实验室细胞培养基本知识
《细胞培养培训》课件
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
细胞培养知识
细胞培养基础知识细胞培养基本条件1、合适的细胞培养基合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。
2、优质血清目前，大多数合成培养基都需要添加血清。
血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分。
3、无菌无毒细胞培养环境无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。
在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。
因此，在体外培养细胞时，必须保持细胞生存环境无菌无毒，及时清除细胞代谢产物。
4、恒定的细胞生长温度维持培养细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。
5、合适的气体环境气体是哺乳动物细胞培养生存必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
细胞培养基种类与基本成分细胞培养基的种类很多，按其来源分为合成培养基和天然培养基（目前使用的培养基绝大部分是合成培养基），按其物质状态分为干粉培养基和液体培养基两类。
干粉培养基需由实验者自己配制并灭菌，液体培养基由专业商家提供，用户可直接使用，非常方便。
1、合成培养基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、无机盐、维生素及其它辅助物质：氨基酸氨基酸是组成蛋白质的基本单位。
不同种类的细胞对氨基酸的要求各异，但有几种氨基酸细胞自身不能合成，必须依靠培养液提供，这几种氨基酸称为必需氨基酸。
其中谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。
因此，各种培养液中都有较大量的谷氨酰胺。
但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培养液内。
已含谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2 周以上时，还应重新加入原来量的谷氨酰胺。
碳水化合物碳水化合物是细胞生长主要能量来源，其中有的是合成蛋白质和核酸的成分。
主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。
实验室细胞培养基本知识
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。
• 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。 • 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2
环境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。
• 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各 种试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须 用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放置在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。
• 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要 也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质， 还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响HEPA过滤的寿命。
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌：160℃， 1h；
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。 • 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
细胞培养定义-概述说明以及解释
细胞培养定义-概述说明以及解释1.引言1.1 概述细胞培养是一种重要的科学技术，用于在控制的实验室条件下，培养细胞体外生长和增殖。
通过提供合适的生长环境，包括适当的培养基、细胞状态维持剂和温度、湿度等因素的控制，细胞可以持续生长和繁殖。
细胞培养可以在无菌环境下进行，以保证培养过程中没有污染物的引入。
细胞培养的主要目的是研究细胞的特性和功能。
通过细胞培养，科学家可以观察和研究细胞在不同条件下的行为，进一步了解细胞的基本生理过程、信号转导途径和分化过程。
此外，细胞培养还被广泛应用于药物筛选、生物技术研究、生物工程和医药领域等。
细胞培养的发展历史可以追溯到19世纪末。
当时，人们开始尝试培养动物细胞，最早成功地实现了培养培养出鸟胚细胞。
经过长期的努力和技术改进，细胞培养的技术逐渐成熟，并被广泛应用于各个领域。
综上所述，细胞培养是一种重要的科学技术，通过在受控的实验室条件下培养细胞，可以研究细胞的特性和功能。
随着细胞培养技术的不断发展和完善，它在生物学研究、生物技术和医药领域的应用将会更加广泛。
1.2文章结构1.2 文章结构本文旨在探讨细胞培养的定义、历史、重要性以及应用领域。
为了更好地展示这些内容，本文将按照以下结构进行组织和展示：第一部分是引言部分，引言部分将对细胞培养进行概述。
我们将介绍细胞培养的基本概念，其在生物科学中的重要性以及本文的目的。
第二部分是正文部分，正文部分将分为两个小节。
首先，我们将详细介绍细胞培养的定义。
我们将解释什么是细胞培养，如何进行细胞培养以及细胞培养的目的和意义。
其次，我们将回顾细胞培养的历史，探讨细胞培养技术的发展和重要里程碑，以及这些里程碑对现代细胞培养的影响。
第三部分是结论部分，结论部分将总结细胞培养的重要性和应用领域。
我们将强调细胞培养在生命科学研究中的关键作用，并讨论细胞培养在医学、药物研发、生物工程等领域的广泛应用。
通过以上的文章结构，我们将全面、系统地介绍细胞培养的定义、历史、重要性和应用领域。
细胞培养方法
细胞培养方法
细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以提供大量的细胞用于实验研究。
正确的细胞培养方法对于细胞的生长、增殖和实验结果的准确性都至关重要。
下面将介绍一些常用的细胞培养方法及注意事项。
首先，准备培养基。
培养基是细胞生长所必需的营养物质和生长因子的混合物。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等，根据不同细胞类型的要求选择适当的培养基。
在制备培养基时，需要注意无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
其次，处理细胞。
从细胞库中取出细胞后，需要进行细胞的处理和传代。
处理细胞时，要注意细胞的密度和活性，避免细胞凝集和死亡。
传代时，要根据细胞的生长状态和密度进行适当的稀释，以保证细胞的健康生长。
接着，进行细胞的接种和培养。
将处理好的细胞按照一定的比例接种到预先涂有培养基的培养皿中，然后将培养皿放入培养箱中进行培养。
在培养过程中，需要定期观察细胞的生长状态，及时更换培养基，避免细胞过度生长或死亡。
最后，进行实验。
当细胞达到所需的数量和状态后，就可以进行相关的实验。
在实验过程中，需要注意培养皿的无菌操作，避免细菌和真菌的污染。
同时，要注意细胞的处理和操作方法，避免对细胞造成损伤。
总之，正确的细胞培养方法对于细胞的生长和实验结果至关重要。
只有严格遵守操作规程，做好无菌操作，才能得到可靠的实验结果。
希望本文介绍的细胞培养方法能够对大家有所帮助。
细胞培养技术 第一章 绪论和基本理论
第二节 生存环境、条件
一、无污染环境：首要条件
二、温度 36.5℃±0.5℃（36℃~37℃）
三、气体环境和氢离子溶度
95 % 空气+5 % CO2 四、生存所需基本物质
pH值为7.2~7.4
（一）糖；（二）氨基酸； （三）促生长因 子；（四）其它物质
五、渗透压：260 ~320 mOsm/kg （等渗）
和庆大霉素
第四章 清洗与消毒
一、玻璃器皿的清洗 （一）浸泡 （二）刷洗 （三）浸酸 : 24h
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不同的强度清洗液
类 型 重铬酸钾 （g ）
强 液 63 次强液 120 弱 液 100
浓硫酸 （ml） 1000 200 100
蒸馏水 （ml）
200 1000 100
（四）冲洗
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二、胶塞的清洗
三、塑料器皿的清洗
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（二）培养液的种类
生长培养液 维持液
基本培养基 80~90 % 95 %
血清 10~20 %
2~5 %
第四节 其它溶液
一、消化液 ：胰蛋白酶溶液 0.25%或 0.125%； 0.02% EDTA（Versene）溶液
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二、pH调整液 1.NaCO3液：7.4%、5.6%、3.7% 2.HEPES（分子量238.31）液 三、抗生素液：青霉素、链霉素、卡那霉素
4. 病毒污染：
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参考文献
1．薛庆善 主编.体外培养的原理与 技术.北京：科学出版社，2001.2
2．鄂征. 主编.组织培养和分子细胞 学技术. 北京：北京出版社， 1994.12
3．司徒镇强.细胞培养.西安：世界 图书出版社公司西安分公司.1996.
细胞培养基本技术
医学实验中心 闾宏伟
主要内容
细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养用液的配制 细胞培养的基本方法 培养细胞活力测定 细胞冻存和复苏 细胞培养的污染和检测
一、基本概念
细胞培养(cell culture)：在体外条件下，模 拟体内的生理环境，用培养液维持细胞生 长与增殖的技术。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小 片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵 育，细胞自其周围移出并生长。 器官培养 (Organ culture)：将活体中整个 器官或一部分器官取出，置于体外生存、 生长并同时保持其一定的结构和功能特征。
血清解冻步骤
逐步解冻法
–20℃ 或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室 温下全溶后再分装，一般用50 ml无菌离心管可 分装40～45 ml。
勿直接由–20℃至37℃解冻，因温度改变 太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
无机盐
CaCl2 、KCl 、MgSO4、 NaCl 、 NaHCO3 、NaH2PO4 对调节细胞渗透压、某些酶的活性 及溶液的酸碱度都是必须的。
酶液等均采用滤过法除菌。
安装滤膜时注意：滤膜光滑一面是正面，要朝
上，否则起不到过滤的作用。
CO2培养箱
CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2 使用CO2培养箱应注意的问题：
。
①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，
以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净，定期消毒擦拭。 ③箱内蒸馏水槽中定期更换灭菌蒸馏水3000 毫升，以保持箱内湿度。
抗生素溶液
通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗 溶液”。
细胞培养基础知识
细胞培养基础知识细胞培养呀，就像是在一个小小的世界里创造生命的奇迹！咱就说，细胞可是生命的基本单位呢，培养它们就像是在照顾一群娇贵的小宝贝。
想象一下，你要有一个超级干净的“家”给它们住，这个“家”就是培养皿啦。
培养皿得干净得像刚洗过的脸一样，不能有一点儿脏东西，不然细胞宝宝们可不高兴啦。
然后呢，你得给它们准备好吃的，这就是培养液啦。
培养液就像是细胞的大餐，里面有它们需要的各种营养成分。
就好比咱人得吃米饭、蔬菜、肉一样，细胞也需要它们特定的营养来茁壮成长呀。
温度也很重要哦！不能太冷也不能太热，得刚刚好，就像咱们睡觉要盖合适的被子一样。
要是温度不合适，细胞可就不开心啦，可能就长不好咯。
还有哦，你得时刻关注它们的成长情况。
这就像家长关注孩子的成长一样，看看它们有没有长大呀，有没有生病呀。
要是发现有不对劲的地方，就得赶紧想办法解决。
培养细胞也得有耐心呀！不能着急，得慢慢等它们长大。
有时候可能等了好几天也看不到明显的变化，但别灰心，说不定它们正在偷偷努力呢。
而且呀，培养细胞可不能粗心大意。
就像你照顾小婴儿，一点小疏忽都可能带来大问题。
比如说不小心污染了培养皿，那可就糟糕啦，细胞可能就全军覆没了。
你说这细胞培养神奇不神奇？通过我们的努力，能让这些小小的细胞在我们的眼皮子底下成长、分裂，就好像看着一个小生命在慢慢绽放。
这感觉，真的很奇妙呀！培养细胞的过程中也会遇到各种挑战呢。
有时候细胞就是不长，你就得绞尽脑汁想办法，是培养液有问题？还是温度不合适？或者是其他什么原因。
这就像是解一道难题，得不断尝试、探索，直到找到答案。
细胞培养可不只是在实验室里玩玩哦，它对医学、生物学等好多领域都有着非常重要的意义呢。
通过培养细胞，我们可以研究疾病的发生机制，可以测试药物的效果，还可以为再生医学提供帮助呢。
总之呢，细胞培养是一件既有趣又有意义的事情。
虽然有时候会遇到困难，但只要我们有耐心、细心，就一定能让这些小细胞在我们的手中绽放出绚丽的光彩！难道不是吗？原创不易，请尊重原创，谢谢!。
细胞培养技术17577PPT课件
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整个细胞周期可划分为G1 → S → G2 → M → G1，如下图所示：
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细胞生长曲线
体外培养的细胞生长达到一定密度后，都需传 代。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细 胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、 细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增 加与饱和速度相对要快。连续细胞系和肿瘤细胞 系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多 时细胞增殖比少时快。细胞增殖一代，一般要经 过以下三个阶段：
凋亡发生的过程表现（细胞缩小→致密染色质 边集→核碎片→凋亡小体） 1、丧失了特殊的表面结构（微绒毛等）和接触 区，形成光滑的轮廓，从周围活细胞中分离出来 2、细胞缩小：①胞浆细胞器集中
②胞膜出芽或起泡 ③细胞皱缩；
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3、保持胞浆细胞器完整性
扫描电镜下，细胞表面呈奇特火山口样外观，① 线粒体不肿胀，内膜不破裂；②短暂滑面内质网 （SEN）扩张，扩张间隙与细胞表面融合；③有 时有聚积排例的半结晶状核糖体；④可有与细胞 表面平行的微丝束。
取材 无菌环境中，从机体取出某种组织（视实验目的
而定），经过一定的处理（如消毒、消化分散等） 后接入培养器血中，这一过程称为取材。取材后 应尽快培养，因故不能马上培养时，置4℃的培养 液中保存，但时间不能超过24h。取组织时应严 格保持无菌，同时也要避免接触其他有害物质。 取病理组织、皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌， 为减少污染，可用500～1000单位/ml青、链霉素 的PBS液漂洗5～10min。 （无论是传代培养还是原代，对细胞进行操作切 记：细心，专心，动作要轻）
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细胞培养必备知识
注意：
1.打开培养箱时尽量不要说话； 2.步骤9中培养瓶放入培养箱时，应把盖子拧开少许。
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传代
1.把细胞培养瓶从培养箱中拿出，拧紧盖子； 2.观察瓶内培养基的颜色，是否浑浊等；放在 倒置显微镜下观察细胞生长状况。 3.放入超净工作台内，点燃酒精灯，拿培养瓶 口在酒精灯火焰上转两圈以上，至少三秒。 4.取下盖子，烧瓶口；倒掉培养基，烧瓶口； 5.拿出PBS瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞 子取出，烧瓶口（至少10圈）。
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三、在肿瘤学中的应用
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肿瘤细胞生物特性学研究
–比较肿瘤细胞与正常细胞在体外培养条件下生 长行为的差异，研究肿瘤细胞生物学特性的改 变，对于建立诊断标准有益。 肿瘤细胞体外生长形态学研究 肿瘤细胞生长特性 细胞接触抑制实验
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肿瘤发病机制研究
–肿瘤产生诱发因素的研究 –肿瘤细胞侵润机制和过程的研究 –肿瘤与正常细胞 共同培养法
研究肿瘤药物筛选
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异种移植研究
裸鼠发现与应用 建立了动物移植瘤模型
抗肿瘤药物筛选
研究肿瘤细胞调亡以及肿瘤细胞体外分化 又成为新热点
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生物治疗
–活细胞---体细胞---体内
–活化细胞（LAK）---患者
–组织---悬液---培养---回输机体
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细胞培养：
一、原代培养
二、传代培养
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一
原代培养
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6. 烧瓶口，镊子和盖子；盖上盖子， 在倒置显微镜下观察。 7. 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内. 注意： 步骤2中，蒸馏水不要没过冻存管口 所有步骤结束过24小时后一定要换液；
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6.用吸管吸取3ml的PBS，打入培养瓶内。烧培养 瓶口，来回晃动PBS100次后到掉PBS。重复此 操作一次。 7.拿出胰酶瓶子，烧瓶口和镊子；用镊子将塞子取 出，烧瓶口（至少10圈）。 8.用吸管吸取1ml的胰酶，打入培养瓶内，烧培养 瓶口和盖子，盖上盖子； 9.拿出工作台外，在倒置显微镜下观察细胞，然后 用酒精棉球擦瓶口及瓶身，放入培养箱内；5分钟 后取出；
细胞培养基本知识基本技术
医学院 中心实验室 谷景义 85225841
主要内容： •1、细胞培养基本知识 •2、培养细胞生长环境 •3、细胞培养基本技术
•4、培养细胞质量控制
一、 细胞培养
• 把取得的组织用机械或消化的方法分 散成单个细胞，用培养基制成细胞悬 液，在体外适宜条件下，使细胞生长 繁殖，并保留其一定的结构和功能特 性。
二、培养细胞生长环境
Cell Culture Environment
Substrate Gas Medium Serum Supplements
Glass ﹠ Plastic Culture Vessels ……
O2 CO2
……
pH Osmolality Temperature ……
Hormones FBS Growth factors NCS Antibiotic ……
培养细胞的特性1 -生长方式及类型
• 贴附型、悬浮型
培养细胞的特性2 - 增殖特点
• 体外培养的细胞既保持了一定的体内细 胞的基本特性，但也具有本身的一些特 点。 • 贴附-伸展 • 接触抑制-增殖的密度抑制
贴附-伸展
接触抑制
• 当一个细胞被其他细胞围绕导致无处 可去而保持接触时，细胞不再移动， 在接触区域的细胞膜活动将停止。 • 因此，一般正常细胞并不相互重叠于 其上生长。
• 应用： • 软骨和骨组织（软骨细胞和干细胞，再生损伤的软骨、骨） • 循环系统和心脏（有目的地改变血管形成）
细胞培养技术的特点及应用
优点：
1）研究的条件可以人为控制 2）研究的样本均一 3）研究内容方便观察、检测、记录 4）研究的费用相对于经济
缺点：体外培养的细胞不能完全Байду номын сангаас同于体 内的细胞。
细胞培养基本知识
细胞培养在基因治疗方面也有很大作用。本实验室利用 培养的SY5Y细胞，通过将早老素基因PS-1转染入SY5Y细胞；而后，用RT-PCR证明转染有PS-1基因的细胞内部有PS-1 mRNA转录，用单抗检测细胞PS-1蛋白的表达。而后可用以检测细胞是否有早老现象。再用类似方法，我们可以研究细胞的钙通道以及其它药物作用的膜通道，从而指导临床药物应用，并据此来研究新的药物。
1.2 细胞培养的实验室要求
细胞培养要求较高，目的是使细胞能在无菌条件下存活。提取细胞的手术器具在每次使用之前应高温、高压消毒，配培养液的水要求用灭菌双蒸水并加入双抗。所用培养瓶、离心管等器皿最好为一次性。要在无菌室超净台上操作。每次操作之前，要用紫外灯照射工作台20-30min，然后将手洗干净，换拖鞋进入无菌间，将手用新洁尔灭喷洗一遍再操作。
2 以人血管内皮细胞为例说明细胞培养
由于细胞本身性质不同，其分离和培养方法也会有差异。其来源一般是新鲜脐带的脐静脉（来自于产后24h以内），具体的分离方法是：取新生儿脐带血(25 cm左右)，放入含青、链霉素各100U/mL的灭菌PBS中，4C保存，24h内进行实验。
2.1. 取材和原代培养
2009-05-29 17:35回复
白港人 ☆Gabri液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？
要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月~ 一年。
2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用及使用方法。
几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ?C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ?C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-20?C保存。
常用的细胞培养方法、污染及污染处理
常用的细胞培养方法、污染及污染处理一、本文概述细胞培养是生物学和医学领域中一种重要的实验技术，广泛应用于基础研究和实际应用。
通过模拟细胞在体内生长的环境，细胞在体外得以繁殖、分化并维持其特定功能。
本文旨在概述常用的细胞培养方法，包括培养基的选择、细胞传代、细胞冻存与复苏等，同时探讨细胞培养过程中可能出现的污染问题，包括细菌、真菌和支原体等微生物污染，以及污染的检测和处理方法。
通过本文的阐述，读者可以对细胞培养的基本流程和污染防控有更为全面的了解，为实验操作提供指导和参考。
二、常用的细胞培养方法细胞培养是生物学和医学研究中的核心技术，用于模拟体内环境，研究细胞生长、分化和功能。
以下是几种常用的细胞培养方法：贴壁培养法：这是最常见的细胞培养方法。
细胞在培养瓶或培养板的表面上贴壁生长，形成单层细胞。
这种方法适用于大多数哺乳动物细胞系。
悬浮培养法：某些细胞，如血液细胞、肿瘤细胞和某些干细胞，可以在液体培养基中悬浮生长。
这种方法不需要细胞贴壁，可以方便地扩大细胞数量。
微载体培养法：微载体是一种微小的、可以悬浮在培养基中的颗粒，通常用于大规模细胞培养。
细胞可以在微载体的表面上贴壁生长，从而增加细胞与培养基的接触面积，提高细胞生长效率。
三维培养法：这种方法模拟体内组织的三维结构，使用支架或凝胶等基质支持细胞生长。
它有助于研究细胞间的相互作用和组织的形成。
共培养法：将不同类型的细胞放在同一个培养环境中进行培养，以模拟体内细胞间的相互作用。
例如，将内皮细胞和肿瘤细胞共培养，可以研究肿瘤血管生成的过程。
在进行细胞培养时，需要选择适合细胞类型和实验目的的培养方法，同时严格控制培养条件，包括温度、湿度、pH值、营养成分等，以确保细胞的正常生长和繁殖。
三、细胞培养污染及其影响在细胞培养过程中，污染是一个常见且严重的问题，可能对细胞生长、实验结果和细胞治疗产生负面影响。
污染主要来源于微生物，包括细菌、真菌、支原体和病毒等。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
《细胞基本知识》课件
细胞治疗
细胞治疗利用干细胞等治疗疾病。
结论
细胞的重要性
细胞是生命的基本单位，研 究和应用广泛。
科学和医学应用
细胞研究在科学和医学上有 重要应用。
未来发展方向
细胞生物学是未来科学和医 学的发展方向。
细胞通过代谢作用进行能量转 化和物质合成。
生物合成
细胞通过生物合成生成复杂有 机物质。
分化和增殖
细胞可以分化成不同类型的细 胞，并通过增殖维持生命活动。
细胞的研究方法
1 细胞培养
通过培养细胞在实验室中进行研究。
3 细胞分离
将细胞分离为单个细胞以观察其行为。
2 细胞融合
将不同类型细胞融合以研究其特性。
4 细胞显微镜技术
使用显微镜观察细胞结构和功能。
细胞的重要性
1
生物学研究
细胞是生物学研究的基础，揭示了生命
医学应用
2
现象的机制。
细胞在医学上应用于细胞治疗和疾病诊
疗。
3
未来发展
细胞生物学的研究将推动科学和医学的 未来发展。
细胞相关的疾病
疾病的细胞学特点
细胞学揭示了疾病的细胞变化和 特征。
细胞学诊疗法
《细胞基本知识》PPT课 件
细胞是生命的基本单位，具有多种功能。本课程将介绍细胞的定义、基本结 构、种类，以及细胞的功能、研究方法、重要性和相关疾病。
什么是细胞
细胞定义
细胞是生物体的基本结构和功能单位。
细胞的种类
包括原核质和细胞核组成。
细胞的功能
代谢作用
cho细胞培养基础知识
cho细胞培养基础知识CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一种在生物医药领域中广泛应用的哺乳动物细胞系。
CHO细胞最早于1957年从中国仓鼠卵巢中分离出来，并在实验室中久经培养和改良。
CHO细胞系具有许多优点，如较高的细胞生长速度、易于培养和维持、对病毒感染的抵抗性等。
因此，CHO细胞系被广泛用于生物医药领域中的蛋白质表达、病毒疫苗生产和药物筛选等方面。
CHO细胞培养基是用于细胞培养的基本培养液。
它提供了细胞所需的营养物质和生长因子，同时维持细胞在体外的自由生长状态。
CHO细胞培养基的主要组成部分包括：基础培养液、补充物和 pH 调节剂。
基础培养液是细胞生长和繁殖所需的基本营养物质的来源。
CHO细胞需要一定的糖类、氨基酸、无机盐和维生素等营养物质来满足其生长和代谢的需求。
常用的CHO细胞培养基基础液包括 Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）和Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）等。
CHO细胞培养基的补充物主要包括血清和其他添加剂。
血清是CHO细胞培养中最常用的补充物之一，它提供了细胞生长所需的营养物质和生长因子。
然而，由于血清存在着传染病的风险、批次之间的变异性较大等问题，越来越多的研究者开始使用无血清培养基来代替传统的血清培养基。
无血清培养基通常采用人血浆蛋白替代血清，或添加其他生长因子、激素和细胞因子等来维持细胞生长。
除了血清外，CHO细胞培养基中还可以加入一些其他的添加剂来提高细胞的生长和产物表达。
例如，普通培养基PI值较低，而加入polyethyleneimine（PEI）或lipofectamine（LF）等转染试剂能够提高细胞的转染效率。
此外，亲和调节因子、抗氧化剂和基因选择素等也是常用的培养基添加剂。
pH 调节剂是控制CHO细胞培养基 pH 值的重要组成部分。
养细胞实验内容
养细胞实验内容细胞培养是生物学研究中非常重要的实验手段之一，可以用于探究细胞的生理、生化和分子机制，研究细胞的生长和分裂，以及对细胞进行基因转染和药物筛选等。
以下是关于细胞培养实验的一些相关参考内容：1. 细胞培养基的配制细胞培养基是细胞培养的基础，一般由多种物质组成，包括无机盐、氨基酸、维生素、有机物、生长因子和血清等。
常见的培养基有DMEM、RPMI-1640、F12等，不同类型的细胞适用不同的培养基。
细胞培养基可以根据需求进行调整、添加抗生素和调节pH值等。
2. 细胞分离和传代当细胞培养达到一定密度时，需要进行细胞的分离和传代。
一般方法是使用胰酶或胰蛋白酶等消化酶将细胞从培养基表面或底部脱落。
然后将细胞悬浮于新的培养基中，经过离心沉淀后将上清液抽取，用新的培养基代替旧的培养基。
细胞传代的目的是为了维持细胞的分裂活力和生物学特性。
3. 培养皿的处理和细胞接种在细胞培养实验中，培养皿的处理非常重要。
最常用的培养皿是培养瓶和96孔板。
接种前需要将培养皿消毒，可以用70%酒精或紫外线照射等方法。
接种时需要将细胞悬浮液均匀均匀地滴在培养皿表面或孔底。
细胞密度的控制对细胞培养的成功至关重要。
4. 细胞培养条件的调节细胞培养对温度、湿度、CO2浓度和氧气浓度等环境条件有较高的要求。
细胞通常在37℃、5% CO2浓度和95%湿度的培养箱中培养。
细胞培养箱需要定期检查和校正，以确保细胞的最佳生长条件。
培养皿的密封性和通气性也是需要考虑的因素，可以使用无菌的高含氧的帽子。
5. 细胞的药物处理和基因转染细胞培养实验可以用于药物的毒性和疗效检测、基因功能研究以及基因转染等。
药物的处理一般是将药物溶液加入到培养基中，接种细胞后培养一段时间，然后进行细胞活力、分化状态等的检测。
基因转染常见的方法包括质粒转染、RNA干扰等，可通过改变细胞的基因表达和信号转导途径来研究细胞的功能和机制。
总结起来，细胞培养实验内容包括细胞培养基的配制、细胞分离和传代、培养皿的处理和细胞接种、细胞培养条件的调节以及细胞的药物处理和基因转染等。
细胞培养知识大全
细胞培养实验技术大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
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• 不耐热液体：过滤除菌；
• 不耐热物品：射线灭菌30min，70%乙醇擦拭。
灭菌方式的选择
项目 玻璃器皿 金属制品 带螺口盖的玻璃品 玻璃移液管 枪头 消毒方式 干热 干热 高压灭菌，将盖悬 松 干热 高压灭菌 高压灭菌 琼脂 蛋白胨 EDTA 甘油 过滤 氨基酸 抗生素 牛血清白蛋白 胶原酶
HEPES 甲基纤维素
新鲜培养基，为其提供更多继续生长的空间。
• 细胞系：首次传代培养后，原代培养物即被称为细胞系。 • 细胞株：如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中
明确地选择出来，就成为一个细胞株。
细胞培养基本概念
• 有限细胞系与连续细胞系：正常细胞通常只能分裂有限的次数，随后 就会丧失增殖的能力，这是一个由遗传决定的事件，被称为衰老；这 种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系。但是，一些细胞 系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系，这一过程可自然发生， 也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力 后，就成为连续细胞系。 • 培养条件：细胞培养的人工环境必须包括合适的容器，容器中含有一 定的基质或介质，为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、 维生素、矿物质 )、生长因子、激素和气体 (O2、CO2)，并可调节其 物理化学环境 (pH、渗透压、温度)。
湿热灭菌121℃，20min（高速离心管尤其注意灭菌时要直立放
臵）； • 自然冷却后臵于烘箱中烘干。
水的制备和灭菌
• 细胞培养需要用超纯水（UPW）； • 第一：反向渗透或蒸馏；第二：碳过滤去除有机或无机胶 体（总有机碳TOC ≤10ug/L）；第三：去离子（电阻 ≥10MΩ/cm）； • 高压灭菌121℃，20min，自然冷却。
配置完全培养基
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水，臵于磁力搅拌器上，设定200r/min，边搅 拌边加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉（已含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠）； • 用注射器吸取超纯水，将包装袋内残留培养基洗下； • 干粉溶解后加入2.438g NaHCO3，搅拌至完全溶解； • 用HCl和NaOH调节PH为7.2，过滤除菌后（PH接近7.4）4℃保存； • 商业胎牛血清一般是热灭活的，可以直接使用，如果需要过滤，先用 0.22μm滤器过滤后，再用 0.1μm滤器低压过滤才能保证无菌、无支 原体。 • 双抗：称取氨苄青霉素 0.625g ，链霉素 1g ， PBS 定容至 100ml ， 4℃过 夜，过滤除菌分装。 • 使用时如需配臵 200ml 完全培养基，需加入 180ml DMEM/F12 ，加入 20ml胎牛血清 ，再加入2ml双抗即可。 • 使用时再加入血清的好处是DMEM/F12培养基可以4℃保存6~9个月，而 加入血清后只能保存2~3周。
PBS的制备
• 烧杯中加入1L灭菌超纯水； • 放在磁力搅拌器上，设定转速200r/min； • 打开PBS干粉（1L装）加入烧杯中； • 搅拌至完全溶解； • PH计检测PH为7.4，变化＜0.1； • 分装至灭菌的储液瓶中，盖子只轻旋一圈，放入灭菌锅中湿热灭菌；
• 自然容器或无菌吸管的上方往来。
• 倒出液体：任何时候都不要从试剂瓶或培养瓶中直接倾倒培养 基和试剂。
小结
• 保持一个干净有调理的工作空间，并仅在需要的时候才在 其中工作。 • 尽可能的预先准备好再开始操作，使培养物在培养箱外停 留最短的时间，而且要做到各种操作快速、简便和顺利。 • 保持能看到操作面上的每样东西，时时警惕无菌面和非无
细胞培养中的无菌操作
• 加盖：所有试剂瓶子要用深螺旋的聚丙烯盖子，使用时要将盖 子口朝下放臵在工作区域，不用时要及时盖好，但可以不用旋 紧。 • 灼烧：开放工作台才需要灼烧，细胞培养用的洁净台中不需要
也不建议灼烧、明火既破坏了层流又难以除去生物危害物质，
还带来了火灾隐患，明火带来的高温还会影响 HEPA过滤的寿命。 • 试剂瓶和培养瓶的操作：在洁净台内可以使试剂瓶口敞开直立，
•
• 气流可以呈水平方向，与工作 台面平行吹过，或者也可呈垂 直方向，从通风橱上方吹向工 作台面。
• 细胞培养通风橱通过维持工 作区域上方稳定、单向的 HEPA过滤空气流动，保护工 作环境免受灰尘及其他空气 污染物污染。
准备与灭菌
灭菌方式的选择
• 热稳定的物品（玻璃器皿、金属）用干热灭菌： 160 ℃， 1h； • 热稳定的液体：水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品：硅 树脂、尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯用湿热灭菌： 121 ℃， 20min；
• 使用前24~48h，放入干热灭菌箱中，160℃灭菌1h，自然冷却后
使用； • 100目和600目的筛网需要超声清洗。
塑料制品的清洗和灭菌
• 将塑料制品放入含有消毒剂（次氯酸钠）和清洁剂（Decon）的 洗液中浸泡30min，自来水冲洗干净； • 臵于超声清洗器中清洗30min； • 用自来水充分清洗后用去离子水清洗（塑料制品要用专用的刷 子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗）； • 将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来，直立放入灭菌锅中
酵母：培养物被酵母污染后 也会变得浑浊， 但pH 值变化 极小，污染严重时 pH 值才会 升高。在显微镜下，酵母呈 单个卵圆形或球形颗粒，有 些会芽生出较小的颗粒。图 为293细胞被酵母污染。
霉菌：是真菌界的一种真核微生物，以被称为菌丝的多细胞丝状体形式生长。 在显微镜下，菌丝体通常呈细束状纤维，有时呈较为密集的孢子团块。 病毒：是一种微观感染性物质，利用宿主细胞结构进行复制。病毒体积极小， 因而要检测培养物中有无病毒以及将其从细胞培养实验室所用试剂中去除都 十分困难。使用病毒感染的细胞培养物时却会对实验室工作人员造成严重的 健康威胁，特别是当实验室培养的是人或灵长类动物细胞时。
菌面的偶然接触。
• 实验完毕后，保持工作区的干净整洁。
污染
• 化学污染：培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂 和去污剂； • 生物污染：细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细 胞系的交叉污染。
细菌：通常被细菌污染的培养物呈云雾状 (即：浑浊状)，有时表面会覆盖一层 薄膜。另外，经常还会发现培养基的 pH 值突然降低。在低倍显微镜下可见， 细菌为细胞之间移动的微小颗粒，在高倍显微镜下观察可以分辨出各个细菌的 形状，有球状、杆状和螺旋状等。图为被大肠杆菌污染的293细胞
• 培养细胞时，尽可能选购带渗透盖的培养瓶，不仅可以在CO2环
境中迅速达到平衡，而且不会有污染的危险。
细胞培养中的无菌操作
• • 紫外灭菌：洁净台使用前、使用中的间隙、使用后都要用紫外灭菌，但 光束的有效性有限，因为它不能达到缝隙中。 70%酒精擦拭：洁净台使用前、使用中有溢出物、使用后都要擦拭，各种 试剂瓶、储液瓶、培养瓶、培养板和培养皿，放入洁净台之前，必须用 70% 乙醇擦拭其外部，注意要选用抗乙醇的记号笔。
细胞培养实验室
隔间 走廊
二更 一间 二间 三间
一更 准备室
细胞培养设备
• 基本设备： • 细胞培养通风橱 (即：层 流通风橱或生物安全柜) • 培养箱 (推荐使用湿式二 氧化碳培养箱) • 水浴锅 • 离心机 • 冰箱和冰柜 (–20°C) • 细胞计数器 (例如： Countess® 自动细胞计数 器或血球计数器) • 倒置显微镜 • 液氮 (N2) 冷冻柜或冻存 容器 • 灭菌器 (即：高压灭菌器) • 扩增设备： • 抽吸泵 (蠕动泵或真空泵) • pH 计 • 共聚焦显微镜 • 流式细胞仪 其他用品： • 细胞培养容器 (例如：培 养瓶、培养皿、滚瓶、 多孔板) • 吸管和移液器 • 注射器和针头 • 废物容器 • 培养基、血清和试剂 • 细胞系
流）； 随时移走不再需要的物品； 要在视野范围内操作； 如有任何溢出物需随时擦去，并用70%乙醇擦洗； 实验完毕要移走洁净台里的所有物品（什么都没有） ，并用70%乙醇彻底擦洗工 作面，然后紫外灭菌30min；
• • • • •
在通风橱中部开阔区域放臵细胞培养容器 移液器臵于右前方易于取用的地方 试剂和培养基臵于右后方，便于吸取 试管架臵于中后部，用于固定其他试剂 小型容器臵于左后部，用于盛放废液
细胞培养基本知识
细胞培养基本概念
• 细胞培养：从动物或植物中取出细胞，使其在合适的人工环境中生长。
• 细胞来源：细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离，
也可来自已经建立的细胞系或细胞株。 • 原代培养：是指将细胞从组织中分离后，使其在合适的条件下增殖， 直到占据所有可用基质(即：汇合) 的培养阶段。 • 传代培养：在细胞生长至汇合，必须将细胞转移到新的容器中并更换
• 自己配臵的所有试剂、培养基和溶液必须采用适当的灭菌方法
(例如：高压蒸汽、无菌过滤) 进行灭菌。 • 引进的培养物（如购买的细胞系）是高危污染源，要先经过检 疫，并坚持用不含抗生素的培养基培养直至证明没有污染。
细胞培养箱的无菌
• 培养箱是主要的污染源，应每学期做彻底清洁（箱体、架子、 隔板、托盘），可用70%酒精充分擦拭，并完全挥发晾干。 • 培养箱使用时底部湿盘要加入1%硫酸铜。
•
移液：使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体；每支吸
管只能使用一次，以免交叉污染。使用时方可打开无菌吸管的包装。吸 管应始终位于工作区域内。
•
一般移液操作用移液管和电动移液器，微量移液操作（1ml及以下）用移
液器，一次为多个器皿分装液体用注射器，只有灭菌的部分（移液管、 枪头、 注射器）可以伸进无菌容器内（储液瓶、细胞培养瓶），移液时 避免使吸管尖端触碰到任何非灭菌物品包括瓶口螺纹的外缘。
酚红 盐溶液 水
药物 谷氨酸盐
生长因子 HCL NaHCO3 NaOH 血清 丙酮酸钠 胰蛋白酶
离心管(5ml，15ml， 高压灭菌，直立放 50ml) 置 EP管(1.5ml，2ml， 5ml，10ml) 试管 高压灭菌 干热
艾本德移液器（新） 高压灭菌，整支