文献汇报讲义

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文献汇报讲义
此次是我的第一次组会,因此此次的内容需要很大的改进
本次汇报的文献是:通道视紫红质的种类与功能读这篇文献需要熟练掌握非常多的专业知识,对于我来说还需要多阅读更多文献才能真的看懂。

因此我们需要先了解这篇文献的一个关键领域——光遗传!
光遗传学
Nature Methods 在2010年选出的年度最佳方法是光遗传。

(PPT第2页)Speak:
尽管几十年来科学家们一直在追求利用光来控制细胞活动的构思,但可用的方法存在缺陷,限制了它们的实用性。

因此Nature Methods 2010年度最佳方法光遗传学克服了许多这些缺点,将光和基因编码的光敏蛋白结合起来,控制活细胞和生物体的行为。

例如,基因靶向在完整的动物体内提供了精细的细胞特异性,这是完全依赖于信号分子的光学释放的其他光刺激方法无法实现的。

这张图是戴瑟罗斯实验室中,将光纤插入到具有光激活神经元的小鼠脑中并对其行为进行研究。

(PPT第3页)speak:
光遗传学(Optogenetics)是遗传学的基因操作技术和光学的相互结合与共同作用。

是个多义词,通常表示“用光控制经过基因改造表达光敏离子通道的神经细胞”的生物技术,包括“发现赋予生物光反应性的基因并将其插入其它生物的特定细胞(开发光敏蛋白,图1)”
“将不同的光敏蛋白定位到特定的细胞类型(将其基因传递到特定细胞的策略)”“将光脉冲精确发射到活的复杂生物体深处(定向照明)”“用于评估光控制效果的数值项目与仪器(用于报告细胞、组织和动物行为变化的兼容读数,图3)”等。

这个术语也可以表示“对经过基因改造表达荧光之类特征的神经细胞的活动进行光学监测”和“利用光对神经细胞之外的细胞经过基因改造的生化途径进行控制”。

光遗传学技术可在数毫秒内改变组织培养物或活动物体内若干个神经细胞的兴奋或抑制状态,影响自由移动的活动物的行为,对研究正常大脑功能和各种脑部疾病十分重要。

图1用于膜电压调制的光遗传工具
光遗传学最常见的用途之一是改变可兴奋细胞的膜电压电位。

在神经元中,膜去极化导致瞬间电信号(峰电位)的激活,这是神经元通讯的基础。

相反,膜超极化导致这些信号的抑制。

控制操作这些电流的“开关”使神经科学家能够研究神经元在功能上如何相互关联以及神经元电路如何控制行为。

通过外源性表达能够改变神经元膜电位的光激活蛋白,光可以作为开关。

这些神经元开关中的第一个使用通道视紫红质-2(ChR2)。

当在神经元中表达并暴露在蓝光下时,这种非选择性阳离子通道立即使神经元去极化并触发尖峰。

ChR2的几个变种已经被开发出来。

CHETA突变体被设计成更快的ChR2变体,可以用来以高于40赫兹的频率刺激神经元。

相比之下,具有阶跃功能视蛋白或SFO变体,是ChR2的较低频率版本,在暴露于蓝光时可以在神经元中诱导长期稳定的可兴奋状态,然后在暴露于绿光时被逆转。

通道视紫红质-1(VChR1)的作用类似于ChR2,但被红移光激活。

光刺激氯化物泵卤视紫红质(NpHR)会使神经元超极化,并抑制对黄色光的反应。

最近的突变体(命名为eNpHR2.0和eNpHR3.0)在哺乳动物细胞中显示了更好的膜靶向性,从而改善了光电流。

光驱动的质子泵如古紫质-3(Arch)、Mac、细菌视紫红质(EBR)和视紫红质-3(GtR3)也可以用来超极化神经元和阻断信号。

图2用于调节细胞内信号传导的光遗传学工具已经出现可以控制细胞内的信号级联和分子间的相互作用的光遗传工具。

这些工具通常是光吸收域与蛋白质“效应器”域的融合。

由牛视紫红质和肾上腺素G蛋白偶联受体的细胞内成分组成的嵌合蛋白,称为OptoXRs,允许对G蛋白介导的信号级联进行光学控制。

非膜相关的光敏蛋白,如光、氧、电压(LOV)结构域、光敏色素或植物隐花色素,可以与细胞效应蛋白融合产生光敏变体。

LOV2结构域使用天然编码的黄素作为发色团,是光激活融合蛋白(如LOV2-RAC)的基础。

蓝光诱导LOV2结构域的构象改变,导致Rac的变构结构块释放,使其与下游靶分子如PAK1结合并激活,导致肌动蛋白细丝聚合,产生局部细胞突起和细胞运动。

LOV结构域还被用来产生光驱动的DNA结合蛋白、蛋白质二聚体和酶等。

另一种细胞质光遗传系统由光感受器PhyB及其蛋白结合伴侣PIF组成。

红光释放PIF并触发PIF与PhyB的结合。

PIF与Rho家族GTP酶上游激活剂的融合允许光依赖性募集到PhyB锚定的质膜上,导致肌动蛋白细胞骨架的局部激活和细胞延伸的形成。

与上述基于视黄醛和黄素的系统不同,必须将PhyB发色团藻蓝蛋白提供给非植物细胞。

还有某些自然产生的酶,如光激活的腺苷酸环化酶(EPAC),可以通过直接产生第二信使分子来调节细胞信号事件。

图3使用宽视场,图案化和扫描光照射目标细胞
通过光遗传学对细胞活动的精确控制取决于对照明光进行明确的时间和空间控制。

宽视场照明可以使用具有恒定光源的超快快门、LED的快速切换或单光子激光扫描显微镜来进行时间控制。

所有在光路中表达光敏蛋白的细胞都将受到相同的刺激。

与光纤或微型LED耦合的光源已广泛地应用于活体内的研究。

也可以使用光图案化方法来选择性地照亮细胞的子集。

一种方法是使用基于数字微镜的设备将用户控制的动态光模式反射到特定的细胞或细胞区域。

双光子扫描显微镜可以用来定向激活单个表达ChR2的细胞,具有很高的时间可控性。

它与聚焦作用相结合,可以单独或同时选择性地激活细胞的一小部分、整个细胞或一组细胞。

发展史
Francis Crick 是第一个提出光可能是一种有用的细胞类型靶向神经控制方式的人,用于研究神经系统功能,但没有看到如何实现这一点,称这种可能性“牵强”
在这之前,贝尔实验室的理查德·L·福克(Richard L. Fork)于二十世纪七十年代报道了用激光刺激神经元的方法,但是激光会给细胞膜造成损害,其应用受到限制。

另一方面,一些微生物产生的视蛋白可以响应可见光、调节跨膜电荷流动,让微生物从光照中获取能量和信息。

1971年,加利福尼亚大学的Walther Stoeckenius和Dieter Oesterhelt 发现细菌视紫红质起离子泵的作用,可以被可见光光子迅速激活。

此后,单基因、单组分控制的最初主题在后来对该家族其他成员的鉴定中得以延续:
1977年,从嗜盐碱菌里发现的盐系菌视紫红质NpHR被证实在黄绿光照射下会将氯离子送进细胞内。

2002年,Hegemann和Nagel描述了绿藻Chlamydomonas reinhardtii的视紫质通道蛋白ChR1,
2003年他们描述了另一个视紫质通道蛋白ChR2。

经过基因改造的腺相关病毒等载体可以将上述细菌基因转入实验动物的神经细胞。

哺乳动物体内有大量的全反式视黄醛,是光子激活微生物视蛋白所必需。

因此,除视蛋白基因外,无需向哺乳动物的神经细胞添加任何东西就能整合进去。

但是这些外来的膜蛋白对于脆
弱的哺乳动物神经元可能是有毒的,并且光电流可能太慢和太弱而没有用处。

此外,此外,科学家不相信这种方法会实现长期寻求的单组分策略(这一观点也减缓了绿色荧光蛋白的发展和应用),因为微生物视蛋白需要一种化学辅助因子,即全反式视网膜来吸收光子。

多年来,人们对完整神经系统的普遍效用潜力持怀疑态度。

直到2005年,用慢病毒将上述视蛋白基因转入哺乳类神经元内、以高速光开关控制的研究成果成功发表。

到2007 年,在自由活动的成年小鼠的下丘脑深处的特定神经元中,已经实现了对确定的尖刺模式的光遗传控制,以及由此产生的行为状态转变。

光遗传学已经获得了今天神经科学家使用的基本方法的早期形式:通过高滴度病毒基因靶向载体和通过植入纤维的光靶向表达具有细胞类型(甚至投射类型)特异性和行为控制效力的微生物视蛋白光学。

到2009 年,已开发出通用的基因靶向策略,并证明其适用于哺乳动物的行为控制。

来自全球科学界的成千上万的发现已经产生,揭示了则无法访问的细胞特异性神经活动构建模块的行为。

ChRs
我们的工作都是延续前人的贡献!在此感谢。

(PPT第6页)在整个生物圈中,光被用于两个截然不同的目的:它的能量含量和它包含的有关环境的信息。

光合作用的光捕获复合物使用光来驱动质子的生电性跨膜传输,从而以电化学势的形式捕获能
量。

另一方面,动物的眼睛使用光来触发视觉的蛋白质/蛋白质相互作用级联,称为信号传导。

古细菌盐杆菌使用一系列视觉色素类的七跨膜螺旋蛋白家族——古细菌视紫红质,用于能量(光驱动离子传输)和感觉(趋光性运动行为)转导。

噬盐菌细胞膜中有四种古视紫红质,并且相关的嗜盐古细菌含有一种或多种同源物。

每一个都由一个多肽折叠成七个跨膜α螺旋,形成一个内部口袋的共价附着的发色团视黄醛。

细菌视紫红质(BR)和盐视紫红质(HR)是转运型(离子泵)视紫红质,分别在细胞膜上进行质子和氯离子的光驱动电易位。

另外两个是感觉视紫红质I和II(SRI和SRII),它们是趋光性受体,将信号发送给紧密结合的传感器蛋白(HtrI 和HtrII),后者反过来控制磷酸化级联,调节细胞的鞭毛马达。

Variations on a molecular switch: transport and sensory signalling by archaeal rhodopsins
图片讲解:
盐藻中的四种古细菌视紫红质。

除了感觉视紫红质SRI和SRII
以及其信号转导链中的组分之外,还显示了转运视紫红质BR(质子泵)和HR(氯化物泵)。

每个视紫红质由七个跨膜α-螺旋组成,其包围通过质子化席夫碱与螺旋G中的赖氨酸残基连接的视黄醛发色团。

感觉视紫红质与其相应的转导蛋白HtrI和HtrII络合,后者具有保守的甲基化和组氨酸激酶结合结构域,可调节激酶活性,进而通过细胞质磷酸调节器的转换控制鞭毛运动。

因为晶体结构不可用,所以为Htr传感器绘制的结构只是近似的。

这是因为同源大肠杆菌天冬氨酸趋化性受体Tar的二聚体结构以及在含有工程化半胱氨酸残基的HtrI氧化后观察到的定量二硫化物交联成二聚体,所以将转导物表示为二聚体。

在图中假定为单体的SR的低聚状态是未知的。

跨膜结构域和甲基化结构域的四螺旋束结构是基于Tar的相应结构域的结构,存在广泛的证据(由32人审查)。

所描述的膜和甲基化域之间的HTR 结构[称为刺激中继域]是算法预测。

Htr和SR螺旋的相对位置是任意的,仅用于说明。

(PPT第7页)视黄醛是一种发色团,可与完整的膜蛋白(视蛋白)结合形成称为视紫红质的吸光色素。

视紫红质含有发色团11-顺
式视黄醛,它具有最适合视觉的内在品质。

相比之下,古细菌视紫红质含有全反式视黄醛,并在光激活离子泵和趋光性中起作用。

古菌和视觉视紫红质显示很少的序列同一性,但具有相似的二级结构。

该结构包括七个跨膜α-螺旋结构域和第七个螺旋(螺旋G)中的一个保守赖氨酸残基与视黄醛。

在光吸收时,视黄醛异构化,席夫碱去质子化。

这些事件之后是视蛋白的构象变化和随后的光信号转导。

图2.说明Subramaniam等人发现的方案。

(1993),细菌视紫红质螺旋F的面向细胞质的部分在光周期的M2阶段改变其位置。

在这一阶段,螺旋F向外倾斜(虚线)。

Asp-96和视黄醇结合的Lys-216的位置如图所示。

(PPT第8页)虽然已经有生化证据表明真核微生物中存在视紫红质。

但真核视紫红质编码基因尚未被报道。

在该报告中,他们在N. crassa中鉴定了一个潜在的光受体基因。

导出的nop-1(新真核视蛋白1)氨基酸序列揭示了古生视蛋白家族中7个公认的跨膜螺旋结构域及对视黄醛结合和H+泵入非常重要的保守残基。

报道了该基因序列的进化分析、nop-1的染色体定位、nop-1在
N. crassa生命周期中的表达模式以及Δnop-1突变体的表型分析结果。

证实了异质性表达的NOP-1蛋白结合全反式[3H]视网膜。

The nop-1 gene of Neurospora crassa encodes a seven transmembrane helix retinal-binding protein homologous to archaeal rhodopsins
图片解释:
NOP-1与真菌和古细菌相关蛋白的系统发育关系。

视蛋白的系统发育是通过令人困惑的ML四重奏,α=2的γ距离的NJ和MP估算的。

通过使用完全比对进行分析。

假设具有经验氨基酸频率的进化的PAM模型,通过ML获得分支长度的估计,并且比例尺通过使用该模型指示每个位点(EAAS)0.1个估计的氨基酸取代。

显示了对古细菌视紫红质亚群和真菌蛋白内所有分组的单一性的支持,分支上方的四重令人费解的值以及分支下方的NJ和MP自举比例。

Δnop-1N.crassa菌株的寡霉素依赖性表型和在巴斯德毕赤酵母中异源表达的nop-1的视黄醛结合。

(A)对寡霉素敏感。

含有nop-1过表达(+)或对照品的毕赤酵母菌株的粗膜部分(−) 质粒与全反式[3H]视黄醛孵育,通过氰基硼氢化钠减少连接,并使用SDS/PAGE分析样品,然后进行荧光分析。

NOP-1蛋白的位置由箭头指示。

ChR
第一个光控制门控离子通道,来自莱茵衣藻藻类的视紫红质通道蛋白1(ChR1)和ChR2,于2002年和2003年被发现和表征。

ChR1
乔治·格尔的团队在2002年时发表于science上的文章中,报告了绿藻莱茵衣藻中的互补DNA序列,该序列编码一种微生物视蛋白相关蛋白,并将这种蛋白称为Channelopsin-1。

Channelrhodopsin-1: A Light-Gated Proton Channel in Green Algae 通过搜索莱茵衣藻EST(表达序列标签)数据库揭示了编码76.4-kD视蛋白相关蛋白的重叠cDNA序列。

他们将这种蛋白质命名为Channelopsin-1(Chop1)。

核心区域(总共712个氨基酸残基中的第76至309个氨基酸残基)包含与古细菌感官视紫红质(SR)、离子泵细菌视紫红质(BR)和卤化视紫红质(HR)具有序列相似性(15至20%)的七个假设跨膜片段,以及来自脉孢菌属的视紫红质(nop1)。

Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae ChR1是一个响应光吸收而打开的离子通道,即一个光感受器和离子通道的组合。

这种直接的光敏离子通道不太可能广泛分布于其他
趋光微藻,以及大型藻类的配子和游动孢子,甚至真菌(如nop1)。

ChR1调节卵母细胞中大的光开关H+电导的能力为利用ChR1作为测量和/或简单地通过照明操纵细胞膜上的电和质子梯度的工具提供了希望。

ChR2
次年,他们又在PNAS上发表一篇文章,证实了ChR2 是直接光控制的阳离子通道蛋白。

证明了异源表达的ChR2的光诱导电流能够改变宿主细胞的膜电位。

文献汇报
The form and function of channelrhodopsin 通道视紫红质及其独特的光激活离子通道已成为现代生物学研究的主要工具。

Deisseroth 和Hegemann 回顾了这些蛋白质光感受器的结构和功能特性。

诱变和建模研究,再加上将修改后的通道重新引入生命系统,提供了对这些通道如何工作的深刻理解。

对基础科学的深入了解为在生物学和医学中进一步开发应用提供了基础。

视紫红质的故事始于近150 年前的俄罗斯涅瓦河,19 世纪著名的植物学家Andrei Sergeyevich Faminzin 在那里研究了活动微藻。

Faminzin 首次全面描述了单细胞运动藻类移向或远离光的情况。

尽管在下个世纪对藻类物种的行为生态学以及藻类用于调节鞭毛跳动的亚细胞光检测结构进行了深入研究,但光感受器和分子光转导机制仍然神秘。

直到20世纪后期,在衣藻纲和更广泛的微生物类视紫红质型离子电导调节器中发现了光诱发的视紫红质型电流。

图2植物学的深根。

(A) Faminzin,藻类行为的先驱。

(B) Faminzin里程碑式的观察:在低光强度(底部),衣藻表现出向光性,而在较高光强度(顶部),藻类细胞在最佳光照下积累。

(C)显示亚细胞衣藻结构的改编动画片:鞭毛跳动模式和高分辨率断层扫描重建的眼睛结构。

眼点覆盖部分质膜(箭头)对应ChR位置。

由叶绿体膜(绿色)支撑的类胡萝卜素囊泡层(彩色球体)作为光学装置(干涉反射器)。

1971 年,获得了微生物视黄醛结合膜蛋白的证据,最初是质子泵型细菌视紫红质在其天然古菌系统(噬盐杆菌)中。

纯化的细菌视紫红质介导的光激活跨膜泵电流后来在人造黑色脂质膜制剂中得到证实。

40 多年的研究表明,微生物产生的视紫红质包括单基因单蛋白离子转运蛋白的几个亚类。

所有都是由单个视蛋白基因编码的七跨膜(7TM) 视网膜结合蛋白。

Type I Microbial Rhodopsins
Photoreaction Mechanism
与脊椎动物视网膜的视紫红质不同,这些微生物蛋白在黑暗/失活状态下结合全反式视黄醛(ATR,而不是顺式异构体)。

与触发效应级联来引起离子通量(如脊椎动物的视紫红质)不同,感光和离子流调节是由单个多肽链实现的。

运动型绿藻的光电流是由该家族的ChR亚型介导的; 衣藻的ch1和ch2是其原型ChRs。

通过光能/光电反应的作用光谱学和补充维甲酸恢复盲突变藻类的光行为发现了藻类视紫红质。

藻类光电流的特性表明,光敏感和离子导电单位来自一个单一的蛋白质在每个光循环中导电10到100个电荷[最初的300-fS估计假设在藻类眼斑中有10000个通道,这与数年后通过噪声分析得出的异表达的ChR2的100-fS单相电导相当一致]。

在Kazusa cDNA数据库中发现类似光感受器的序列后,异源表达显示出沿电化学梯度的被动跨膜电流(显示通道样行
为)。

ChRs比以前发现的任何视紫质都要大,但光遗传学只需要n端40%(包括所有具有光传感器和离子通道功能的跨膜结构域)。

正如晶体结构确定所证实的那样,ATR发色团似乎继承了视黄醛结合袋(RBP)内的位置,并与其假定的视紫红质泵进化祖先的蛋白主干通过赖氨酸共价结合。

对活动光合微生物的研究一直沿着几个方向进行。

并非所有这类生物都使用ChR;在趋光性裸藻中发现了具有核黄素光传感器的光激活核苷酸环化酶。

在衣藻中,结构和行为工作正在进行;ChRs已经被定位到覆盖在细胞膜上的眼点(光敏细胞器)上,并且最近以前所未有的精度记录了鞭毛搏动的光调制,因为它是通过鞭毛动作电位(在光照强度大并且突变的情况下)或通过膜电压的逐渐调制发生的。

结构模型和孔隙门控动力学
ChRs 的光激活膜孔是独一无二的。

然而,在ChR 家族中,存在许多变体。

ChR 是一种高度灵活的蛋白质,在过去的十几年里,科学家们在作用光谱、光循环动力学和离子选择性方面进行了大量修改,但在数十亿年的时间尺度上,大自然的影响更大。

最初人们对光激活孔的结构还不清楚。

ChR 的早期描述阐明了诸如非特异性阳离子选择性(对H + >> Na + > K + >> Ca 2+ 的渗透性和内向整流)等特性。

除了具有主要的膜内谷氨酸残基的螺旋2提供了线索,目前尚不清楚光激活孔位于何处。

在寻找光门孔的过程中,与微生物光驱动泵结构的比较对我们的光激活孔位的寻找几乎没有
帮助,例如螺旋1和螺旋2与假定的泵对应物的同源性非常低,甚至具有误导性[低分辨率的低温电子显微镜(cryo-EM)曾预测孔隙会位于两个ChR单体的界面上,但事实并非如此]。

这种程度的不确定性阻碍了孔隙工程的设计和新型离子选择性ChRs的创造。

许多其他功能,包括激活和失活的关键动力学性质,在解决三维结构之前,都需要构建结构模型和详细的分子设计。

ChR光电流在强光下的逐渐失活对藻类应对高光强度似乎很有用,但对神经科学提出了挑战。

这种失活表现为围绕ATR C15=NH键的一种概率选择性光异构化,与动物视紫红质在从Meta-I向Meta-III 转变过程中或细菌视紫红质在暗适应过程中从同步环向反循环的转变相对应。

同步(syn)循环开放态对质子和阳离子的渗透性较差(相对于反循环态),导致长时间光照下光电流下降。

暗适应下,ATR是全反式/15反式,但在光照后不久,两种相似但可区分的状态就出现了(全反式(trans)/15-反式(anti)和13-顺式(cis)/15-同步(syn)),分别导致13-cis/15-anti (O1)和13-trans/15-syn (O2)构型的导电态。

O1/O2比值也取决于膜电压和pH梯度,在ChR变体中差异很大,这导致了光电流特性的多样性。

早期研究发现,质子泵视紫红质的快速时间常数与后期观察到的ChR在卵细胞膜上的激活τ值一致(τ值小于250 μs),阐明控制孔隙动力学的分子原理成为主要目标,不仅可以深入了解孔隙作用的力学原理,还可以实现对行为和生理的短期和长期尺度的光遗传学控制。

视黄醛异构化似乎导致中心门残基的快速重排和门在纳秒时间尺度
上的开启;通过水侵进行的螺旋水化过程在10到100 μs内进行,(结合螺旋2的运动)打开一个内部闸门,允许形成阳离子导电孔(43,44)(图1)。

ChR孔隙的亚毫秒开启时间常数(τon)足够快,不影响或限制神经科学的应用。

相比之下,光关后的光电流衰减(τoff)在神经科学领域具有重要的功能意义,并且具有广泛的可调性。

泵和通道在光停止时将停止进入光循环,而观察到的光电流可以比光持续更久,因为已经激活的蛋白质正在完成它们的光循环。

野生型ChR2的τoff (~10 ms)对于植物来说是惊人的快,但对于快速尖峰的哺乳动物神经元来说是缓慢的,并导致光遗传学的保真度受损。

这个参数[在许多ChRs中进一步减缓膜去极化]引发了持续数十毫秒的长时间尖峰后去极化,抵消了终止自然尖峰的典型毫秒级再极化;可能会产生伪双峰,而不是精确的单个尖峰,而且在高频尖峰序列中,尖峰甚至会失效(因为复极化去失活的电压依赖性通道需要随后的动作电位)。

一旦确定了关键的分子原理,这些由长寿命τoff值推导出来的保真度问题就可以用重新设计的短寿命τoff来解决。

ChR2的Glu123是一个带负电荷的“反离子”残基,稳定了质子化的视黄醛希夫碱的膜内正电荷,在-100 mV时,τoff降低到4 ms,同时也降低了电压依赖性的减速,因此在峰期加速孔关闭。

由于降低了光异构化效率和每个光子的电荷转移,这些“ChETA”变体表现出了适度降低光敏性的缺点。

然而,加速失活处理了限制神经科学应用于快速尖峰细胞的关键参数,并启用了200hz或更高频率的放电,同时减少了额外或错过的尖峰的数量。

当需要精确控制和时间平稳性时,。

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