层的钙释放
代谢停止 细胞膜渗透性变化 多极分裂出现 停止在中期 凝固酶使细胞凝固
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
（osmotic pressure of humor） ４、细胞之间的相互联系
２、氧和酸碱度（oxygen and power of hydrogen）
氧 是细胞生存必不可少的条件之一。尽管一些细胞如骨
（一）体内细胞生存的营养条件
１、水（water） ２、无机盐（inorganic salt） ３、葡萄糖（glucose） ４、维生素（vitamin） ５、氨基酸（amino acid）
（二）体内细胞生存的其它条件
１、温度（temperature） ２、氧和酸碱度
（oxygen and power of hydrogen） ３、体液渗透压
骼肌细胞、红细胞可通过糖酵解而获得能量，但大多数细 胞缺氧不能生存。
酸碱度 酸度和碱度的度量采用pH表示， pH即氢离子浓度
的负对数值。 各种组织细胞的正常功能及一切生物化学反应，都是在适
当的和稳定的氢离子浓度下进行的。大多数有机体的细胞所耐 受的pH范围为6.0~8.0。人类血液的pH值一般维持在7.36~7.44。
这些现象就是细胞之间相互沟通信息的表现。
（三）体外生长大环境
１、体外培养实验室 ２、体外培养实验室的设备和器具
１、体外培养实验室
细胞培养的基本步骤
一．发展概况组织培养(Tissue culture)是在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下。
使从体内取出的组织生存、生长繁殖和传代，并维持原有的结构和功能特性。
广义的组织培养与体外培养同义。
体外培养(Invitro)包括所有结构层次的培养，即：组织培养、细胞培养和器官培养。
所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。
组织培养的发展史已有近百年，最初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则上，用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块，对细胞进行形态和功能的观察。
通过许多学者大的改进和革新，培养基由天然动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清。
现在全世界贮存的细胞约有万种以上。
组织培养不仅是细胞生物学必需的技术，也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法。
二．基本原理和方法体外培养细胞的生存条件：(一)营养。
体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。
目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。
目前主要使用血清，以牛血清为主。
血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。
不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。
不同血清对细胞作用不同。
以小牛血清最好，成年牛和马血清次之。
合成培养基中不加血清也能维持细胞生存，但不能很好生长，加入5%的血清，对大多数细胞来说，能维持细胞不死和缓慢生长，要使细胞正常生长，一般需加10～15%的小牛血清。
每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每5分钟摇一次。
10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。
CELL-基本培养方法
（二）双盖玻片悬滴培养法
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双盖玻片图解： 1、载体盖玻片 2、带培养物盖玻片
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与单盖玻片不同之处：
1、载体盖玻片加一滴消毒纯水贴到 带有组织块的另一面。
2、再培养时：直接取下带培养物的 盖玻片漂洗，换一张新的载体盖玻片 ,可减少污染。
细胞培养操作前及操作中应注意事项
无菌操作贯穿细胞培养的始终
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一、培养操作前注意
1.培养用物品的灭菌消毒（写出物品清单）。 2.操作台消毒（各物品布局合理进行紫外线
消毒30分钟）。 3.洗手和着装（原则上与外科手术相同）。 4.火焰消毒（酒精灯使用、金属器械、吸过
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四.灌注小室培养法 优点 1.连续观察活细胞的动态变化 2.研究理化性质对培养细胞的
影响和作用 3.活细胞的反应.
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不锈钢培养小室图 A 中央切面图 B侧面图 (mm)
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灌注小室及灌注系统示意图 A.排液瓶 B.受液瓶 C.不锈 钢灌注小室 D.扁锥型小孔道 E、F、J .2号注射针头 G 、H.塑料导管 I玻璃导管 K、L.14号注射针头(塞以棉花)
弱的细胞在接种后放置于CO2 培养箱中培养3-5 小时，使细胞黏附牢靠后再补加充足的营养液， 继续培养） 5、每隔2-3天换液，换液时先将旧的培养液吸出， 加入平衡盐溶液洗涤，吸出平衡盐溶液，再加入 新的培养液。盖上盖子继续培养。
细胞培养基本操作
细胞培养基本操作细胞复苏是将休眠的细胞重新活化，使之重新生长，进入细胞周期，进而分裂产生子细胞的过程。
细胞复苏后，可进入细胞周期，重新获得细胞类型特异的生物学功能。
一、实验前准备实验开始前，水浴箱调节至36度恒温。
取细胞完全培养基，放于水浴箱中预热。
消毒双手和超净台。
取约1ml 细胞完全培养基放于15ml 离心管中。
水浴箱调节至40度恒温，由液氮中取出冻存的细胞，迅速将冻存管投入到已经预热到40度的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化，注意管口处高于水面，以免进入导致污染。
整个解冻过程最好在1分钟以内，以防融化过程中产生大量冰晶损伤细胞，约1min后冻存管内液体完全溶解，用酒精喷拭冻存管的外壁，立即拿入超净台内。
注：解冻到0度时（即冻存管里还有最后一点冰）立刻转移到含培养基的离心管中。
然后用5ml的热培养基以0.5ml的加入量逐步将细胞内的DMSO渗透出来，之后补全生于的培养基到细胞瓶中。
二、制备细胞悬液吸取细胞冻存液，置于已放入细胞完全培养基的离心管中，吸取1ml培养液加入冻存管，将剩余细胞全部吸入离心管中。
上下吹打5次，使冻存液与完全培养基充分混匀，尽量减少冻存液中DMSO 的浓度，减轻细胞损伤。
离心：1000rpm，室温离心3min。
注：细胞复苏后最好等几分钟再离心，因为冻存前加了胰酶消化，对细胞造成一定损伤，复苏后立即离心对细胞造成损伤较大。
三、细胞培养离心后，倒掉上清液，缓慢操作，不要倒掉底部的细胞沉淀。
向离心管内的细胞沉淀加入1ml 细胞完全培养基，反复吹打制成细胞悬液。
培养瓶内加入4ml 完全培养基，细胞悬液加入培养瓶内，左右前后轻轻摇动培养瓶，把细胞摇均匀，将培养瓶放入37℃，5％CO2 的培养箱中培养。
24-48 小时后换液或传代继续培养，换液传代的时间由细胞情况而定。
四、注意事项1、解冻速度要快在常温下，冻存液中的DMSO 对细胞的毒副作较大，因此，必须在一到两分钟内使冻存液完全融化。
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细胞培养的污染与检测-污染途径
4、血清 有的市售血清制备水平低、检测不严，常被支原体和病毒污染。
相差显微镜
相差显微镜是荷兰科学家Zernike于1935年发明的， 用于观察未染色标本的显微镜。活细胞和未染色的 生物标本，因细胞各部细微结构的折射率和厚度的 不同，光波通过时，波长和振幅并不发生变化，仅 相位发生变化（x相位差），这种相位差人眼无法 观察。而相差显微镜通过改变这种相位差，并利用 光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差来观察活 细胞和未染色的标本。相差显微镜和普通显微镜的 区别是：用环状光阑代替可变光阑， 用带相板的 物镜代替普通物镜，并带有一个合轴用的望远镜。
二、染料排除检测法
由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，某些染料可大量进入却 不被排出，因而细胞显示一定颜色。而活细胞由于能排出进入细胞的 染料，故不易着色。 1、台盼蓝排除检测法
细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法
2、溴化乙锭和碘化丙锭排除检测法 EB和PI均为荧光染料，可与DNA特异性结合。
细胞培养的污染与检测
培养细胞的观察
4、相差显微镜使用注意事项 1）当换不同倍率的物镜时，要选用一致的相板和相环，并重新调
中，否则成像效果不佳； 2）载物片或培养瓶的表面要平整、均匀、干净，标本不能太厚，
以免影响观测效果； 3）标本要在有水的环境中（如培养瓶的培养液、水封片等）成像
效果才明显；4）光路最好加单色（如黄绿色）滤光片以提高相差显微镜 的分辨率。
细胞培养的基本方法
目录
A 培养细胞的观察 细胞培养中常用的染色方法 B
C 细胞培养的污染和检测
培养细胞的观察
无论是研究体外细胞的增殖生长状态还是生物学性状， 都需要对其进行观察和检测，其内容涉及形态生物学、 细胞生物学、遗传学、生理生化、分子生物学等多学科 的技术手段。这里主要介绍观察检测体外培养物最常用 的技术方法。
细胞培养中常用的染色方法-活体染色
细胞培养中常用的染色方法-活体染色
（2）吖啶橙荧光染色法 吖啶橙用于直接染色观察活细胞或固定染色观察细
胞。与DNA结合呈亮绿色，与RNA结合呈橘红色至火红色。
细胞培养中常用的染色方法-活体染色 吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色
细胞培养中常用的染色方法-染料排除检测法
在细胞培养中，凡是与培养无关的杂质的混入培养系统称为污染。 对于组织细胞培养工作来说，污染是时常存在的，因此要努力避免 污染的发生。污染一般包括微生物、化学物、细胞等，其中微生物
污染较多。以下着重介绍微生物的污染、预防与检测。
细胞培养的污染与检测-污染途径
一、污染途径
1、空气 空气是微生物及粉尘颗粒传播的最主要途径。 2、器材 各种培养皿及器械消毒不彻底和洗刷不干净导致污染。 3、操作 无菌操作观念不强、实验操作马虎、动作不准确、使用污染的器具或密封不 严等，都可能造成污染。同时培养两种以上细胞，操作不规范，交叉使用吸 管或者营养液瓶等会导致细胞交叉感染。
ห้องสมุดไป่ตู้
培养细胞的观察
一、相差显微镜观察：
能增强结构之间的反差
1、主要装置 （1）环装光栅
不同倍数的相差物镜要用相应的环状光 阑
（2）相板
相差板上上装有吸收膜及推迟相位的相 位膜
（3）中心望远镜
辅助望远镜
培养细胞的观察
2、观察活细胞的方法 将相差装置与倒置光装置结
合起来而制造的倒置相差显微镜广泛 用于观察生长在瓶皿底面的细胞。
细胞培养中常用的染色方法-活体染色
一、活体染色
体外活体染色就是在体外条件下用某种活体染料对活的组织或细 胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。 1、活体染料的类别
可分为碱性和酸性活体染料两大类。 碱性：噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胶蓝），亚喷类（亮焦 油蓝、亮焦油 紫），吖嗪类（中性红、詹纳斯绿），三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利 亚蓝）。 酸性：台盼蓝、刚果红、吡咯蓝。
培养细胞的观察
5、细胞周期 这里的细胞周期仅指一个细胞的分裂生长周期
时间，而不是指细胞群体倍增时间。可利用培养细 胞来研究细胞动力学、DNA合成代谢和有丝分裂。 细胞周期的时间测定有两种方法。
（1）同位素标记测定法 （2）流式细胞仪测定法 6、MTT(二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）比色法测定 细胞活力。
体外活体染色一般用碱性活体染料，酸性活体染料只用于体内活体染色。
细胞培养中常用的染色方法-活体染色
2、活体染色方法 （1）台盼蓝染色 1）用Hank’s液（最常用的无机盐溶液和平衡盐溶液，主要用于洗涤细胞和组 织的，也是合成培养基的基础液。如果含有钙镁离子的话，当用消化液消化细 胞时，钙镁离子会破坏消化液的活力。）配制0.1%台盼蓝溶液； 2）用0.5%的胰蛋白酶：0.2%EDTA=1:1混合液消化培养的贴壁细胞； 3）加入适量Hank’s液制成细胞悬液； 4）每毫升细胞悬液加入10μl0.1%台盼蓝溶液，混匀； 5）用毛细吸管吸少许混合液置细胞计数板，并在显微镜下计数； 6）计数1000个细胞中的活细胞（折光性强且不着色）和死细胞（染上蓝色） 数目。
培养细胞的观察
二、细胞计数法
1、细胞计数法是利用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数 目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。 2、细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。只 有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。
培养细胞的观察
3、细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百 分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。一般取1000个细胞 中的细胞分裂相数。 4、细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长 细胞，主要反映细胞的生存能力（只有活细胞才贴壁）和 部分底物材料的生物相容性。
培养细胞的观察
3、相差物镜的选择与使用 正（暗,即标本比周围环境暗）反差适用于物体细微结构和形态、计
数、运动的观察。PL（低亮，视场平坦型物镜）相差物镜常用于折射率比较 弱的物体，PLL（低低亮，长工作距离平场物镜）则适用于折射强的物体。
负（明，即标本比周围环境亮）反差适用于物体形态、计数和物体运 动的观察，物体折射率比较弱是采用NM（中负）相差物镜，折射率比较强时 采用NH（高负）相差物镜。