细胞培养工艺介绍ppt课件
合集下载
细胞培养技术培训ppt课件版
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下 生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。
细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能 状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。
若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等， 表明细胞代谢不良。
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
倒 置 显 微 镜
back
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
液 氮 罐
back
严格执行突发事件上报制度、校外活 动报批 制度等 相关规 章制度 。做到 及时发 现、制 止、汇 报并处 理各类 违纪行 为或突 发事件 。
植物细胞培养ppt课件
• 外植体：用来进行离体无菌培养的离体材料。
• 愈伤组织：外植体在离体培养条件下，细胞经脱分
化等一系列过程，产生一团不定型的疏散排列的薄 壁细胞（具有未分化细胞的特性）。
• 胚状体：由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽，胚
根和胚轴的胚状结构。
• 不定芽：愈伤组织中的细胞发生分化，形成
不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。
植物生长调节物质：
生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D
细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT
pH值（5.8）
琼脂
精选ppt
15
• 封口：接种后，瓶，管用无菌药棉或盖封
口，培养皿用无菌胶带封口
• 温度（25度），pH（5-6）和氧气（5%）
• 增殖：在新梢（愈伤组织）等形成后，分
株或切段转入增殖培养基中继代培养。
3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，细胞 内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而 使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。分 化出形态和功能不同的细胞，分生细胞、色素 细胞、纤维细胞等 。
精选ppt
20
• 愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强 。
外观一般为鲜艳的乳白或淡黄色，呈小颗粒状， 疏松易碎。
总的原则：健康无病的年幼组织。
精选ppt
11
2）培养材料的消毒
材料
自来水和蒸 馏水冲洗
酒精中浸泡 30-60秒
无菌水 冲洗3遍
0.01%升汞 （HgCl2)消毒10 分钟
精选ppt
12
3） 制备外植体
在无菌条件下将材料切成0.2-0.5cm厚的小片， 剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮或种皮胚乳。
精选ppt
苗后用自来水冲洗干净；再移栽到准备好 的基质中。
《细胞培养技术》课件
《细胞培养技术》PPT课 件
细胞培养技术是一项重要的生物学技术，通过将细胞生长在适宜的培养基中， 实现细胞的体外培养和繁殖，为研究细胞和开发生物制品提供了重要手段。
什么是细胞培养技术
1 定义
2 历史
细胞培养技术指的是将细胞从生物体中取出， 在适宜的培养基中进行体外培养的技术。
细胞培养技术起源于20世纪初，随着科学技 术的进步，逐渐成为生物学和医学领域的重 要工具。
常用的细胞培养方法
传统细胞培养方法
通过将细胞放置在培养皿中，利用培养基中的营 养物质供养细胞并促进其生长和繁殖。
三维细胞培养技术
通过构建具有三维结构的培养环境，模拟生物体 内的细胞生长环境，促进细胞在体外的功能表达。
动物细胞培养技术
主要应用于医学研究和生物制药领域，常用于人 类或动物细胞的培养和研究。
环保领域
细胞培养技术有助于环境修复和污染物降解，如 污水处理等。
细胞培养技术的挑战和发展趋势
1 挑战
细胞培养技术面临着细胞变异、细胞老化、 污染等问题，需要不断解决和改进。
2 发展趋势
随着科技的不断发展，细胞培养技术将越来 越趋向自动化、高通量和个性化。
结语
1 总结
细胞培养技术是一项重要的生物学技术，推 动了许多领域的发展和进步。
2 展望
未来，细胞培养技术将继续发展，为人类的 健康和社会发展做出更大贡献。
细胞培养基础知识
1 细胞的分类
2 培养基的种类
3 细胞培养条件
细胞可以根据形态、功能、 组织来源等进行分类，不 同类型的细胞需要不同的 培养条件。
培养基可以根据成分和用 途进行分类，常见的有无 血清培养基、无动物成分 培养基等。
细胞的培养需要一定的温 度、湿度、二氧化碳浓度 等环境条件，以及适当的 营养物质供给。
细胞培养技术是一项重要的生物学技术，通过将细胞生长在适宜的培养基中， 实现细胞的体外培养和繁殖，为研究细胞和开发生物制品提供了重要手段。
什么是细胞培养技术
1 定义
2 历史
细胞培养技术指的是将细胞从生物体中取出， 在适宜的培养基中进行体外培养的技术。
细胞培养技术起源于20世纪初，随着科学技 术的进步，逐渐成为生物学和医学领域的重 要工具。
常用的细胞培养方法
传统细胞培养方法
通过将细胞放置在培养皿中，利用培养基中的营 养物质供养细胞并促进其生长和繁殖。
三维细胞培养技术
通过构建具有三维结构的培养环境，模拟生物体 内的细胞生长环境，促进细胞在体外的功能表达。
动物细胞培养技术
主要应用于医学研究和生物制药领域，常用于人 类或动物细胞的培养和研究。
环保领域
细胞培养技术有助于环境修复和污染物降解，如 污水处理等。
细胞培养技术的挑战和发展趋势
1 挑战
细胞培养技术面临着细胞变异、细胞老化、 污染等问题，需要不断解决和改进。
2 发展趋势
随着科技的不断发展，细胞培养技术将越来 越趋向自动化、高通量和个性化。
结语
1 总结
细胞培养技术是一项重要的生物学技术，推 动了许多领域的发展和进步。
2 展望
未来，细胞培养技术将继续发展，为人类的 健康和社会发展做出更大贡献。
细胞培养基础知识
1 细胞的分类
2 培养基的种类
3 细胞培养条件
细胞可以根据形态、功能、 组织来源等进行分类，不 同类型的细胞需要不同的 培养条件。
培养基可以根据成分和用 途进行分类，常见的有无 血清培养基、无动物成分 培养基等。
细胞的培养需要一定的温 度、湿度、二氧化碳浓度 等环境条件，以及适当的 营养物质供给。
植物细胞培养的基本技术_PPT幻灯片
植物细胞培养技术的基本技术：
一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择
一、植物材料的准备
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。
植物培养物的生长取决于生长素和分 裂素的比例
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂
低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述 现象。
（4）、需要有机氮源
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。
对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源 的供应
常用培养基
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。
MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养 设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高， 是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物 细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培 养基的基本培养基。
原生质体培养 按 培养对象 分
单倍体细胞培养
按 培养基类型 分
固体培养 液体培养
按 培养方式 分
悬浮细胞培养
固体培养基
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养
特点： 简便易行、培养所占空间小
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
固体培养基
苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于 叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用
一、植物材料的准备 二、培养基的准备 三、培养方法的选择
一、植物材料的准备
1、外植体
外植体：
植物组织培养中作为离体培养材料的器官或 组织的片段。
在继代培养时，将培养的组织切段移入新的 培养基时，这种切段也称外植体。
选取：
建立无菌材料时，取材的大小根据不同植物 材料而异。
植物培养物的生长取决于生长素和分 裂素的比例
高浓度生长素和低浓度生长素分裂素 刺激细胞分裂
低浓度生长素和高浓度生长素分裂素 刺激细胞生长
但是，过量赤霉素和酚类化合物能掩盖上述 现象。
（4）、需要有机氮源
有机氮源为蛋白质水解产物（如谷氨酰胺） 或各种氨基酸。
对细胞早期生长有利
氨基酸的加入主要是为了代替或增加氮源 的供应
常用培养基
MS、N6、B6、LS、RM-1964、B5、 White等。
MS培养基是Murashige（穆拉希吉）和 Skoog（斯科格）于1962年为烟草细胞培养 设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高， 是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量 高，其养分的数量和比例合适，能满足植物 细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较 广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培 养基的基本培养基。
原生质体培养 按 培养对象 分
单倍体细胞培养
按 培养基类型 分
固体培养 液体培养
按 培养方式 分
悬浮细胞培养
固体培养基
定义： 利用琼脂作为支持物的固体培养和固定化细胞培养
特点： 简便易行、培养所占空间小
常用的固化剂： 琼脂、藻酸盐、角叉藻聚糖、明胶、羟乙基纤维素、 聚丙烯酰胺、淀粉、硅胶
固体培养基
苏氨酸、甘氨酸和缬氨酸，通过灭活位于 叶绿体和细胞质上的谷氨酸合成酶而降低氮 的利用
细胞培养概述
注意事项
• 1、实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫 及无菌操作台(laminarflow) 实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以 外灯照射30-60分钟灭菌， 70%ethanol擦拭无菌操作抬 外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬 照射30 分钟灭菌 面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操 并开启无菌操作台风扇运转10分钟后， 10分钟后 作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不 每次操作只处理一株细胞株， 共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。 共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后 ，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬 将实验物品带出工作台， 70%ethanol擦拭无菌操作抬 面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行 操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后， 10分钟以上后 下一个细胞株之操作。 下一个细胞株之操作。
• 2、无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞， 必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸 管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完 即应移出，以利于气流之流通。实验用品 以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内 。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿 在边缘之非无菌区域操作。
• 3、小心取用无菌之实验物品，避免造成污 小心取用无菌之实验物品， 勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口， 染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦 不要在打开之容器正上方操作实验。容器 不要在打开之容器正上方操作实验。 打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身， 打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜 45°角取用， 约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放 置桌面。 置桌面。
(5)水
细胞培养技术
二、培养细胞的特性
培养细胞的生长特点
贴附
贴附
贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一 以成纤维细胞为例，一般在细胞接种后，很快
（5-10min）便可见细胞以伪足初期附着，与底物
形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展
开，细胞体的中心部分亦随之扁平；最后细胞成
为成纤维细胞的形态。
1. 培养细胞的生长方式及类型
五 细胞冷冻保存
1. 冷冻保护剂浓度为5 或10 ％ DMSO，
冷冻方法： 传统方法8小 时(或隔夜)--> 液氮槽蒸汽相中长期储存。
2. 材料用品
1） 2） 3） 4） 生长良好的培养细胞 新鲜培养基 DMSO (Sigma D-2650) 无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)
四、细胞传代培养
1. 细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一 般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。 2. 材料用品： PBS,0.25%胰酶, 新鲜培养基
3. 步骤：
3.1. 贴壁型细胞 1） 吸掉旧培养液。
2） 用PBS 洗涤细胞一至二次。
3） 0.25%胰酶37℃ 作用数分钟，于倒置显微镜下观察，当细 胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉胰酶溶液。
1. 细胞培养(cell culture)概念
从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在 无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存
和生长并维持其结构和功能的技术。
体内、外细胞的差异
体内细胞：
机体神经体液调节 和其他类型细胞影响 基因表达受到外来信号调节 增殖过程中不断发生着分化 （由一般到特殊） 高度特化的结构和功能
3. 操作步骤：
《细胞培养基础》PPT课件
体 外 培 养 细 胞 分 裂 指 数 介 于 0.10.5%，且受细胞种类培养液成分、pH、 温度等影响。
▪ 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验
▪ 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。
• 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置 换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴 附之问题
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
▪ 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢 产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单 胞菌属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
– 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养 箱。如发现支原体污染，丢弃培养物
• 培养液中无贴壁因子
原代细胞培养物污染
• 原代培养组织在进入培养前已污染
– 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液 反复冲洗组织
▪ 指数生长期是细胞活力最好的时期，可对 细胞进行各种实验
▪ 指数生长期持续3-5d后，随细胞数量不断 增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触 汇合成片，呈现接触抑制。而恶性细胞则 无接触抑制现象。
• 除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置 换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此 可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴 附之问题
支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
▪ 癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢 产物的影响而发生密度抑制
（三）停滞期：
即细胞数量达到饱和密度后，细胞 与营养液的交换面积减少，代谢产物积 累，pH下降细胞停止增殖，进入停滞期。
在此时应及时进行传代，否则因细胞 中毒受损，大量细胞出现死亡，至少再 传1-2代后，细胞才能恢复。
细胞的传代培养操作
细胞培养的污染和检测
• 细胞污染的种类 细菌、酵母菌、霉菌和病毒 • 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞
细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。 洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单 胞菌属，是植物病原菌。
白色念珠菌污染
真菌感染
支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状
– 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养 箱。如发现支原体污染，丢弃培养物
• 培养液中无贴壁因子
原代细胞培养物污染
• 原代培养组织在进入培养前已污染
– 培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液 反复冲洗组织
细胞培养基本方法(复苏、换液、传代、冻存).ppt
镜下观察，标明名称，序号和日期。
16
6. 用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24小时。 7. 从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内，
用200µl的枪将孔内的培养基吸出； 8. 加入不同浓度的药物的无血清培养基,每孔200µl。 9. 盖上96孔板的盖子，拿出工作台，倒置显微镜下
观察，用酒精棉球擦板，放入培养箱内，培养24 小时。 10.从培养箱中取出，镜下观察，拿到工作台内， 每孔加MTT液20µl。
14.用吸管将细胞悬液移至5ml离心管中，盖上盖 子，在离心机内离心，1500转/分钟，时间为15 分钟。
15.离心结束后，拿至工作台内，烧离心管口。去掉 塞子，烧管口。
12
16.弃上清液，加冻存液2ml 吹打，使细胞均匀混在 冻存液中，再加3ml冻存液，用吸管吸出打入多 个冻存管中，每管1.5ml。
10. 在倒置显微镜下观察细胞的消化情况。若细胞 变成单个圆形，则可进行传代。
11
11.拿到工作台内，烧瓶口，取下盖子，烧瓶 口。用吸管吸出胰酶，烧瓶口。
12.拿出培养基瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子 将塞子取出，烧瓶口（至少10圈）。
13.用吸管吸取5ml的培养基打入培养瓶内，用吸管 吹打成单个细胞悬液。
10
6. 用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。
7. 拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子 取出，烧瓶口（至少10圈）。
8. 用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子；
9. 拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然 后用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5 分钟后取出；
3. 用酒精擦拭冻存管，放入工作台内。 4. 用镊子将封口膜夹掉，轻烧管口； 5. 用吸管吸出冻存管内的细胞悬液，打入已
细胞培养技术_第二讲
恶性细胞无接触抑制现象，所以可将其作为区 别正常细胞与癌细胞的标志之一。
密度抑制（density inhibition）：培养液 中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养 的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细 胞分裂停止。
传代细胞可连续传7~10代，细胞形状基本相同， 但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现 为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒 样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去 贴壁能力，从培养瓶底脱落。
组织培养细胞生命期
原代培养期 传代期 衰退期
原代培养期
又称初代培养期 （primary culture），从体内取出组织接种培养 到第一次传代阶段，一般持续1～4周。
此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。
细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存 性强。
传代培养期
一般经数小时-几天
过程:
游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形 吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁 潜伏期:可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相
初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性 细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种 因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底 物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤 维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein： CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细 胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从 各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞 生长增殖条件之一。
密度抑制（density inhibition）：培养液 中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养 的枯竭和代谢物的影响，发生密度抑制，导致细 胞分裂停止。
传代细胞可连续传7~10代，细胞形状基本相同， 但随着传代次数增多，细胞逐渐呈老化现象，表现 为:细胞增殖速度明显减慢，胞浆中出现空泡及颗粒 样物质，细胞碎片增多，细胞形态变为扁平，失去 贴壁能力，从培养瓶底脱落。
组织培养细胞生命期
原代培养期 传代期 衰退期
原代培养期
又称初代培养期 （primary culture），从体内取出组织接种培养 到第一次传代阶段，一般持续1～4周。
此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛；细胞形态相似。
细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存 性强。
传代培养期
一般经数小时-几天
过程:
游离:悬浮,胞质回缩, 全部细胞变为圆球形 吸附:贴附底物,一般24小时内贴壁 潜伏期:可有运动活动,基本无增殖, 少见分裂相
初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性 细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种 因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底 物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤 维连接素（Fibronectin），又称LETS（Larger External Transformation Substance），细胞表面蛋白（Cell Surface Protein： CSP）等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细 胞膜的表面（如 CSP），有的则来自培养基中的血清（LETS）。近年又从 各种不同组织和生物成分中提取出了很多促贴附物质。贴附是贴附类细胞 生长增殖条件之一。
植物组织和细胞培养技术ppt课件
植物组织培养
根据细胞全能性原理，在无菌条件下，分离植物
的器官、组织、细胞或原生质体（称为外植体），
并在培养基上培养，在适宜的条件下使其长成部
分或完整植株的技术。
愈
根 继续
分离
脱分化
伤再分化 组
芽
培养
外植体
织
植物激素： 细胞分裂素、生长素
植物 体
胚状 体
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
胚 状 体
幼 苗
离体培养
细胞全能性指已 经分化的细胞， 仍然具有发育成 完整新的生物个 体的潜能。
说明高度分化的 植物细胞具有全 能性。
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
细胞的全能性
为什么细胞具有全能性？
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许Байду номын сангаас 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
细胞的全能性
1．实现细胞的全能性必需的条件是什 么？为什么？
离体。因为在特定的时间和空间条件
下，细胞中的基因会选择性地表达出各 种蛋白质，形成不同的组织和器官。
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
在日常生活中，随处都可以看到浪费 粮食的 现象。 也许你 并未意 识到自 己在浪 费，也 许你认 为浪费 这一点 点算不 了什么
植物组织培养
根据细胞全能性原理，在无菌条件下，分
细胞培养技术 ppt课件
PPT课件
28
二、培养细胞相关条件
（三）细胞培养用试剂
（7）其他
谷氨酰胺： 终浓度2 mmol/L HEPES： 丙酮酸钠： 10-25 mmol/L 终浓度1 mmol/L
2-巯基乙醇：终浓度50 uM
PPT课件
29
三、培养细胞技术 （一）基本操作
1. 无菌操作
防止微生物污染； 培养用一切物品、液体都无菌。 （37度预热，或室温平衡） 2. 操作区消毒 75%酒精擦拭（生物安全柜，进入操作区物品） 紫外消毒20-30 min 3.洗手和着装 4. 实验操作
• 细胞工程药物研究与开发：生物活性多肽研究与开 发,人参皂甙,紫杉醇等生物活性成分研究与开发。 • 单克隆抗体制备：包括诊断用单克隆抗体,治疗用单
PPT课件 4
细胞培养目的和作用
基础研究
(1) 药物作用机理； (2) 基因功能； (3) 疾病发生机理。
2、生物制药
• 疫苗生产：如病毒性疫苗(肝炎病毒疫苗,艾滋病疫苗 等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
二、培养细胞相关条件
• 血清分类
• 1、特级胎牛血清（最高级别的） （1）Hyclone 北美特级胎牛血清（SH30070.03） （2）Gibco北美特级胎牛血清（16000-044）
• 2、优等级胎牛血清 （1）Hyclone加拿大优等胎牛血清（SH30396） （2）Hyclone澳大利亚优等胎牛血清（SH30084） （3）Gibco澳大利亚胎牛血清（10099-141）
PPT课件 3
细胞培养目的和作用
1、科学研究
药物研究与开发
• 新药筛选：如化学合成药物药效研究,中药有效成分 筛选与鉴定等。 • 疫苗研究与开发：如病毒性疫苗的研究与开发(肝炎 病毒疫苗,艾滋病疫苗等),肿瘤疫苗(多肽疫苗)等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
有限稀释法单克隆形 成 流式细胞术筛选细胞
检测手段
dot-blot
ELISA
SDS-PAGE Western Flow
Cytometry Analysis
dot-blot
上清 酶连抗体（1步或2步） 显色剂
酶联免疫吸附试验（ELISA）
夹心法 包被抗体 加上清 酶联抗体 显色 读数
细胞状态的观察 工艺参数的设定 液体补充的控制
发酵模式
批次培养
补料－批次培养
连续灌注培养
培养放大
方瓶
摇瓶
小罐 大罐 ……
培养控制
搅拌
优化空间
通气
营养补充
34.912
0.140 0.130 0.120 0.110
22.732
35.966
0.150
CHO
阳性克隆
将外源基因到入细胞内
可选的细胞 构建的表达载体 转染的方法 克隆的挑选 表达产物的检测
常用的表达细胞
CHO NSO
SP2/0 Hybridoma
常用的表达体系
GS表达系统 DHFR表达系统
表达载体的作用
让细胞产生抗性
同时表达目的蛋白
谷氨酰胺合成酶基因表达载体（GS）
转染方法
脂质体：融合细胞膜
磷酸钙：形成沉淀，细胞内吞
电穿孔：膜上打孔，自由出入
为什么要挑选克隆
稳定的种子 高效的种子
克隆就是从一个细胞增 殖形成的细胞群
经过验证的种子
细胞筛选方法－获得单克隆
贴壁培养的克隆形成
– – –
克隆环 ClonePix FL Cell Xpress
Re-clone subclone
优化考察指标——生长状态
优化考察指标
生长曲线
30 25 20
组合1 组合2 组合3 组合4 对照
表达水平
300 250 200
组合1 组合2 组合3 组合4 对照
×10 6
15 10 5 0 1
mg/L
9 10 11 天
150 100 50 0234 Nhomakorabea5
6
7
8
5天
7天
9天
11天 天
优化效果
工艺控制
脂类成分
无血清培养基的分类
无血清培养基
无动物源性成分
无蛋白培养基
化学成分限定型培养基 无血清、无蛋白、化学成分限定型培养基
优化培养——如何优化？
细胞株的选择
为什么要优化？
培养条件优化
工艺调整
细胞株的选择
细胞株的选择
培养条件优化
主要是培养基的优化
培养基的成分
培养基的使用方法
谷氨酰胺是细胞生命必需物质 部分细胞不能合成谷氨酰胺，或合成不 足
载体中含有谷氨酰胺合成酶的基因
在不含谷氨酰胺的培养基中，只有整合 了谷氨酰胺合成酶基因的细胞存活
加入筛选剂－MSX，增加其表达量
二氢叶酸还原酶表达系统（DHFR）
DHFR是合成dATP和dGTP的关键酶 常用DHFR-的CHO细胞不能合成四氢叶酸 含胸腺嘧啶核苷、甘氨酸和嘌呤的培养基 在氨甲酰喋呤（methotrexate,MTX）存在下， 增加外源基因的拷贝数，提高蛋白的表达水平， 使外源基因高效表达
SDS-PAGE
分子量与泳动距离
SDS带电，与蛋白结合
染色：溴酚蓝、银染等 定性及定量检测
Western
基于电泳
转膜
抗体及酶（同ELISA） 染色或发光
Flow Cytometry Analysis
抗体与细胞结合
荧光物质连接抗体
激光诱发荧光 可检测上清或细胞
高表达克隆的确定
构建表达载体 转染细胞 单克隆
上述筛选
重复克隆及筛选
保留3－5个克隆
如何培养细胞
无血清、悬浮培养
培养细胞的方法
含血清培养 无血清培养
– – – – –
贴壁
悬浮
价格便宜 品质稳定 生物污染少 减轻下游纯化负担 贴壁变悬浮 平面 立体
血清替代
氨基酸 维生素 生长因子 微量元素
Minutes
• 搅拌 • 通气 • pH • 密度 • 活率
% Composition
AU
培养监控
0.090
27.020
0.100
60.00
pO2 温度 生化参数 营养消耗 表达监控
0.020 0.010 0.000
28.246
37.279
20.00
10.00
0.00 -0.010 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00 30.00 31.00 32.00 33.00 34.00 35.00 36.00 37.00 38.00
100.00
90.00
80.00
30.786
33.081
35.623
70.00
0.080
50.00
23.488
0.070 0.060 0.050 0.040 0.030
27.387
29.630
31.869
21.994
40.00
32.219
33.413
36.640
30.00
24.482
24.123
25.703
现状
高需求量：数千公斤 国外水平：1-10g/L
国内水平：<1g/L
培养何种细胞
表达我们目的蛋白的细胞——处理过CHO细胞
基本概念
DNA——染色体——遗传物质
基因——DNA片断
转录：DNA——RNA
翻译：RNA——蛋白质
构建表达特定产物的细胞株
将特定产物的基因引入细胞中 长期稳定表达 挑选克隆
细胞培养工艺介 绍
为什么要培养细胞－生命科学的基本研究方法
科学研究需要——细胞是生物体的最小单位 工业生产的需要——细胞培养可以获得我们需 要的药物、原料等
单克隆抗体
市场快速增长 08年销售达167亿美元 已有近20个产品 超过150个在临床试验阶段 主要是CHO表达的，超过50％