细胞培养基础知识
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧
细胞培养技术中的基础知识与操作技巧细胞培养技术是现代生物学和医学领域中不可或缺的技术之一。
利用细胞培养技术，我们可以研究细胞生长、发育、分化、疾病等方面的基本问题，也可以应用于药物筛选、细胞治疗、工程组织等领域。
本文将向您介绍一些细胞培养技术中的基础知识和操作技巧。
一、选择培养物在进行细胞培养之前，首先需要选择合适的细胞种类和培养物。
常见的培养物包括DMEM、RPMI1640、MEM等等，不同的培养物适用于不同类型的细胞，具体应该根据细胞种类和实验需求来选择。
此外，培养物中一般也会添加一些重要的成分，如胎牛血清、人血清、靶向蛋白、激素等等，这些成分的含量和种类也会影响细胞的生长与生理状态。
二、细胞培养的基本步骤细胞培养的基本步骤包括细胞的分离、细胞的培养和细胞的观察与分析。
1. 分离细胞分离细胞是细胞培养中的关键步骤之一，通常采用酶消化法和机械法两种方式。
通过酶消化法，可以使细胞与培养皿表面解离，从而得到单个或小团细胞；而机械法则是通过振荡或刮擦来达到分离细胞的目的。
2. 细胞的培养将分离好的细胞加入到预先涂覆有培养物的培养皿中，并将培养皿置于恒温箱（37℃，5% CO2）中培养。
在细胞生长的过程中需要定期更换或添加培养物。
3. 细胞的观察与分析细胞的观察可以通过显微镜来实现，观察细胞形态、大小、数量、移动等生长状态；而细胞的分析则可以利用细胞计数仪、细胞分选仪、PCR等技术，对细胞进行数量统计和功能评估。
三、细胞培养常见问题及应对方法在进行细胞培养的过程中，常会遇到一些问题。
例如，细胞不能够生长或生长缓慢；细胞死亡严重；细胞感染等等。
以下是一些常见问题以及针对问题的解决方法：1. 细胞不能够生长或生长缓慢这种情况可能是培养物失活或者浓度不足，这时候需要更换新鲜的培养物，或者调整培养物的含量。
2. 细胞死亡严重细胞死亡可能是由于细胞抗性引起的，这时候可以根据细胞类型来调整培养条件和细胞密度；另外，也有可能是由于感染、缺氧等过程中引起的，需要及时采取相应的处理措施。
细胞培养基本知识基本技术
– 絮状物：血清中的脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成， 这些絮状物不会影响血清本身的质量。可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理
– 显微镜下“小黑点”：经过热处理过的血清，沉淀物的形成 会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点”，常 误认为血清受污染。一般情况下，此小黑点不会影响细胞生 长，但如果怀疑血清质量，则应立即停止使用，更换另一批 号的血清
• 原代细胞：从机体取得组织材料，在体外
培养生长，到第一次传代前。
• 传代细胞：当原代细胞持续生长繁殖一段
时间，达到一定的细胞密度后传代的细胞。
培养瓶培养法
方法： 将培养对象直接接种于培养瓶内，再放
入培养箱进行培养。
优点： 1、可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养物 的影响。 2、可以方便地进行显微镜观察、染色等操作， 以及永久保存。 3、增加了培养瓶的培养面积。
• 1943年Earle、Dulbecco等创建单层细胞培 养法，首建长期传代的L-细胞系。
• 1951年Gey首建人肿瘤细胞——Hela细胞系。
• 从50年代末开始，组织培养技术应用进入 了一个繁盛的阶段，广泛应用于生物学和 医学研究各个领域。
无血清培养
无血清培养基:是不需要添加血清就可以维持细胞在
缺点：体外培养的细胞不能完全等同于体 内的细胞。
应用
• 病毒学：病毒鉴定，病毒抗原作用，疫苗生产…… • 免疫学：杂交瘤-单克隆抗体…… • 遗传学：染色体分析…… • 肿瘤学：筛选重要的抗肿瘤药物…… • 分化及发育：刺激使细胞群体发生改变…… • 细胞毒实验：药效测试…… • 临床医学及生物技术：干细胞培养定向诱导分
化后移植；组织工程软骨损伤修复；试管婴儿……
实验室细胞培养基本知识
引言：实验室细胞培养是一种重要的生命科学研究技术，通过体外培养细胞，可以模拟人体内的生理和病理状态，加深对细胞生物学和疾病机制的理解。
本文将介绍实验室细胞培养的基本知识，包括培养基的组成、细胞培养的种类、培养条件的调节等方面。
概述：实验室细胞培养是指在人工设备中，提供合适的环境条件，以维持细胞的生长和增殖。
细胞在培养基中不仅可以扩增，还可以进行各种实验室研究，如细胞凋亡、基因表达、药物筛选等。
下面将分五个大点详细介绍实验室细胞培养的基本知识。
一、培养基的组成：1.细胞培养基是由培养基基础组分和辅助组分构成的。
基础组分包括无机盐溶液、有机物、能量源、氨基酸等，辅助组分包括生长因子、激素、抗生素等。
2.常用的培养基有DMEM、MEM、RPMI1640等，其组成根据细胞类型和研究目的可有所差异。
3.细胞培养基的pH值、温度和储存条件对细胞生长至关重要，应根据细胞类型调整。
4.无菌技术在培养基制备过程中非常重要，避免细菌和真菌污染对细胞的影响。
二、细胞培养的种类：1.原代细胞培养是从组织中分离得到的初代细胞，细胞数和传代次数有限。
2.细胞株是从原代细胞培养中筛选得到的具有增殖潜能的细胞系列。
3.基于细胞的特定表型、遗传改造或药物处理的细胞系，可用于特定研究领域，如癌症研究、药物筛选等。
4.三维细胞培养技术可以模拟人体组织的三维结构和功能，提供更接近体内的环境。
三、培养条件的调节：1.细胞密度是影响细胞生长和增殖的重要因素，应根据细胞类型和实验需求进行优化。
2.培养温度应符合细胞体内温度，通常在37摄氏度下进行。
3.CO2浓度和通气情况对细胞生长至关重要，应根据细胞类型和培养基特性调节。
4.培养时间和细胞传代次数应根据培养基的要求和实验目的进行控制。
四、细胞检测与鉴定：1.细胞的染色方法是常用的细胞检测方法之一，包括细胞核染色、细胞分子染色等。
2.细胞增殖和凋亡的检测方法有CFSE染色、MTT法、流式细胞术等。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程1．原代培养（primary culture）直接从有机体中取出的细胞、组织或器官开始进行体外培养直到第一次传代为止。
这种培养称之为原代培养。
2．传代培养（subculture）细胞从一个培养皿以1：2或1：2以上的比率转移或移植到另一个器皿的培养，这种培养称之为传代培养。
3．悬浮培养（suspension culture）细胞培养的一种类型。
培养时通过一特殊的装置，使细胞瓶按一定的速度不断地转动，使细胞始终处于悬浮状态中进行增殖。
4．克隆（clone）克隆指的是从一个细胞靠有丝分裂获得的一个细胞群体（population）。
5．细胞系（cell line）在第二届细胞和组织培养专题讨论会上提出细胞系的概念为“原代培养物经首次传代成功后即成为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（lineages of cells）所组成。
如果不能继续传代或传代数有限，可称有限细胞系（finite cell line），如果可以连续传代，则可称为连续细胞系（continous cell line）。
以前认为细胞系来自细胞发生了遗传突变，并带有癌变的特点，这种细胞有可能在培养条件下无限的传下去。
这种细胞的特点是染色体为异倍体，丧失了正常细胞的“接触抑制”的特性。
6．细胞株（cell strain）细胞株的概念如下：由原代培养中，用选择或克隆代，选出具有特征标记的细胞，经传代形成细胞株，这些特性或标记在以后的培养中必须保持下去。
以前认为经体外传代培养后细胞不表现退化现象，大约可传50代以上者，其染色体维持二倍体不变，保留正常细胞的“接触抑制”等特性。
一常用设备一准备室的设备：双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品柜（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
细胞培养基本知识
（2） 传代期培养：初代培养的细胞生长到一定 程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常 二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代， 此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、
停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。
这一转折点有人称之危象临界点（crisis），有 些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞 可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们 称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。
（3） 细胞作为生命活动的基本单位的共同特点： 首先所有细胞 表面均有一层脂蛋白成分的生物 膜，即细胞膜，使细胞能与周围环境保持相对独 立性； 其次，所有细胞都有两种核酸，即DNA和RNA 作为遗传信息的复制和转录的物质基础； 第三作为蛋白质合成的“机器”-核蛋白，是一 切细胞不可缺少的基本结构； 第四所有细胞都是以一分为二的分裂方式增殖。 第五，细胞具有多样性，形状、大小悬殊很大， 结构复杂程度也很不一样。
株（Cell strain)
4. 组织（细胞）培养的医学生
物学意义
（1） 培养的组织器官或细胞，能在一定范围和 程度上反映生命活动规律和机体功能特点。培养 的细胞为生命科学和生物医学各种研究奠定了物
质基础
（2） 细胞培养与生物工程：细胞培养技术已经 成为商品化生物技术的核心。如目前可提供的产 品，病毒疫苗：口蹄疫、狂犬疫苗、乙肝疫苗； 非抗体型免疫调节剂：干扰素、白介素、集落刺
（3） 衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生 增殖缓慢，逐 渐停止，进而发生衰退、死亡， 多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所
谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，
这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人 胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人 的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。
细胞培养相关知识点
细胞培养相关知识点
细胞培养是指将细胞从体内或体外来源中采集到培养基中，通过提供合适的营养物质和环境条件使其在体外无限制地生长和繁殖的一种生物学实验技术。
常见的细胞培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
1. 培养基：细胞培养中使用的培养基是包含多种营养物质的液体或固体培养基。
常见的培养基种类包括DMEM、RPMI-1640、MEM等，并根据细胞的类型和特殊需要进行相应的改制。
2. 细胞分离：通过一系列的操作将组织中的细胞分离出来，常用的方法有机械剪切、酶消化和离心等。
3. 细胞传代：细胞的传代是指将细胞从旧的培养皿中转移到新的培养皿中，以保持细胞的生长状态和增殖能力。
细胞传代的方法有裂解法、胶原酶法和选择性黏附法等。
4. 培养条件：细胞的生长需要适宜的温度、湿度、pH值和气体环境。
常见的培养条件为37℃、5% CO2和95%湿度。
5. 防止细胞污染：细胞培养中常见的污染源有细菌、真菌和支原体等。
常用的防止污染的方法包括消毒培养器具和介质、使用无菌操作等。
6. 细胞检测：常用的检测方法包括细胞形态观察、细胞数量计
数、细胞活力测定、染色体核型分析和细胞分化等。
7. 细胞培养的应用：细胞培养技术在生物医学研究中有广泛的应用，如药物筛选、疾病模型建立、组织工程和基因工程等。
注：以上所列举的知识点为细胞培养的基本内容，具体的细胞培养操作方法和技巧可根据具体实验需求和细胞类型进行进一步学习。
细胞培养基本知识
细胞培养在基因治疗方面也有很大作用。本实验室利用 培养的SY5Y细胞，通过将早老素基因PS-1转染入SY5Y细胞；而后，用RT-PCR证明转染有PS-1基因的细胞内部有PS-1 mRNA转录，用单抗检测细胞PS-1蛋白的表达。而后可用以检测细胞是否有早老现象。再用类似方法，我们可以研究细胞的钙通道以及其它药物作用的膜通道，从而指导临床药物应用，并据此来研究新的药物。
1.2 细胞培养的实验室要求
细胞培养要求较高，目的是使细胞能在无菌条件下存活。提取细胞的手术器具在每次使用之前应高温、高压消毒，配培养液的水要求用灭菌双蒸水并加入双抗。所用培养瓶、离心管等器皿最好为一次性。要在无菌室超净台上操作。每次操作之前，要用紫外灯照射工作台20-30min，然后将手洗干净，换拖鞋进入无菌间，将手用新洁尔灭喷洗一遍再操作。
2 以人血管内皮细胞为例说明细胞培养
由于细胞本身性质不同，其分离和培养方法也会有差异。其来源一般是新鲜脐带的脐静脉（来自于产后24h以内），具体的分离方法是：取新生儿脐带血(25 cm左右)，放入含青、链霉素各100U/mL的灭菌PBS中，4C保存，24h内进行实验。
2.1. 取材和原代培养
2009-05-29 17:35回复
白港人 ☆Gabri液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？
要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月~ 一年。
2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用及使用方法。
几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ?C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ?C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-20?C保存。
细胞培养基本知识技术
物质溶解其中。 • 4．大气的CO2溶解 （二）纯化水制备应注意事项： • 在准备室选择一处洁净、无尘、清静的地方放置纯
化水的装置。 • 所得的纯化水贮备在专用的干净玻璃瓶内，最好用
硼砂硅玻璃瓶内，标记上制备的日期。
• CO2培养箱是培养细胞的专用设备. • CO2培养箱培养细胞必须满足细胞生长的
三个条件. • 稳定的温度. • 大于95%的相对湿度. • 稳定的CO2浓度 • 三气培养箱是从CO2培养箱基础上发展出来
的新品种,它可同时控制O2浓度.
注意事项
• 1 用螺旋口瓶培养细胞时需将瓶盖微松，以保证 通气。但瓶口过松，易污染。
倒置显微镜
工作原理
一般情况下,人眼只能在光波的波长(颜色)和振幅(亮 度)发生变化时,才能看到被检测物体.但生活状态下的细胞 都呈无色透明,光线通过这些物体时波长和振幅并不发生 变化，因此用普通显微镜无法看清活细胞的形态和结构。 相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折 射率有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射 率小的物体中前进的距离较短，此距离叫光程差，由于光 程差引起光的相位变化称为相位差或相差。使用相差显微 镜可使肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差（即明 暗差），使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
（三）纯化水的常用制备方法
• 1.去离子法和石英双重玻璃蒸馏器法结合
• 水中含有溶解或不溶解的矿物盐、油脂及酸类， 以及O2,CO2,H2S,Cl2等。这些物质通过离子交换 树脂除去。
• 采用阳离子树脂或阴离子树脂处理。常使用强酸 性阳离子交换树脂和强碱基性阴离子交换树脂， 将水流通过离子交换柱即得纯净的去离子水。
细胞培养的基本知识
第一章细胞培养的基本知识第一节前言细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，包括单个细胞的培养。
具体说来，是指在无菌条件下，把动物或植物的细胞从有机体中分离出来，置于培养器皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和生长的方法。
广义上的细胞培养包括器官培养(organ culture)、组织培养(tissue culture)和细胞培养(cell culture)。
但因从组织块生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时发生移动，使得培养中的组织难以长时间保持其原有的结构，因此三者并无严格的区别。
一般所说的细胞培养，即包括器官培养、组织培养和细胞培养三层含义。
细胞培养的发展历史已近百年。
最初的细胞培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则的基础上，用天然体液(如胎汁、血浆)来维持从整体切下的组织块，以对细胞进行形态和功能的观察。
Harrison和Careel(1907, 1910)首创了盖片覆盖表玻璃的悬滴培养法，建立了离体培养组织和细胞的基本模式。
后来许多学者在培养容器、培养液和培养操作技术方面加以改进和革新：在卡氏瓶的启示下，设计出多种类型的培养瓶；培养基由天然动物血浆改进为合成培养基；促细胞生长物质从胎汁改为动物血清；Dulbecco(1957)等采用胰蛋白酶消化处理组织，获得了单层培养物，对细胞培养的发展起了积极的推动作用，单层培养遂成为细胞培养普遍采用的技术。
采用单层培养法建立了各种细胞系和细胞株，现在全世界储存的细胞株约有万种以上。
Sanford(1948)创立了单细胞分离培养法，应用这一技术可建立遗传性状相同的克隆细胞株(clone strain)。
今天的组织培养已可把多细胞机体中各种完整的细胞和组织从错综复杂的体内影响和相互关系中分离出来，置于离体因素的直接作用下，长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动过程，并可利用不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、同位素标记以及缩时显微电影等观察、记录和研究细胞。
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程
细胞培养实验基础知识和相关无菌操作流程细胞培养实验是指将动植物组织或细胞从体内分离并在无菌条件下培养的一种技术手段。
这种技术可以用于研究细胞的生物学特性、疾病的发生机制以及药物的筛选等方面。
以下是细胞培养实验的基本流程和无菌操作的相关知识。
一、细胞培养的基本知识1.细胞培养的种类：常用的细胞培养种类有原代细胞培养、细胞株的维持和传代培养以及细胞系的培养。
2.细胞培养的培养基：细胞培养的培养基可以分为无血清培养基和含血清培养基。
其中，无血清培养基是通过添加一定的生长因子和营养物质来满足细胞生长的需要，而含血清培养基则是使用含有细胞生长因子和营养物质的胎牛血清来供养细胞。
3.传代培养的液氮保存：为了保持细胞株的可用性，可以将细胞株保存在液氮中，以备将来使用。
4.细胞培养中的无菌操作：细胞培养实验需要在无菌条件下进行操作，以防止细胞污染和外源性菌落的输入。
1.工作台和操作区域的消毒：操作前，需要用75％的酒精或其他合适的消毒剂彻底清洁工作台面、培养箱、玻璃器皿等操作区域。
2.培养器具的消毒：需要对培养器具如离心管、移液枪、显微镜等进行高温高压的无菌处理。
3.培养基的制备和滤过：制备培养基时需要将培养基溶液进行高温高压的杀菌处理，并使用0.22微米的滤膜滤过杂质。
4.无菌技术的掌握：在细胞培养实验中，需要学习和掌握无菌技术，如无菌操作台、细菌灯和无菌手套等的正确使用方法。
5.细胞的分离和悬浮：将组织样本放入消化液中，进行细胞的分离和悬浮，并通过离心和过滤的方式获得单个细胞悬浮液。
6.细胞培养的接种：将细胞悬浮液接种在含有培养基的培养皿或离心管中，放入培养箱中进行培养。
7.细胞传代的操作：当细胞达到一定密度后，需要进行细胞传代操作。
传代操作时，需要将细胞悬浮液转移到新的培养皿中，并加入新的培养基进行细胞的维持和生长。
总之，细胞培养实验是生物学研究中不可或缺的一项实验技术，掌握细胞培养的基本知识和无菌操作流程对实验结果的准确性和可靠性至关重要。
第1章细胞培养的基本知识-10页word资料
第一篇细胞工程的基本技术——细胞培养技术第1章细胞培养的基本知识第一节基本概念和名词细胞培养(cell culture)技术即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于医学研究领域的重要技术。
它起源于1885年，德国人Roux用温生理盐水在体外培养鸡胚髓板，并使之存活了数月之久，第一次获得组织块人工培养成功。
1906年，Beebe和Ewing用盖玻片悬滴培养法，以动物血清做培养基，培养狗淋巴细胞存活了72小时，并曾见到细胞生长现象。
1907年，Harrison用淋巴液做悬滴培养，使来自两栖类胚胎神经组织的神经细胞存活了若干天，还观察到神经管细胞分化成了神经元，而且向培养液中伸出了轴突，与脑、脊神经细胞在体内分化的情况很类似。
以后Carrel进行了改进，并十分注意培养中的无菌操作技术。
他用血浆包埋组织块外加胎汁的培养法，通过采用更新培养基和分离组织的传代措施，完善了经典的悬滴培养法。
1923年，他又设计了用骨化瓶培养法，以扩大组织的生存空间。
50年代，组织培养技术有了更快的发展，从改进培养操作技术、培养器皿和培养基方面进行了改进。
各种培养瓶、培养基孕育而生。
1957年Dulbecco实验室采用胰蛋白酶消化处理，使成块的组织分散成单个细胞，进行悬液培养，从而开创了细胞培养技术。
用单层细胞培养法可以建立很多细胞系(cell line)，通过单细胞分离培养法又可建立克隆细胞株(clone或cell strain)。
细胞系(cell line)系原代培养经首次传代成功后即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。
细胞株(cell strain)系通过选择法或克隆形成法，从原代培养物或细胞系中获得的具有特定性质或标志的细胞群。
细胞株的这种特定性或标志必须在整个培养期间始终存在。
克隆(clone)系指由同一个祖先细胞通过有丝分裂所产生的遗传性状相同的细胞群体。
医学研究中泛指的体外培养包括细胞培养、组织培养和器官培养。
细胞培养基础知识
Hank`s液与D-Hank`s液 用途上的比较
• Hank`s液是组织培养基本用液，常用于配制 培养基及其他用液，或洗涤组织、细胞等。 细胞在Hank`s液中可以在一段时间内维持一 定的活力。另外Hank`s液还可以用于终止 EDTA的作用。 • 配制胰酶液或者是胰酶/EDTA的基础液都是 D-hanks 液，而不能使用Hank`s液。 这是由 于钙离子和镁离子会影响胰蛋白酶的活性， 也会阻碍EDTA的作用。
污染的预防
从物品、用品消毒 添加抗生素：联合应用比单用效果好 从操作者做起
常用抗生素用量和效应
抗生素 青霉素 链霉素 庆大霉素 四环素 卡那霉素 两性霉素
细菌
G+ GG+ /GG+ /GG+ /G-
抗菌谱 真菌
支原体
+ + + +
制霉菌素
+
浓度（量 /mL） 100～ 1000u 100～ 1000μg 50～200μg 10～50μg 100～ 1000μg 常用 2μg/mL 常用 25μg/mL
细菌污染
细菌污染较易发现，多数情况下培养液短 期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生， 出现明显混浊现象。倒置显微镜下观察，可 见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。
支原体污染
支原体是牛血清中最常见 的微生物之一，黑色的， 好象多为多形，培养液一 般会浑浊。
不能用过滤的办法除去
其他污染
黑蛟虫：低倍下为黑色点状，高倍 下可看见黑色的小虫游来游去，培 养液也是不浑的，一般不会太影响， 细胞还是可以用的。对细胞生长状 态不会有明显影响，在细胞增殖旺 盛之后会自然消失，除更换血清外 无须特殊处理。如果细胞有可能是 此种污染的话，可以增加细胞的种 板密度，以提高细胞的生存率。
细胞培养知识大全
细胞培养实验技术大全第一章细胞培养的基本原理与技术现代生物技术一般认为包括基因工程技术、细胞工程技术、酶工程技术和发酵工程技术，而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系，特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。
比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。
基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体；细胞工程中更是离不细胞培养，杂交瘤单克隆抗体，完全是通过细胞培养来实现的，既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养。
正在倍受重视的基因治疗、体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现，发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关。
总之，细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用。
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
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计数板上面，使之微微移向一侧，露出计数板台面少许； [2] 用移液枪在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样时不要溢出盖玻片也不能溢
入两侧的玻璃槽内，如果产生上述情况需对计数板冲洗和拭干后重新加样，加样量也 不要过少或带气泡； [3] 在显微镜下，用 10×物镜观察，可见细胞均匀分散计数板各处。计算四角大方格内 的细胞数，压中线者只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内(即仅计算压两个 边的细胞)，成团细胞按单个细胞计算。按照下面公式计算细胞密度： (细胞悬液的细胞数)/ml＝(四个大格子细胞数/4) ×稀释倍数×104 【注意事项】 [1] 消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。否则会影响细胞计数结果。 [2] 取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时，尤其要注意这一点。否则， 前后计数结果会有很大的误差。 [3] 镜下计数时，遇见 2 个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算。如细胞团 10%以 上，说明消化不充分；或细胞数少于 2 个/mm2 或多于 50 个/mm2 时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液、计数。 5 培养细胞的运输 装运细胞的方法有两种，一种为冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存， 保存效果较好，但较麻烦，且不宜长时间运输，多需空运。另一种简单的方法为充液法，步 骤如下： [1] 选择生长状态良好的细胞，可直接根据路程时间来选择接种细胞数量，一般以长满
【概述】
细胞计数法是细胞培养研究中的一项基本技术，它是了解培养细胞生长状态，测定培养 基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。常用的细胞技术有血球计数板计数法和电子 细胞计数仪计数法。 【用品】
血球计数板、吸管、胰酶、培养液、显微镜
【步骤】
[1] 准备计数板：用无水乙醇或 95%乙醇清洁计数板和盖玻片，待干燥后，把盖玻片覆在
1/3—1/2 瓶底壁为宜，去掉旧培养液，补充新的培养液到达瓶颈部，保留微量空气，
拧紧瓶盖，瓶口用胶带密封。
[2] 妥善包装运送，并用棉花等做防震防压处理。4—5 天液，仅保留维持细胞生长所需液量。37℃培 养，次日传代。 [3] 如果距离很近，如在统一城市内或数小时路程，也可将细胞附着面朝上，或把培养液 全部倒掉放在胸部口袋进行运送。仅靠附着于细胞表面的培养液，可使细胞短时间不 致受损。 6 多药耐药细胞的培养 多药耐药（Multidrug Resistance, MDR）是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，不仅对
第一节 细胞培养的相关技术
1 细胞的复苏 【概述】
复苏细胞要求快速融化的手段，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化。避免 由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。 【用品】
培养液、吸管、离心管、培养瓶 【步骤】
[1] 打开水浴锅，将温度调至 37 ℃； [2] 从液氮中取出冻存的细胞株，用镊子夹住冻存管（戴防护面罩），迅速置入 37 ℃的
液，接种于培养瓶中，置于 37℃、5% CO2、饱和湿度孵箱中培养； [5] 次日更换培养基，以后按常规培养方法进行培养。如果复苏时细胞密度较高及时传代。
细胞复苏时细胞密度以 5×105 个/ml。 2 细胞的传代 【概述】
培养细胞传代根据不同的细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴 壁生长但粘附不牢固的细胞也可以用直接吹打传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离 心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。 【用品】
微生物：真菌、细菌、支原体和病毒 化学物质：影响细胞生存的非细胞所需的化学成分 细胞：非同种的其它细胞 当然在培养中以微生物污染最为多见，化学污染较少；但近年随细胞种类增多,不同种细 胞交叉污染却屡有发生，以致在 ATCC 接受入库细胞中特设同工酶检测一项，目的在于证明 是否有 HeLa 等细胞的交叉污染。但细胞交叉污染只要工作细心，是容易防止的，而微生物 污染在实际工作中却是最难防止和易发生的。 1 污染途径 各种污染主要通过以下途径和媒介发生： [1] 空气 空气是扩散微生物的主要途径。由于空气流动性大，在操作场地与外界隔离不严 和消毒不充分的情况下，外界不洁空气很容易侵入造成污染。因此，培养设施不宜置于通风 场所。现各实验室普遍应用净化工作台，能产生无菌的屏障气流，可防止不洁空气污染。净 化工作台使用过久，过滤层受尘埃堵塞情况下，工作时不带口罩或外界气流过强、污染空气 均可进入操作野，导致污染。又不同季节和不同地区空气内含菌数不同；炎热夏季尤其南方 多雨地区空气湿度大、含菌数量多，工作应特别注意。空气是不断流动的；虽用消毒措施也 难以排出空气中所有微生物，但每立方米内含菌数不应超过 1--5 个。 [2] 器材 培养器皿和容器洗刷不净残留污物、培养用液灭菌不彻底等，都可引入有害物。 [3] 操作 实验操作马虎、动作不准确、消毒观念不强，使用的吸管、刀、剪沾染微生物等； 或封瓶口时不严，都可发生污染。同时培养两种以上细胞，操作不慎，使用同一吸管或培养
PBS（或 Hanks 液）、0.25%胰蛋白酶（或含 EDTA）、培养液、吸管、培养瓶 【步骤】
贴壁细胞消化传代法： [1] 用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基； [2] 用 PBS 洗二遍，以防止残留培养液中的血清对胰蛋白酶的抑制作用，向瓶内加入
0.5--0.8 ml 胰蛋白酶（以 25cm2），轻轻摇动培养瓶，使胰蛋白酶流遍所有的细胞表面； 加入的消化液适量，因为消化液过多对细胞有损伤，同时也需要较多的含血清培养液
悬液收集于离心管中，离心 1000 rpm，5-8 min； [3] 小心弃上清液，加入配置好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后将含有
细胞的冻存液转移到无菌的冻存管中，每个冻存管加液 1-1.5 ml，细胞最终密度为 （5—10）×106/ml； [4] 冻存管封口，做好标记，按照以下程序冻存：4℃，15min--20 min,﹣20℃ 30min--40 min，见细胞悬液结冻后，放入﹣80 ℃冰箱 3h 或过夜，之后置于液氮中。 【注意事项】 [1] 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好选择对 数生长期细胞，已经长满的细胞冻存复苏后生存率很低。在冻存前一天最好换 1 次培 养液。 [2] 将标记好并装入冻存管的支架，从液氮容器口缓缓放入，按 1℃/ min 的降温速度， 在 30-40min 时间内使其到达液氮表面。再停 30min 后，直接投入液氮中。 [3] 细胞在首次冻存后要在短期内复苏 1 次，观察细胞对冻存的适应性。 4 细胞的计数
去中和； [3] 消化最好在 37℃培养箱或室温 25℃以上的环境下进行消化，消化 2--5 min 后，把培
养瓶放在显微镜下观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大，细胞变圆后，立即将培养瓶 立起并加入少许含血清的培养液，终止消化； [4] 用无菌吸管反复吹打瓶壁细胞，吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另一 边结束，以确保所有底部都被吹打到；吹打过程中动作要轻柔，尽可能不要出现泡沫， 这些都损伤细胞； [5] 加入新鲜含 10%胎牛血清的培养液，然后将原培养瓶中的细胞悬液吸出，分别接种在 新的培养瓶中。 悬浮细胞的传代：因为悬浮生长细胞不贴壁，故传代时不用采用消化法，可直接传代或 离心收集细胞后传代。直接传代即让悬浮细胞慢慢沉淀在瓶底后，将上清洗掉 1/2—2/3，然 后用吸管吹打形成细胞悬液后，再传代。 悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，离心 800—1000r/min，5min，然后去除上清，加新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细 胞悬液，然后传代接种。 部分贴壁生长的细胞，不经消化处理直接吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。 但这种方法仅限于部分贴壁不牢的细胞，如 Hela 细胞等。直接吹打对细胞损伤较大，导致较 大数量的细胞丢失，因此绝大部分贴壁生长的细胞均需消化后，才能吹打传代。 3 细胞的冻存 【概述】 冻存细胞时要缓慢冷冻。因为细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻时，细胞内外的 水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。首先细胞脱水使局部电解质 浓度增高，pH 值改变，部分蛋白质由于上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞 内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细 胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能力代谢的障碍。胞膜上的类脂蛋 白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变、使细胞内容物丧失。细胞核内 DNA 也是冷冻时细胞易受损部分。如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造 成 DNA 的空间构型发生不可逆的损伤性变化，而引起细胞的死亡。 在细胞冻存时要尽可能的均匀地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成是减少细胞损 伤的关键。目前多采用甘油或者二甲基亚砜作为保护剂。这两种物质在深低温冷冻后对细胞 无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透
性；加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内冰晶的 形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。 【用品】
胰酶、含血清培养基、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（667.83kPa 蒸汽高压消毒）、 吸管、离心管、冻存管 【步骤】
[1] 用无菌吸管吸弃瓶内旧的培养基； [2] 加入少量 PBS 冲洗二遍， 用胰蛋白酶把单层细胞消化下来，依据传代的方法把细胞
第二节 细胞培养污染的检测和排除
组织培养细胞被有害物污染是组织培养工作的大敌。应用组织培养进行研究工作，除需 要好的实验设计和技术方法外，成败的关键还在于能否避免污染。一项好的研究,或建成的满 意细胞系，往往由于遭受污染而前功尽弃。因此，一个组织培养工作者,要始终注意防止污染。
培养细胞被污染，人们最注意的是真菌、细菌和病毒等微生物。现在看来已经不够，当 前“污染”一词的概念应该是，凡混入培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异 物，都应视为污染。从这一概念考虑，组织培养污染应包括以下几个方面：
水浴锅中，不断振摇冻存管，使之尽快融化，要在 1-2 min 内完成复温； [3] 完全融化后，取出冻存管，移至超净工作台，用 75%酒精擦洗消毒，用无菌吸管吸取