细胞培养的基本方法 PPT课件
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《细胞培养培训》课件
细胞培养过程中产生的废液和 废弃物不可随意处理。实验室 应该制定废物处理计划并妥善 处理、处置，确保环保。
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
细胞原代培养PPT课件
3.过滤
• 用400目不锈钢筛网过滤 • 收集滤液于离心管 4.离心 • 平衡、离心5min，1000～1500 rpm • 去上清，加PBS，混匀，离心（同上） • 重复上一步 5.接种 • 去上清，加3～5ml培养基，混匀，接种于培养瓶 • 加培养基3～5mm深，盖紧盖，观察细胞密度 6.培养
针头）
有机试剂过滤除菌，常用0.22µm • 超净工作台
紫外灯照射30min以上 • 培养室
紫外灯照射2～3h/天
操作步骤
1.取材 • 75％酒精浸泡乳鼠2min，取肝脏于平皿中 • PBS溶液洗涤3次 • 去除液体后，剪碎成1～2mm3小块 2.消化 • 加5～8倍组织量的胰蛋白酶溶液 • 转移到离心管内，加盖 • 37℃水浴15min，每5min摇晃1次 • 终止消化：加1ml含血清的培养基DMEM
• 超净工作台 紫外消毒，鼓风，保持干净、整洁
• 高压锅 用电，带压力表，自动恒压，掌握时间
橡胶、塑料、药品——15’，金属——20’ • 培养瓶
玻璃瓶和塑料瓶，洗涤要干净，临时消毒
• 培养基 a.天然培养基：血清、胚胎浸出液、水解乳蛋白等 b.合成培养基：DMEM、RPMI1640、199培养基等 c.无血清培养基：Ham F12和DMEM混合的基础培 养基、自行设计与配制的培养基（加其他成分）
a.组织块法：直接将组织块接种于培养瓶， 24小时就有细胞向四周游出。 简便、易行，适合于来源有限、数量较少 的组织做原代细胞培养
b.消化法
• 用酶消化、分解妨碍细胞生长的间质（基 质、纤维等），形成单个细胞或细胞团
• 对上皮、肝、肾、胚胎等间质少、较软组 织选择胰蛋白酶
• 对骨、前列腺、癌组织等纤维多、较硬的 组织可用胶原酶
32动物细胞培养的基本方法-PPT课件
二 细胞计数 1 血球计数板计数 2 自动细胞计数器计数 3 结晶紫染色细胞核计数法 4 MTT染色计数法
三 细胞传代 1 悬浮细胞的传代
加入一倍或几倍的生长液，然后分种两只或 多只培养瓶即可。
2 贴壁细胞的传代
① 消化前需用肉眼或镜下观察需消化的细胞，确认细 胞有无污染； ② 加入消化液量要适当，以摇动时能盖满单层细胞为 度； ③ 消化时间不宜过久，一般在室温下静置2～5min, 当见细胞层出现麻布样网孔时，即可倒去消化液。 ④ 终止消化要先倒去消化液，然后加入有血清的培养 基。
缺点：细胞体积小，且处于悬浮状态，难采 用灌流培养，细胞密度低。
2、贴壁培养
必须让细胞贴附在某种基质上生长繁殖的培 养方法。
适用细胞类型：贴壁依赖型细胞，兼性贴壁 细胞。 基质要求：具有净阳电荷和高度表面活性。 对微载体而言还要求具有一定电荷密度。
优点：
a容易更换培养液，细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养 液。 b容易采用灌流培养，从而达到提高细胞密度 的目的，因细胞被固定，不需过滤系统。 c当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
一般适用于非贴壁依赖性细胞的固定。 常用的载体：琼脂糖；海藻酸钙凝胶
微囊法：
用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微 囊内，细胞不能溢出，但小分子物质及营 养物质可自由出入半透膜。
囊内是微小培养环境，与液体培养相似，能 保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度 高。
③结团培养：
利用细胞本身形成结团的特点，相互结团后 再用悬浮的方法培养，操作简便，节省了 用于微载体的成本。
缺点：
a操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够 的面积。 b培养条件不易均一，传质和传氧效果差。
《动物细胞培养技术》课件
动物细胞培养技术可以用于组织工程和再 生医学领域，为损伤或病变的组织和器官 提供替代疗法。
02
动物细胞培养的基本原理
细胞周期与细胞分裂
细胞周期
描述细胞生长和分裂的阶段，包 括间期和分裂期。
细胞分裂
细胞繁殖的方式，包括有丝分裂和 减数分裂。
细胞分裂调控
介绍细胞分裂的调控机制，如周期 蛋白、激酶等。
调整细胞浓度
将分离出的单个细胞调整到合适的浓度。
接种
将调整好的细胞悬液接种到培养容器中，轻轻晃 动容器使细胞均匀分布。
培养
将接种好的容器放置在恒温、恒湿、恒光的培养 箱中培养，定期观察记录细胞的生长情况。
细胞观察与检测
01
02
03
04
形态观察
定期观察细胞的形态变化，如 细胞大小、形态、染色深浅等
。
• 干细胞治疗是一种新兴的治疗方法，利用干细胞的再生和分化能力来修复或替换受损的组织和器官。动物细胞培养技术在 干细胞治疗领域的应用，为干细胞分离、培养和扩增提供了重要的技术支持，有助于推动干细胞治疗的发展。
动物细胞培养技术的发展前景 干细胞治疗领域的应用
药物筛选与毒性测试
药物研发过程中，需要进行大量的药物筛选和毒性测试。动物细胞培养技术可以 模拟人体细胞对药物的反应，为药物筛选和毒性测试提供更为准确和可靠的数据 支持，有助于加速新药的研发进程。
动物细胞培养技术广泛应用于生物医 学、药物研发、食品安全等领域。
培养基是动物细胞培养的关键因素， 它为细胞提供营养、生长因子和适宜 的生存环境。
动物细胞培养技术的外培养动物细胞。
20世纪初，随着组织培养技术 的不断发展，动物细胞培养技术
逐渐成熟。
21世纪初，随着基因编辑技术 的发展，动物细胞培养技术在疾 病治疗、药物研发等领域的应用
植物细胞培养的基本技术_PPT幻灯片
植物细胞培养技术的基本技术：
一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择
一、植物材料的准备
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。
植物培养物的生长取决于生长素和分 裂素的比例
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂
低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述 现象。
（4）、需要有机氮源
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。
对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源 的供应
常用培养基
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。
MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养 设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高， 是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物 细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培 养基的基本培养基。
原生质体培养 按 培养对象 分
单倍体细胞培养
按 培养基类型 分
固体培养 液体培养
按 培养方式 分
悬浮细胞培养
固体培养基
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养
特点： 简便易行、培养所占空间小
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
固体培养基
苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于 叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用
一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择
一、植物材料的准备
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。
植物培养物的生长取决于生长素和分 裂素的比例
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂
低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述 现象。
（4）、需要有机氮源
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。
对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源 的供应
常用培养基
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。
MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养 设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高， 是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物 细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培 养基的基本培养基。
原生质体培养 按 培养对象 分
单倍体细胞培养
按 培养基类型 分
固体培养 液体培养
按 培养方式 分
悬浮细胞培养
固体培养基
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养
特点： 简便易行、培养所占空间小
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
固体培养基
苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于 叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用
《动物体细胞培养》课件
基因编辑与转基因技术
动物体细胞培养可用于基因编辑和转 基因技术的操作，实现基因的敲除、 敲入和转录调控等。
干细胞研究
动物体细胞培养可用于干细胞的研究 ，包括胚胎干细胞和成体干细胞的分 离、扩增和诱导分化等。
动物体细胞培养的历史与发展
历史回顾
动物体细胞培养技术自20世纪50年代发展至今，经历了从简 单培养到复杂培养的过程，技术手段不断改进和完善。
特点
可以获得具有高度相似性和稳定性的 细胞系，用于药物筛选和疾病模型建 立等。
04
动物体细胞培养的挑战与解
决方案
细胞污染问题
总结词
细胞污染是动物体细胞培养中常见的问 题，它会影响实验结果和细胞的健康状 况。
VS
详细描述
细胞污染通常由微生物、支原体、其他细 胞等引起。为了解决这一问题，需要在实 验过程中严格控制环境卫生，定期进行消 毒和检查，以及使用高质量的试剂和耗材 。
动物体细胞培养在生物工程领域的应用前景
总结词
动物体细胞培养在生物工程领域的应用前景 广阔，有助于推动畜牧业、生物制药和生物 材料等领域的发展。
详细描述
通过动物体细胞培养技术，可以生产出具有 特定功能的生物材料和药物，如生长因子、 抗体等。同时，在畜牧业中，动物体细胞培 养技术的应用将有助于提高动物产量和品质 ，降低生产成本。此外，动物体细胞培养还 可以用于基因编辑和基因治疗等领域的研究
发展趋势
随着生物技术的不断发展，动物体细胞培养将朝着更加高效 、安全和可控的方向发展，同时与其他技术的结合将为科学 研究提供更多可能性。
02
动物体细胞培养的基本原理
细胞周期与细胞分裂
细胞周期
描述细胞从一次分裂完成开始， 到下一次分裂完成所经历的全过 程。
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存).ppt
镜下观察，标明名称，序号和日期。
16
6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，
用200µl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200µl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下
观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20µl。
14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。
15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。
12
16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5ml。
10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。
11
11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。
10
6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）。
8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；
9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 分钟后取出；
3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已
细胞培养基本技术PPT课件
细胞培养基本技术ppt课件
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
目录
• 细胞培养技术简介 • 细胞培养的基本条件 • 细胞培养的常用技术 • 细胞培养的实验操作 • 细胞培养的注意事项与安全防护
01 细胞培养技术简介
细胞培养技术的定义
细胞培养技术是指将活体组织或细胞 从生物体中分离出来，在模拟体内环 境的条件下，进行培养、繁殖和维持 生命活动的一种技术。
有特定功能的细胞。
细胞克隆技术的优点是能够筛 选出具有特定功能的细胞，缺 点是需要花费大量时间和精力
进行筛选。
细胞融合技术
细胞融合技术是通过将两个或多个细 胞融合成一个新的细胞，用于生产单 克隆抗体、制备杂交瘤细胞等。
细胞融合技术的优点是能够制备出具 有两个或多个细胞特性的杂交瘤细胞， 缺点是需要筛选出具有所需特性的杂 交瘤细胞。
染条件。
04 细胞培养的实验操作
细胞接种与扩大培养
细胞接种
将少量细胞悬液加入培养容器中，轻 轻旋转使细胞均匀分布。
扩大培养
将已生长的细胞从原培养容器中取出 ，按比例加入新鲜培养基，继续培养 。
细胞的观察与检测
细胞形态观察
定期观察细胞形态变化，如生长状态、分裂速度等。
细胞数量与密度检测
使用细胞计数板或流式细胞仪测定细胞数量和密度。
传代细胞培养需要定期进行细胞 分裂和繁殖，以维持细胞的生长
和生产能力。
传代细胞培养的优点是能够大量 生产具有相同特性的细胞，缺点 是细胞的生长和生产能力会随着
传代次数的增加而降低。
细胞克隆技术
细胞克隆技术是通过将单个细 胞培养成一个个独立的群体， 用于筛选具有特定功能的细胞。
细胞克隆技术需要使用适当 的筛选方法来识别和分离具
细胞识别与鉴定
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吸去旧培养基， PBS清洗 加入胰酶消化 终止胰酶消化并 吹打
细胞冻存的注意事项：
（1）冻存液要最先配置。 原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。 原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。 （2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。 （3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。 （4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃，细胞冻 存盒应先放在4 ℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻 存盒，则采用程序降温法。（4℃冰箱40min， -20℃冰箱30-60min， 置于-80 ℃ 过夜，次日转入液氮。）
（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。
（6）培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。
原代组织块培养法
（1） 剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。 （2） 摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布20~30块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞， 置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少 许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞培养主要的设施器材
设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。 二、塑料器材 多孔培养板（ 6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。 2 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头
传代方法：
悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。
细胞的传代
悬浮细胞传代：（1）收集细胞悬液； （2）离心（1000转/分，2分钟）； （3）弃上清； （4）加入新鲜培养基重悬细胞； （5）按照适当比例接种到新的培养皿； （6）补足培养基； （7）放于温箱培养。
重悬 分装 放入温箱
细胞的传代
贴壁细胞的传代：（1）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面； （2） 加入胰酶消化细胞； （3）加入新鲜培养基终止胰酶消化； （4）将细胞吹打下来，收集，离心； （5）弃上清； （6）加入新鲜培养基重悬细胞； （7）按照适当比例接种到新的培养皿； （8）补足培养基； （9）放于温箱培养。
悬浮细胞的冻存：（1）配制冻存液（胎牛血清：二甲基亚砜 9:1），每个冻存管需要 冻存液1ml。 （2）收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻 存管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80℃冰箱，第二日转存 于液氮中。
细胞的冻存
贴壁细胞的冻存：（1）配制冻存液。 （2）弃去陈旧培养基，PBS清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化， 吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分 装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80℃冰箱，第二 日转存于液氮中。
细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、 CHO细胞等。
原代培养
原理： 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、 螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培 养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。
细胞的传代
细胞传代的概念： 随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制， 生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或 发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶） 内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）。
设施、器材、试剂实物图
培养细胞的分类
按照是否贴壁：
贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质 细胞等。 悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。
按照传代次数： 原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之
内的细胞统称为原代细胞。）
原代消化培养法
（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 （2）剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。 （3）消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和 组织的硬度而定。 （4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞， 立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心收集细胞，弃上清。
吸去旧培养基， PBS清洗 加入胰酶消化 终止胰酶消化并 吹打 重悬 分装 放入温箱
细胞的换液
悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。 或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培BS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。
细胞的冻存
细胞培养的条件
（1）适宜的温度和PH 37℃，pH7.2~7.4。 （2）气体环境 95%空气+5% CO2; 适宜的湿度（无菌水不能干掉）。 （CO2：细胞生长所必需的成分, pH值维持，最低不能低于1%。） （3）营养物质 N 源、C源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。 常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199 等。 （4）无菌条件 紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。
L/O/G/O
细胞培养的基本方法
细胞培养的基本概念
细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内 环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一 一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞， 也可以是细胞群。
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细胞培养的目的与用途
一、基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 二、科学研究 2: (1) 新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等. (2) 疫苗研究与开发:如肝炎疫苗, 艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等. (3) 基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发 (4) 单克隆抗体制备
细胞冻存的注意事项：
（1）冻存液要最先配置。 原因一：二甲基亚砜（DMSO）在加入血清时会产热损伤细胞。 原因二：如果先用血清重悬细胞，再加入DMSO，则局部DMSO浓度过高，会 对细胞造成严重损伤（DMSO在室温下对细胞有害），影响日后的复苏。 （2）冻存时要求细胞状态良好，最好是取对数期细胞冻存，以保证复苏后的存活率。 （3）最大限度的减少DMSO在室温下和细胞接触的时间。 （4）冻存时要缓慢降温（慢冻），用细胞冻存盒可以做到每分钟降低1℃，细胞冻 存盒应先放在4 ℃预冷，以减少细胞和DMSO在室温接触的时间；如果没有冻 存盒，则采用程序降温法。（4℃冰箱40min， -20℃冰箱30-60min， 置于-80 ℃ 过夜，次日转入液氮。）
（5）加入适量培养基重悬细胞，分装入培养瓶中，补足培养基。
（6）培养：置于37℃，5%CO2温箱培养。
原代组织块培养法
（1） 剪切：用Hanks液漂洗二三次以去掉组织块表面血污，剪成1mm3小块。 （2） 摆布：将组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以0.5cm为宜，每一25ml 培养瓶底可摆布20~30块。 （3） 轻轻翻转培养瓶，令瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，盖好瓶塞， 置36.5℃温箱培养2小时左右（勿超过4小时），使小块微干涸。 （4） 培养：从微箱中取出培养瓶，46度斜持培养瓶，向瓶底脚部轻轻注入培养液少 许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶底上的组织小块。 置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。
细胞培养主要的设施器材
设施：超净台、恒温培养箱、倒置显微镜、液氮储存罐、冰柜、恒温 水浴槽、离心机、压力蒸汽消毒器。 器材： 一、玻璃器材 玻璃培养皿、刻度吸管、离心管、培养瓶等，（现已较少使用）。 二、塑料器材 多孔培养板（ 6,12,24,48,96）、培养皿、培养瓶、离心管、冻存管。 2 三、橡皮器材 橡皮制品（最好是硅制品）做各种瓶或试管的塞子、盖子。 四、金属器材 剪刀、镊子、手术刀、解剖刀、血管钳、组织镊、眼科镊及各种型号针头 五、其他物品 纱布、注射器、针头、滤头
传代方法：
悬浮细胞传代、贴壁细胞传代。
细胞的传代
悬浮细胞传代：（1）收集细胞悬液； （2）离心（1000转/分，2分钟）； （3）弃上清； （4）加入新鲜培养基重悬细胞； （5）按照适当比例接种到新的培养皿； （6）补足培养基； （7）放于温箱培养。
重悬 分装 放入温箱
细胞的传代
贴壁细胞的传代：（1）吸去陈旧培养基，并用PBS清洗细胞表面； （2） 加入胰酶消化细胞； （3）加入新鲜培养基终止胰酶消化； （4）将细胞吹打下来，收集，离心； （5）弃上清； （6）加入新鲜培养基重悬细胞； （7）按照适当比例接种到新的培养皿； （8）补足培养基； （9）放于温箱培养。
悬浮细胞的冻存：（1）配制冻存液（胎牛血清：二甲基亚砜 9:1），每个冻存管需要 冻存液1ml。 （2）收集细胞悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分装至冻 存管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80℃冰箱，第二日转存 于液氮中。
细胞的冻存
贴壁细胞的冻存：（1）配制冻存液。 （2）弃去陈旧培养基，PBS清洗细胞表面，胰酶消化，终止消化， 吹打细胞，收集悬液、离心、弃上清、用冻存液重悬细胞、分 装至冻存管中，并立刻放入冻存盒内，放入 - 80℃冰箱，第二 日转存于液氮中。
细胞系：指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。如HeLa细胞、 CHO细胞等。
原代培养
原理： 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、 螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培 养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
原代培养方法：消化培养法、组织块培养法。
细胞的传代
细胞传代的概念： 随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制， 生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或 发生中毒。此时就需要将原有细胞分成几部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶） 内，再进行培养，这个过程就称为传代（passage）。
设施、器材、试剂实物图
培养细胞的分类
按照是否贴壁：
贴壁细胞：大多数属此类细胞，如肿瘤细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质 细胞等。 悬浮细胞：主要为取自血、骨髓、脾的细胞，如白血病细胞。
按照传代次数： 原代细胞：即从体内取出组织接种培养而未经传代的细胞。（也有人把传代10次之
内的细胞统称为原代细胞。）
原代消化培养法
（1）处理组织：用Hanks液漂洗组织2~3次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先 置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 （2）剪切：将组织切成2~3毫米大小的块，加入胰蛋白酶液，然后一并倒入培养皿中。 （3）消化：置于37℃温箱消化，每隔20分钟摇动一次。消化时间依组织块的大小和 组织的硬度而定。 （4）分离：用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞， 立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 （500~1000转/分）离心收集细胞，弃上清。
吸去旧培养基， PBS清洗 加入胰酶消化 终止胰酶消化并 吹打 重悬 分装 放入温箱
细胞的换液
悬浮细胞换液：收集细胞悬液、离心、弃上清、加入新鲜培养基重悬、补足培养基。 或者直接从旧瓶吸取一定细胞悬液加入新瓶，补足新鲜培BS清洗细胞表面、加入新鲜培养基。
细胞的冻存
细胞培养的条件
（1）适宜的温度和PH 37℃，pH7.2~7.4。 （2）气体环境 95%空气+5% CO2; 适宜的湿度（无菌水不能干掉）。 （CO2：细胞生长所必需的成分, pH值维持，最低不能低于1%。） （3）营养物质 N 源、C源、无机盐、维生素、H2O，细胞培养基中含有。 常用的细胞培养基：DMEM，RPMI-1640，BME，M199 等。 （4）无菌条件 紫外消毒、空气过滤、无菌滤头，高压灭菌、严格操作。
L/O/G/O
细胞培养的基本方法
细胞培养的基本概念
细胞培养是指从体内组织取出细胞在体外模拟体内 环境下，使其生长繁殖，并维持其结构和功能的一 一种培养技术。细胞培养的培养物可以是单个细胞， 也可以是细胞群。
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细胞培养的目的与用途
一、基础研究 (1) 药物作用机理 (2) 基因功能 (3) 疾病发生机理 二、科学研究 2: (1) 新药筛选:如药效研究,中药有效成分筛选等. (2) 疫苗研究与开发:如肝炎疫苗, 艾滋病疫苗，肿瘤疫苗等. (3) 基因工程药物与细胞工程药物的研究与开发 (4) 单克隆抗体制备