常见的生化检测方法

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常见的生化检测方法
Western-blot 法 Western Blot 印迹法是把通过电泳分离的蛋白质组分从凝胶转移至一种固相支持物，通过抗体与附着于固相支持物的靶蛋白的抗原表位发生特异性反应进行检测。

Western Blot 既可以定性，又可以半定量，是初步鉴定靶蛋白表达的最方便也是最通用的方法。

1、试剂耗材的准备：
⑴、转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl， 39 mM 甘氨酸， 0. 037% SDS， 20%甲醇）：
⑵、 10丽春红染液：
⑶、 TBS 缓冲液：
⑷、 TBST 缓冲液（含 20%Tween20 的 TBS 缓冲液）：
⑸、封闭液（含 5%脱脂奶粉的 TBST 缓冲液）：
⑹、一抗、二抗及抗体稀释液：
参照说明书，以封闭液或 TBST 进行稀释。

⑺、底物显色液 ECL，4℃ 避光保存，现用现配。

⑻、显影液和定影液。

用水稀释 10-20 倍于铝盒中，可多次使用。

室温避光存放。

2、实验步骤：
⑴、蛋白样品制备：
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用细胞裂解液抽提蛋白，并测蛋白浓度。

⑵、取 1mg 蛋白进行 SDS-PAGE。

⑶、转膜：
（转膜缓冲液4℃预冷备用，冷却装置于-80℃冰箱冷冻备用）。

⑷、将 2 张海绵垫、 2 张滤纸、转膜夹子及玻棒浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

⑸、戴上手套，剪一张与凝胶尺寸相近的 PVDF 膜（83 mm75 mm），左上角剪一缺口作为标记，浸泡在盛有 20mL 甲醇的平皿中约 15 sec，直到膜变半透明。

用纯水冲洗膜2 次。

浸泡在盛转膜缓冲液的铝盒中。

⑹、 SDS-PAGE 结束后，小心地剥下两块凝胶，一块用于考马斯亮兰染色观察电泳情况，另一块浸泡在转膜缓冲液中预平衡。

海绵垫、滤纸、 PVDF 膜及凝胶的预平衡时间在 15 min-1hr 之间。

⑺、将转膜夹子打开，使黑的一面保持水平。

按照海绵垫、滤纸、凝胶、膜、滤纸和海绵垫的先后顺序铺垫，制备凝胶转移夹层。

将膜与凝胶对齐。

用玻璃棒赶走气泡。

⑻、将夹子夹起来，扣紧，小心不要移动内层。

放入电转槽中。

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的白面对槽的红面。

⑼、将电转槽放在冰水盒中。

将预冻的冷却装置放入槽内。

缓慢倒入约 650 mL 转膜缓冲液。

⑽、盖好盖子，接上电源。

根据蛋白分子量来调节工作电流，一般使用 100 V（350mA），转移 60-90 min。

⑾、转膜结束后，断开电源，拆卸转膜夹子，逐一掀去各层。

将膜用 1丽春红染色 5 min，用水冲洗 3 次，观察蛋白转印是否完全。

同时也可将凝胶用考马斯亮蓝染色，胶上无蓝色条带则说明蛋白转印完全。

⑿、免疫反应：
1、封闭：
用镊子将膜移至含有 25 mL 封闭液的平皿中，用脱色摇床室温缓慢摇匀 2 hrs，或4 ℃ 过夜。

封闭完用 TBST 冲洗 5 sec。

用吸水纸吸去残余液。

B、一抗孵育：
按照一抗说明书的推荐比例稀释一抗，使用 TBST 或封闭液稀
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释。

在一容器中，将 PVDF 膜浸没在抗溶液里，室温下 2 hrs 或
4 ℃ 过夜，摇床缓慢摇匀。

C、一抗孵育完后，用 TBST 室温下在摇床上洗 3 次，每次 10 min。

D、二抗孵育：
同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下摇床缓慢摇匀1-2hrs。

E、二抗孵育完后，用 TBST 室温下在摇床上洗 3 次，每次 10min。

⒀、显影和定影：
A、将 ECL Plus 显色液的 A 液和 B 液在容器里体积混合，根据膜的大小来确定显色液的量， 1min 后，将膜与显色液充分接触。

B、反应 1-5min 后，吸去膜上残余液，将膜转移至一干净保鲜膜上，包好，放入压片夹中。

C、剪一张比膜尺寸稍大的 X 光片，打开压片夹，将 X 光片放在膜上，一旦放上，便不能移动。

关上压片夹，开始计时。

D、根据信号强弱调整曝光时间，一般 1-5min，也可选择不同时间多次压片以达最佳效果。

E、曝光结束后，打开压片夹，将 X 光片迅速浸入备好的
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 显影液中显影，待出现明显条带后，终止显影。

一般 1-2 min（20-25 ℃）。

F、显影结束后，用水冲洗 X 光片，放到定影液中，定影时间一般为 5-10 min，以胶片透明为止。

G、用水冲洗去底片上残留的定影液，室温下晾干。

葡萄糖氧化酶法一、基本原理葡萄糖氧化酶(glucose oxidase， GOD) 利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。

过氧化物酶(peroxidase， POD) 在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体 4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder 反应。

此有色物质在 625nm 波长下与葡萄糖浓度成正比。

二、试剂 0. 1mol/L 磷酸盐缓冲液(pH7. 0) ：
称取无水磷酸氢二钠 8. 67g 及无水磷酸二氢钾5. 3g 溶于蒸馏水 800ml 中，用 1mol/L 氢氧化钠(或 1mol/L 盐酸) 调 pH 至7. 0，用蒸馏水定容至 1L。

酶试剂：
称取过氧化物酶 1200U，葡萄糖氧化酶 1200U， 4-氨基安替比林 10mg，叠氮钠 100mg，溶于磷酸盐缓冲液 80ml 中，用 1 mol/L NaOH 调 pH 至 7. 0，用磷酸盐缓冲液定容至 100ml，置4℃保存，可稳定 3 个月。

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酚溶液：
称取重蒸馏酚 100mg 溶于蒸馏水 100ml 中，用棕色瓶贮存。

酶酚混合试剂：
酶试剂及酚溶液等量混合，4℃可以存放 1 个月。

12mmol/L 苯甲酸溶液：
溶解苯甲酸 1. 4g 于蒸馏水约 800ml 中，加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至 lL。

100mmol/L 葡萄糖标准贮存液：
称取已干燥恒重的无水葡萄糖 1. 802g，溶于12mmol/L 苯甲酸溶液约 70ml 中，以 12mmol/L 苯甲酸溶液定容至 100ml。

2h 以后方可使用。

5mmol/L 葡萄糖标准应用液：
吸取葡萄糖标准贮存液 5. 0ml 放于 100ml 容量瓶中，用12mmol/L 苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。

三、方法取 3 支试管，标明测定管（U）、标准管（S）、标本空白管（B） , 按下表操作：
加入物（mL） B S U 血清 0. 02 葡萄糖标准应用液 0.
02 蒸馏水 0. 02 酶酚混合试剂 3. 0 3. 0 3. 0 混匀，置37℃水浴 15 分钟，冷却至室温。

在波长 505nm 处，用空白管调零，测各管吸光度。

四、实验结果计算血清葡萄糖(mmol/L) =（测定管吸光度）/(标准管吸光度）标准液浓度参考值：
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 空腹血糖：
3. 90～6. 10mmol/L；餐后 2h 血糖：
7. 8mmol/L。

画曲线图：
以时间为横坐标，血糖浓度为纵坐标，即可绘制出糖耐量试验的各时间段血清（浆）葡萄糖浓度曲线。

五、注意事项 1、葡萄糖氧化酶对 -D 葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约 36%为型， 64%为型。

葡萄糖的完全氧化需要型到型的变旋反应。

国外某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。

新配制的葡萄糖标准液主要是型，故须放置 2h 以上(最好过夜) ，待变旋平衡后方可应用。

2、葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。

因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。

3、测定标本以草酸钾－氟化钠为抗凝剂的血浆较好。

取草酸钾 6g，氟化钠 4g。

加水溶解至 100ml。

吸取 0. 1ml 到试管内，在80℃以下烤干使用，可使 2～3ml
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血液在 3～4 天内不凝固并抑制糖分解。

4、本法用血量甚微，操作中应直接加标本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结果可靠。

5．严重黄疸、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。

6、本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。

误差往往发生在反应的第二步。

一些还原性物质如尿酸、维生素 C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。

然而，在本法的测定条件下，溶血标本血红蛋白的浓度达10g/L，黄疸标本胆红素浓度达 342 mol /L，维生素 C 小于30mg/L，均不影响测定结果。

氟化钠浓度达 2g/L 不干扰测定结果。

标本中含尿素浓度达 46. 7mmol/L，尿酸浓度达 2. 95mmol/L，肌酐浓度达 4. 42mmol/L。

半胱氨酸浓度达 3. 30mmol/L，甘油三酯浓度达 5. 6mmol/L，胆固醇 4. 40 mmol/L，对测定结果均无显著影响。

左旋多巴 100mg/L，维生素 C 5mg/L 以上，谷胱甘肽100mg/L 时，可引起负误差；半胱氨酸达 10mmol/L 时，产生相当0. 72mmol/L 葡萄糖的正误差。

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ ELISA 法 1971 年 Engvall 和 Perlmann 发表了酶联免疫吸附剂测定（ enzyme linked immunosorbent assay， ELISA）用于 IgG 定量测定的文章，使得 1966 年开始用于抗原定位的酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。

一、基本原理 1、使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

2、使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。

由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

二、方法类型和操作步骤 ELISA 可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

在这种测定方法中有 3 种必要的试剂：
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①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。

根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

㈠、双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：
1、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：
洗涤除去未结合的抗体及杂质。

2、加受检标本：
使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。

洗涤除去其他未结合的物质。

3、加酶标抗体：
使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。

彻底洗涤未结合的酶标抗体。

此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

4、加底物：
夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。

根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

㈡、双位点一步法在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步（图 15-5）。

这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。

单克隆抗体的应用使测定抗原的 ELIS 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。

当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。

钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

㈢、间接法测抗体间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。

操作步骤如下：
1、将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：
洗涤除去未结合的抗原及杂质。

2、加稀释的受检血清：
其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。

经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。

其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

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3、加酶标抗抗体：
与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。

洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。

例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人 IgG 抗体。

4、加底物显色：
颜色深度代表标本中受检抗体的量。

本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体㈣、竞争法竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。

以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。

操作步骤如下：
1、将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。

洗涤。

2、待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。

如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。

如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。

参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。

---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------ 洗涤。

3、加底物显色：
参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。

参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。

待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

㈤、捕获法测 IgM 抗体血清中针对某些抗原的特异性 IgM 常和特异性 IgG 同时存在，后者会干扰 IgM 抗体的测定。

因此测定 IgM 抗本多用捕获法，先将所有血清 IgM（包括异性 IgM 和非特异性IgM）固定在固相上，在去除 IgG 后再测定特异性 IgM。

操作步骤如下：
1、将抗人 IgM 抗体连接在固相载体上，形成固相抗人 IgM。

洗涤。

2、加入稀释的血清标本：
保温反应后血清中的 IgM 抗体被固相抗体捕获。

洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

3、加入特异性抗原试剂：
它只与固相上的特异性 IgM 结合。

洗涤。

4、加入针对特异性的酶标抗体：
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使之与结合在固相上的抗原反应结合。

洗涤。

5、加底物显色：
如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性 IgM 抗体存在，是为阳性反应。

㈥、应用亲和素和生物素的 ELISA 亲和素是一种糖蛋白，可由蛋清中提取。

分子量 60kD，每个分子由 4 个亚基组成，可以和 4 个生物素分子亲密结合。

现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉和素（strepavidin）。

生物素（biotin）又称维生素 H，分子量 244. 31，存在于蛋黄中。

用化学方法制成的衍生物，生物素－羟基琥珀亚胺酯（biotin-hydroxysuccinimide， BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素化的产物。

亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。

由于 1个亲和素分子有 4 个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。

因此把亲和素和生物素与 ELIS 偶联起来，就可大提高 ELISA 的敏感度。

亲和素－生物素系统在 ELISA 中的应用有多种形式，可用于
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间接包被，亦可用于终反应放大。

可以在固相上先预包被亲和素，原用吸附法包被固相的抗体或
抗原与生物素结合，通过亲和素－生物素反应而使生物素化的抗体
或抗在相化。

这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点
充分暴露。

另外，在常规 ELISA 中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。

ELISA 普遍用作非放射性同位素的成键化验. 在这种方法中, 通常标准配体是固定的, 通过加入溶液相受体或蛋白质来使之成键. 通过加入与受体特异性反应的抗体来定量成键的受体, 而且最初抗
体的量以加入第二种能显色的抗体测量. 第二种抗体能识别抗体的
末端, 在其末端的碱性磷酸酯或过氧化物酶等与酶发生反应, 从
而使溶液显色。

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