细胞培养基本实验操作.doc

细胞培养基本实验操作
一、细胞复苏
1)提前准备完全培养基并预热至37℃（可以放至在水浴或培养箱中进行预热，
需要多少预热多少，反复预热会导致培养基失活）；用清洗洁净的烧杯或其他合适容器装有适量超纯水，然后放入37-38℃水浴锅中预热至37℃（至少需30min）；把所需耗材和其他物品放置于超净工作台中紫外照射灭菌；
2)提前查询所取冻存管的存放位置，把整个存储架子提起，为了降低复温对其
它细胞的影响，可把该存储架子放置于装有液氮的泡沫盒中，快速（存储架离开液氮罐的时间不要超过1分钟，否则其余细胞容易复温死亡，冻存管子的液氮会气化爆炸）从液氮罐中取出冻存管并放置于装有液氮的保温杯中(必须用用洁净镊子取出冻存管，以免冻伤手)，立即把存储架回液氮罐；用镊子把刚才置于保温杯的冻存管取出，并立即（不要耽搁）放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中，以免进水污染），用镊子镊好冻存管，快速沿着容器内壁转圈，细胞未冻融时（1min 内）切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应弃用该管细胞，冻融后立即用70%酒精消毒该冻存管，然后立即放入超净工作台中；
3)打开冻存管盖，用移液管吹打细胞3次，然后立即把细胞转移至提前准备的
装有5-10ml预热的完全培养基的15ml或50离心管中；
4)离心（？RPM，？min，室温），小心移除上清；
5)加入5ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养
瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；
6)第二天观察细胞的贴壁情况，并进行换液；
注意事项：
1.细胞复苏操作要求快速，否则细胞容易在冻融过程中产生冰晶，从而导致细
胞死亡，所以必须提前准备好所需的培养基、培养耗材和其他所需物品，绝对不允许临时准备；
2.在解冻细胞前，必须把超净工作台准备至工作状态，提前准备装有5-10ml
预热的完全培养基的15ml或50离心管；
3.为了降低复温对其它细胞的影响，可把该存储架子放置于装有液氮的泡沫盒
中；
4.存储架离开液氮罐的时间一般不要超过1分钟，否则其余细胞容易复温死亡，
冻存管子的液氮气化爆炸；
5.放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中，以免进水污染；
6.细胞未冻融时（1min内）切勿取出观察；
7.根据复苏细胞的大小选择合适的离心速度和时间，一般不超过1000RPM,
10min；
8.复苏后的第二天必须要进行换液（加入培养基的量根据细胞的密度和生长速
度），以降低冻存保护剂DMSO的影响；
9.离心速度和时间依据具体细胞决定；
10.上述是以T25培养瓶为例，具体选用何种培养器皿取决于细胞生长密度需求
（启动正常生长所需的密度）；
二、细胞换液培养
1. 全量换液：把所有的旧培养液移除，加入新的培养液（加入培养基的量根据细胞的密度和生长速度）；
2. 半量换液：把旧培养液移至15或50ml离心管中，然后在培养器皿中加入适量新培养基（避免细胞离开培养液太久），把装有旧培养液的离心管进行离心（1000RPM, 10min），离心后，取适量旧培养上清至培养器皿中；
注意事项：
1. 全量换液适合于生长较快的肿瘤细胞，因为这些细胞可在短期内分泌足够的因子来支撑其生长；
2. 半量换液主要适合于生长较慢的原代细胞和干细胞，这些细胞很难在短期内分泌足够的因子来支撑其生长，旧培养液中恰好含有这些因子；
3. 新旧培养液的配比取决于细胞的密度和生长速度及其自身的特性，请参照具体细胞的培养建议，一般为3:1（新：旧）；
4. 如果细胞发生发生污染，切勿进行半量换液；
三、细胞传代培养
1、当细胞密度达到其生长密度极限时（一般肿瘤细胞为80-100%，原代细胞和干细胞为80-90%，有些细胞为40-50%，熟知所养细胞的生长密度极限），移除旧培养液；
2、用PBS洗涤两次（旧培养中的钙离子会抑制胰酶的活性），加入1ml胰酶消化液（以T25培养瓶为例），立即盖好盖子，把培养瓶置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入5ml 预热完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（？RPM，？min，室温），小心移除上清；
3、加入5ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取？细胞分装入T25培养瓶中，添加基至总体积为5ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔？天传代1次；
注意事项：
1、熟知所养细胞的生长密度极限；
2、第一次进行所养细胞传代时，消化时必须把培养瓶置于倒置显微镜下观察，并记录所需时间，下次按照该时间执行即可；
3、进行细胞传代时必须结合考虑细胞生长密度需求（启动正常生长所需的密度）和实际的工作需求，在满足细胞生长密度需求的前提下，需要多少瓶就传多少瓶，降低工作强度和试剂耗材消耗；
4、离心速度和时间依据具体细胞决定；
四、细胞冻存保种
1、提前配制冻存液：用血清或完全培养基配制5-10%DMSO（根据具体细胞决定）冻存液；
2、消化收取细胞：当细胞密度即将达到其生长密度极限时进行换液，第二天，移除旧培养液，用PBS洗涤两次（旧培养中的钙离子会抑制胰酶的活性），加入1ml胰酶消化液（以T25培养瓶为例），立即盖好盖子，把培养瓶置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入5ml 预热完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，
使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（？RPM，？min，室温），小心移除上清；
3、加入适量（消化前预估细胞的数量，1-2*106/ml冻存液）冻存液并吹打混匀，分装至冻存管中，标记冻存细胞的名称、冷冻日期、操作者姓名拼音简写，然后放入梯度降温盒（提前复温至室温），置于-80℃过夜，次晨置于液氮罐中保存；注意事项：
1、密切观察细胞的生长密度，当细胞密度即将达到其生长密度极限时进行换液，以便第二天进行保种；
2、消化前进行冻存液配制，切勿用培养基和血清重悬细胞后再加入DMSO，这样会导致局部高浓度的DMSO对细胞产生损伤；
3、消化前预估细胞的数量，加入适量冻存液，以使细胞密度为1-2*106/ml，密度过高会导致冻存保护液不足，密度过低会导致冻存液对细胞有毒性；
4、梯度降温盒必须提前复温至室温，切勿从-80℃取出即可使用，这样会导致细胞全部死亡；
5、离心速度和时间依据具体细胞决定；。