蛋白质的测定方法—凯氏定氮法

蛋白质的测定方法—凯氏定氮法
一、原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

二、试剂
1、硫酸铜硫酸钾浓硫酸氢氧化钠
2、硼酸溶液（20g/L）：称取20g硼酸，加水溶解并稀释至1000ml。

3、氢氧化钠溶液（400g/L）：称取400gNaOH加水溶解后，放冷，并稀释至1000ml。

4、盐酸标准溶液（0.05mol/L）
5、甲基红乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。

6、溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）：称取0.1g溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100ml。

7、甲基红—溴甲酚绿混合指示剂：临用时以1:5混合。

三、测定
1、试样处理（消化）：准确称取水解胶原蛋白0.5g,准确至0.0001g，硫酸铜0.2g，硫酸钾6g于干燥洁净的凯氏定氮管中，至消化炉上，加浓硫酸20ml，盖帽。

开启消化炉（温度设定为400℃），仪器大约20分钟达到设定温度，开始计时，样品消化需
2-3h，至液体呈蓝绿色并澄清透明后。

断电，放冷。

2、蒸馏与吸收：将消化好的试样转移至100ml容量瓶中，加水（边加边缓慢振摇容量瓶，由于样品放热，操作时戴手套以免烫伤）稀释至100ml容量瓶中，摇匀，备用。

同时做空白试验。

向接收瓶中加入硼酸（20g/L）50ml及10D甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。

打开凯氏定氮仪电源开关，打开冷却水，设置加碱（40%的NaOH 溶液）时间为7秒，蒸馏时间为6分钟，取定容后溶液10ml到消化管中，放置到相应位置。

关闭安全门，开机预热3分钟后按启动键开始加碱、蒸馏。

当吸收液呈中性时，停止吸收。

用0.05mol/L盐酸标准液滴定接收液，颜色由绿色变为灰红色即为滴定终点，记录消耗盐酸体积。

3、计算
C*(V1-V0)*0.014
X=----------------------*F*100
M*10/100
其中水解胶原蛋白换算系数F为5.79
1、注意事项
1、开机预热3分钟，第一个样品测试用蒸馏水代替样品，加碱
时间设置为0，使仪器预热。

2、放置消化管事项：先将消化管托架向下拉，其次将消化管口
与黑胶体紧密接触，最后将消化管托架轻轻套在消化管上。

3、清洗碱电磁阀（每天）：工作结束将碱桶取下换上蒸馏水的
清洗桶，设置加碱时间20秒，蒸馏时间未0，按启动键，
洗后倒掉消化管的水，重复3次。

4、清洗正面蒸汽瓶的污垢：操作同清洗碱电磁阀，但将蒸馏时
间设置为5分钟，按启动键，反复几次直到干净为止。

5、清洗仪器内蒸馏瓶的污垢：关闭电源，打开后盖，将蒸馏瓶
上的塑料螺母拧开，注入米醋浸泡10分钟，然后将残夜排出，反复用蒸馏水冲洗干净后，再拧上塑料螺母，排干净后必须再夹上夹子。

6、清洗碱桶、蒸馏水桶和清洗桶。

（只需将桶盖打开即可）
7、排废液：松开仪器背后的夹子将蒸馏瓶的残水排掉，排干净
后必须再夹上夹子。

（每3天）
8、当取下或放上消化管时要注意烫伤。