实验室细胞培养基本知识ppt课件

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灭菌方式的选择
项目
消毒方式
玻璃器皿
干热
金属制品
干热
带螺口盖的玻璃品 高压灭菌，将盖悬 松
玻璃移液管
干热
枪头
高压灭菌
离心管(5ml，15ml， 高压灭菌，直立放
50ml)
置
EP管(1.5ml，2ml， 高压灭菌 5ml，10ml)
试管
干热
艾本德移液器（新） 高压灭菌，整支
高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 HEPES 甲基纤维素 酚红 盐溶液 水
细胞培养基本知识
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细胞培养基本概念
• 细胞培养：从动物或植物中取出细胞，使其在合适的人工环境中生长。
• 细胞来源：细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离， 也可来自已经建立的细胞系或细胞株。
• 原代培养：是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖， 直到占据所有可用基质(即：汇合) 的培养阶段。
• 液氮 (N2) 冷冻柜或冻存 容器
• 灭菌器 (即：高压灭菌器)
• 扩增设备： • 抽吸泵 (蠕动泵或真空泵) • pH 计 • 共聚焦显微镜 • 流式细胞仪
• 其他用品： • 细胞培养容器 (例如：培 养瓶、培养皿、滚瓶、 多孔板) • 吸管和移液器 • 注射器和针头 • 废物容器 • 培养基、血清和试剂 • 细胞系
• 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一 定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其 物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。
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为什么要细胞培养？
• 避开机体自身调节和实验应激的整体因素的影响； • 环境控制、均一性（可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结
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灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
• 热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅 树 脂 、 尼 龙 、 聚 丙 烯 、 聚 碳 酸 酯 用 湿 热 灭 菌 ： 121 ℃ ， 20min；
• 不耐热液体：过滤除菌； • 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
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配置完全培养基
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水，置于磁力搅拌器上，设定200r/min，边 搅拌边加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸 钠）；
• 用注射器吸取超纯水，将包装袋内残留培养基洗下；
• 干粉溶解后加入2.438g NaHCO3，搅拌至完全溶解；
果）、经济、规模和机械化；
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细胞培养的应用
• 细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术，可为细胞正常生 理和生化 (例如：代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的 作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于 药物筛选和开发以及生物化合物 (例如：疫苗、治疗性蛋白) 的大规模 生产。
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• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
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.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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准备与灭菌
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PBS的制备
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水； • 放在磁力搅拌器上，设定转速200r/min； • 打开PBS干粉（1L装）加入烧杯中； • 搅拌至完全溶解； • PH计检测PH为7.4，变化＜0.1； • 分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中湿热灭菌； • 自然冷却后盖紧，4℃或室温保存。
过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶 药物 谷氨酸盐 生长因子 HCL NaHCO3 NaOH 血清 丙酮酸钠
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胰蛋白酶
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玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌
• 将玻璃和金属器皿放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂 （Decon）的洗液中，侵泡过夜或至少2h（铝、铜制品不得浸 泡）;
• 试管刷清洗，自来水冲洗4次，去离子水冲洗3次； • 倒置于烘箱中烘干； • 铝箔封口保存； • 使用前24~48h，放入干热灭菌箱中，160℃灭菌1h，自然冷
• 传代培养：在细胞生长至汇合，必须将细胞转移到新的容器中并更换 新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。
• 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中 明确地选择出来，就成为一个细胞株。
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细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。
却后使用； • 100目和600目的筛网需要超声清洗。
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塑料制品的清洗和灭菌
• 将塑料制品放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（Decon） 的洗液中浸泡30min，自来水冲洗干净；
• 置于超声清洗器中清洗30min； • 用自来水充分清洗后用去离子水清洗（塑料制品要用专用的
刷子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗）； • 将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来，直立放入灭菌锅
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细胞培养实验室
隔间
走廊
二更
一间
二间
三间
一更
准备室
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细胞培养设备
• 基本设备：
• 细胞培养通风橱 (即：层 流通风橱或生物安全柜)
• 培养箱 (推荐使用湿式二 氧化碳培养箱)
• 水浴锅
• 离心机
• 冰箱和冰柜 (–20°C) • 细胞计数器 (例如：
Countess® 自动细胞计数 器或血球计数器) • 倒置显微镜
中湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要 直立放置）； • 自然冷却后置于烘箱中烘干。
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水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶
体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。