hpv16e7的表达对宫颈癌变过程中cd163+巨噬细胞的浸润及上皮间质转化的影响

中国组织化学与细胞化学杂志
CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY
第28卷第5期2019年10月
V ol .28.No .5October .2019
〔收稿日期〕2019-06-04 〔修回日期〕2019-10-12
〔基金项目〕国家自然科学基金(81260442)；中央高校基本科研业务费专项资金项目（31920150044）〔作者简介〕尚立娜，女（1981年），满族，讲师
*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：yxzj@
HPV16E7的表达对宫颈癌变过程中CD163+巨噬细
胞的浸润及上皮间质转化的影响
尚立娜1，安利峰1，张城1，龚川友1，周彰映1，田世馨1，李晓琴2，赵晋1*
（1西北民族大学医学院，2甘肃省肿瘤医院病理科， 兰州 730030）
〔摘要〕目的 研究人乳头瘤病毒16E7（HPV16E7）、上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition ，EMT ）“cadherin switch ”标记物E-cadherin 、N-cadherin ，及肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages ，TAMs ）标记CD163在宫颈癌变过程中的表达情况，探讨在不同的HPV16E7表达情况下，上皮间质转化程度及肿瘤相关巨噬细胞浸润的差异及二者之间的关系。

方法 通过免疫组化法检测宫颈鳞状细胞癌、高级别上皮内瘤变(CINII-III)、低级别上皮内瘤变(CINI)及慢性宫颈炎患者的HPV16E7、E-cadherin 、N-cadherin 、CD163的表达情况。

结果 E-cadherin 的表达随着宫颈癌变的进展逐渐降低，N-cadherin 的表达以及CD163+巨噬细胞数量随着宫颈病变的进展逐渐升高。

慢性宫颈炎、CINI 、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌的HPV16E7阳性组和阴性组比较中，E-cadherin 的表达在CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌中HPV16E7阳性组明显低于阴性组；N-cadherin 的表达在宫颈鳞状细胞癌中HPV16E7阳性组明显高于阴性组；CD163+巨噬细胞数目在CINI 、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌中HPV16E7阳性组明显高于阴性组。

进一步统计CD163+巨噬细胞与上皮间质转化间关系后发现，宫颈癌变过程中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，E-cadherin 的表达逐渐降低，无论HPV16E7的表达如何，二者均呈负相关关系；宫颈鳞状细胞癌中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，N-cadherin 的表达逐渐增加，HPV16E7阳性组二者仍呈正相关关系，而HPV16E7阴性组无明显相关关系。

结论 HPV16E7可能通过肿瘤相关巨噬细胞来调节上皮间质转化的“cadherin switch ”，从而促进宫颈癌的癌变。

〔关键词〕宫颈癌；人乳头瘤病毒16E7；上皮间质转化；肿瘤相关巨噬细胞
〔中图分类号〕 R730.21; R711.74 〔文献标识码〕A DOI ：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2019. 05. 006
Effect of HPV16E7 expression on infiltration of CD163+ macrophages and epitheli-al-mesenchymal transition during cervical carcinogenesis
Shang Lina 1, An Lifeng 1, Zhang Cheng 1, Gong Chuanyou 1, Zhou Zhangying 1, Tian Shixin 1, Li Xiaoqin 2, Zhao Jin 1*
(1Medical College of Northwest Minzu University, 2Department of Pathology, Gansu Provincial Cancer Hospital,Lanzhou 730030,
China)
〔Abstract 〕Objective To study the expression of human papillomavirus 16E7 (HPV16E7), the markers of cadherin switch of ep -ithelial-mesenchymal transition (EMT) including E-cadherin and N-cadherin, and the marker of tumor-associated macrophages(TAMs) CD163 in cervical carcinogenesis, so as to investigate the difference in the degree of EMT and TAMs infiltration under different HPV16E7 expression levels and their relationship . Methods The expressions of HPV16E7, E-cadherin, N-cadherin and CD163 were detected by immunohistochemistry in cervical squamous cell carcinoma, high-grade intraepithelial neoplasia (CINII-III), low-grade in -traepithelial neoplasia (CINI), and chronic cervicitis. Results The expression of E-cadherin decreased with the progression of cervical neoplasma generation, while the expression of N-cadherin and the number of CD163 positive macrophages increased with the progres -sion of cervical neoplasma generation. In the comparison between the HPV16E7 positive group and the HPV16E7 negative group of chronic cervicitis, CINI, CINII-III and cervical squamous cell carcinoma, the expression of E-cadherin in the positive group of CINII-III and cervical squamous cell carcinoma was significantly lower than that in the negative group, while the expression of N-cadherin in the positive group of cervical squamous cell carcinoma was significantly higher than that in the negative group, and the number of CD163 positive macrophages in the positive group of CINI, CINII-III and cervical squamous cell carcinoma was significantly greater
尚立娜等.HPV16E7的表达对宫颈癌变过程中CD163+巨噬细胞的浸润及上皮间质转化的影响
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宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，死亡率居恶性肿瘤的第四位。

在宫颈癌的组织学类型中最常见的为鳞状细胞癌（squamous cell carcino-ma, SCC），占所有病例的85％~90％。

研究发现，高危型人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）癌基因E6、E7 的持续表达是宫颈上皮细胞发生恶性转化及持续进展为浸润性宫颈癌的必要条件[1]，其中E7可以通过从E2F复合物中螯合Rb来阻止、破坏一系列信号通路，从而促进肿瘤生长，侵袭或转移[2]。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）是上皮细胞转化为间质细胞的暂时性和可逆性的生物学过程，具体表现为上皮细胞发生成纤维细胞样的形态改变，细胞粘附降低，细胞活力、运动性增加[3]。

研究表明，EMT在促进原发肿瘤的侵袭和转移中起着关键的作用[4]，上皮细胞的侵袭性取决于EMT的激活。

肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAMs）是泛指在肿瘤发生过程中浸润于肿瘤并影响其发展转归的巨噬细胞，具有M2型巨噬细胞的表型并表达CD68和CD163[5]。

研究发现，高密度的TAMs与预后不良相关，并影响各种实体肿瘤的发生、发展和转移[6,7]。

但是在宫颈癌变中HPV16E7的表达与EMT及TAMs 之间到底有什么样的联系，还未见报道。

本研究通过免疫组织化学检测宫颈鳞状细胞癌（SCC）、高级别上皮内瘤变（CINII-III）、低级别上皮内瘤变（CINI）及慢性宫颈炎中HPV16E7蛋白的表达，上皮间质转化标记E-cadherin、N-cadherin的表达以及肿瘤相关巨噬细胞标记CD163的表达情况，来探讨不同HPV16E7的表达状态下，EMT与TAMs之间的关系。

资料与方法
1 标本来源
收集甘肃省肿瘤医院病理科2014～2018年石蜡包埋标本共233例。

其中，宫颈鳞状细胞癌98例，包括角化型鳞状细胞癌51例，非角化型鳞状细胞癌47例，患者年龄25~67岁，中位年龄48岁；CINII-III 52例；CINI 54例；另外选取因子宫肌瘤行全子宫切除术，术后病理证实为慢性宫颈炎的宫颈标本29例。

以上病例的收集排除宫颈癌根治性手术前后接受过放射治疗与化疗等非手术治疗的患者。

所有患者知情同意，经医院伦理委员会批准。

2 主要试剂及方法
所有标本经10%甲醛常规固定，石蜡包埋，4μm 厚切片，常规HE及免疫组织化学染色，MaxVision 法详细步骤严格按照说明书进行。

鼠抗人单克隆抗体CD68（MAB-0041，1:100），鼠抗人单克隆抗体CD163（MAB-0206，1:100），鼠抗人单克隆抗体E-cadherin（MAB-0589，1:100），鼠抗人单克隆抗体N-cadherin（MAB-0571，即用型）及免疫组织化学MAXVision TM2试剂盒（KIT-5920）购自福州迈新公司，HPV16E7鼠抗人单克隆抗体（289-17013，1:1000）购自GeneTex公司。

3 结果判定
免疫组织化学结果由两位有经验的病理科医师采用双盲法独立阅片后做出判断。

HPV16E7以细胞核呈黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞，E-cadherin以细胞膜、N-cadherin以细胞质呈黄色或黄褐色颗粒为阳性细胞。

光学显微镜下随机选取5个高倍镜视野，每个视野记数100个细胞，计算阳性细胞数占总细胞数的百分比，取5个视野的算术平均值。

①根据显色细胞的比例计分：0分（显色癌细胞为0%）；1分（显色细胞<10%）；2分（显色细胞10%~25%）；3分（显色细胞25%~50%）；4分（显色细胞>50%）。

②根据细胞染色强度计分：0分（癌细胞无显色）；1分（浅黄色)；2分（棕黄色或黄褐色)。

两种计分方法相乘，作为最终免疫组化判定结果。

其中，E-cadherin及N-cadherin的染色结果判断：0分为阴
than that in the negative group. We further statistically analyzed the relationship between CD163+ macrophages and EMT, and found that with the increase of the number of CD163+ macrophages, the expression of E-cadherin gradually decreased during cervical car-cinogenesis, and the negative correlation between them remained regardless of the expression of HPV16E7. In cervical squamous cell carcinoma, the expression of N-cadherin gradually increased with the increase of CD163+ macrophages, there was a positive correlation between them when the expression of HPV16E7 was positive, while there was no obvious correlation when the expression of HPV16E7 was negative. Conclusion HPV16 E7 could regulate “cadherin-switch” of epithelial-mesenchymal transition via tumor-associated macrophages, and consequently contribute to carcinogenesis of cervical cancer.
〔Keywords〕Cervical cancer; human papillomavirus 16E7; epithelial-mesenchymal transition; tumor-associated macrophages
中国组织化学与细胞化学杂志
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性（-），1~2分为弱阳性（+），3~5分为中等阳性（++），6~8分为强阳性（+++），1~8分计为表达阳性，0分计为表达阴性；HPV16E7的染色结果判断：0~1分计为表达阴性，2~8分计为表达阳性。

TAMs的分布和计数：用CD163标记TAMs。

以细胞膜、细胞质被染为棕黄色的细胞为CD163+巨噬细胞，在光镜下观察其一般形态及分布后，对CD163+巨噬细胞的数量进行计数，首先在10倍物镜下找到视野中CD163+巨噬细胞在肿瘤中密度最高的五个区域，即热点区域，然后在400倍物镜下对CD163+巨噬细胞进行计数，取平均值进行统计学分析。

4 统计学分析
采用SPSS18. 0 进行统计分析，计量资料用`χ±s 表示，各分类变量的相关关系均采用Spearman等级相关分析，组内及组间频率比较采用秩和检验，两样本均数比较采用两独立样本t检验，P<0. 05 为差异具有统计学意义。

结 果
1 HPV16E7在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III及宫颈鳞状细胞癌中表达增强
HPV16E7蛋白的表达主要定位在细胞核，本研究结果显示，HPV16E7蛋白在慢性宫颈炎、CINI、CINII-CINIII及宫颈癌中表达率逐渐升高（图1，表1）。

表1 E-cadherin和N-cadherin在宫颈癌变中表达水平比较
Tab. 1 Comparison for expression levels of E-cadherin and N-cadherin in the cervical neoplasma generation
Group HPV16E7n
E-cadherin N-cadherin
-++++++-++++++
Chronic cervicitis NC293351829000 Positive821148000 Negative211241421000
CINI NC5494132851300 Positive275371225200 Negative274161626100
CINII-III NC521011161545610 Positive30879625500 Negative22247920110
SCC NC9871353256416162 Positive59693683311141 Negative3914171731521
NC，不考虑 HPV16E7的表达情况；SCC：鳞状细胞癌；CINII-III：高级别上皮内瘤变:CINI；低级别上皮内瘤变
NC, HPV16E7 expression was not considered; SCC, squamous cell carcinoma; CINII-III, high-grade intraepithelial neoplasia; CINI, low-grade intraepithelial neoplasia
2 E-cadherin在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III及宫颈鳞状细胞癌中的表达情况及与HPV16E7的关系E-cadherin的表达主要定位在细胞膜。

在慢性宫颈炎、CINI、CINII-CINIII及宫颈癌中E-cadherin 表达逐渐降低（r=-0.154，P=0.018）（图1）。

HPV16E7阳性的CINII-III及宫颈鳞状细胞癌标本中E-cadherin的表达明显低于HPV16E7阴性标本（P=0.047，P=0.002），而CINI及慢性宫颈炎组差异没有有统计学意义（P>0.05）（表1）。

3 N-cadherin在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III及宫颈鳞状细胞癌中的表达情况及与HPV16E7的关系N-cadherin的表达主要定位在细胞质，且更倾向于分布在癌巢的最外围，形态呈长梭形(图1)。

在慢性宫颈炎、CINI、CINII-CINIII及宫颈癌中N-cad-herin随着宫颈癌变的进展表达逐渐升高（r=0.362，P=0.000）；宫颈鳞状细胞癌组内比较显示，HPV16E7阳性者N-cadherin表达明显高于HPV16E7阴性者（P=0.014）（表1）。

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图1 宫颈癌变中HPV16E7、E-cadherin、N-cadherin表达及CD163+巨噬细胞分布的MaxVision法免疫组织化学检测。

A，慢性宫颈炎中HPV16E7蛋白呈阴性表达；E、I、M、Q，HPV16E7蛋白在宫颈癌前病变及鳞状细胞癌中呈阳性表达；B、F、J、N、R，随着宫颈癌变的发生E-cadherin的表达逐渐降低；C、G、K，N-cadherin在宫颈癌前病变中呈阴性表达；O，在宫颈癌中，N-cadherin表达趋向于分布在癌巢边缘的癌细胞，S, 上述宫颈癌中N-cadherin阳性细胞的形态常呈长梭形；D、H、L、P、T，随宫颈癌变的发生CD163+巨噬细胞浸润逐渐增多。

SCC：鳞状细胞癌；CINII-III：高级别上皮内瘤变；CINI：低级别上皮内瘤变。

比例尺，100μm
Fig.1 Immunohistochemical examination (MaxVision method) for expression of HPV16E7, E-cadherin and N-cadherin and distribution of CD163+ macrophages in the cervical neoplasma generation. A, negative expression of HPV16E7 protein in chronic cervicitis; E, I, M, Q, positive expression of HPV16E7 protein in cervical precancerous lesions and squamous cell carcinom; B, F, J, N, R: the expression of E-cadherin was significantly reduced with the cervical neoplasma generation; C, G, K, negative expression of N-cadherin in cervical precancerous lesions ; O, in cervical cancer, N-cadherin expression tended to be distributed in peripheral cells of the cancer nest; S, the morphology of N-cadherin-positive cells often exhibited a long spindle shape; D, H, L, P, T, CD163+ macrophages increased gradually with the cervical neoplasma generation;SCC, squamous cell carcinoma; CINII-III, high-grade intraepithelial neoplasia; CINI, low-grade intraepithelial neoplasia; scale bar, 100μm
4 CD163+巨噬细胞在慢性宫颈炎、CINI、CINII-III及宫颈鳞状细胞癌中的浸润情况及与HPV16E7的关系
CD163主要定位在细胞膜及细胞质中，且更倾向于分布在癌巢浸润前沿的周围间质中。

CD163+巨噬细胞数量随着宫颈癌变的发生逐渐升高（r=0.837，P=0.000）（图1）。

在CINI、CINII-II、宫颈鳞状细胞癌组内，HPV16E7阳性组细胞数量明显高于HPV16E7阴性组，差异有统计学意义（P=0.021，P=0.000，P=0.000）（图2A）。

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5 宫颈癌的癌变过程中不同HPV16E7的表达情况下CD163+巨噬细胞的数目与E-cadherin 表达的关系
在慢性宫颈炎、CINI 、CINII-III 、宫颈鳞状细胞癌中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，
E-cadherin 的表达逐渐降低，二者呈负相关关系（r =-0.274，P=0.000）。

HPV16E7阳性组与HPV16E7阴性组中CD163+巨噬细胞数目与E-cadherin 亦呈明显负相关关系（r =-0.180，P=0.045；r =-0.192，P=0.046）（图2B ，表2
）。

图2不同宫颈病变组织中CD163+巨噬细胞数量及其在不同HPV16E7表达状态下与E-cadherin 及N-cadherin 免疫反应性之间的关系。

A ，不同宫颈病变组织中CD163+巨噬细胞的计数情况；*，0.01<P<0.05；**，P<0.01；SCC ，鳞状细胞癌；CINII-III ，上皮内高级别瘤变；CINI ，上皮内低级别瘤变；NC ，不考虑HPV16E7的表达情况；B ，宫颈癌变过程中，无论HPV16E7的表达如何，CD163+巨噬细胞计数与E-cadherin 的表达均呈负相关关系；C ，鳞状细胞癌中，HPV16E7+组CD163+巨噬细胞计数与E-cadherin 的表达呈正相关，而HPV16E7-组则无相关关系
Fig. 2 The number of CD163+ macrophages in different cervical lesions and their relationship with immunoreactivity of E-cadherin and N-cadherin un -der different HPV16E7 expression status. A, number of CD163+ macrophages in different cervical lesions; *, 0.01<P<0.05; **, P<0.01; SCC, squamous cell carcinoma; CINII-III, high-grade intraepithelial neoplasia; CINI, low-grade intraepithelial neoplasia; NC, HPV16E7 expression was not considered; B , during cervical carcinogenesis, CD163+ macrophages had a negative correlaton with expression of E-cadherin regardless of HPV16E7 status; C, in squamous cell carcinoma, the number of CD163+ macrophages in HPV16E7+ group was positively correlated with the expression of E-cadherin, but not correlated in HPV16E7- group
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讨 论
肿瘤EMT 表现为肿瘤细胞上皮特征的丧失如上皮细胞表型E-cadherin 、β-cadherin 表达的减少以及间质细胞表型如N-cadherin 、vimentin 表达的增加，在宫颈癌中亦存在这种现象[ 8]。

许多研究者将EMT 过程中E-cadherin 的丧失和N-cadherin 表达的增加称为“cadherin switch ”，而“cadherin switch ”被认为是EMT 的主要标志[9,10]。

然而，Abdallah 等[11]最近通过对前列腺癌的研究发现E-cadherin 和N-cadherin 之间没有负相关，推测“cadherin switch ”不是EMT 发展的必要步骤。

本研究结果显示，E-cadherin 的表达随着宫颈癌变的进展表达逐渐降低，而N-cadherin 的表达随着宫颈癌变的进展表达逐渐升高，这一结果符合“cadherin switch ”的特征，提示“cadherin switch ”可能在宫颈癌的癌变过程中具有重要作用。

研究发现HPV16癌基因及E6/E7蛋白与宫颈癌进展和转移过程中的EMT 相关[12,13]，HPV16E7可以和LSD1形成复合物来促进EMT 的发生[14]。

本研究发
现，CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌两组组内比较中，HPV16E7阳性者其E-cadherin 的表达低于HPV16E7阴性患者。

在宫颈鳞状细胞癌中，HPV16E7阳性组的N-cadherin 表达明显高于HPV16E7阴性组，这提示在宫颈癌中，HPV16E7蛋白的表达可能通过调节“cadherin switch ”来促进EMT ，癌前病变中HPV16E7蛋白也参与EMT 的发生。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs ）在肿瘤发生、发展、侵袭和转移过程中发挥重要作用。

在宫颈中，随着癌变程度升高TAMs 数量随之升高[15]。

本研究发现在慢性宫颈炎、CINI 、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌中，CD163+巨噬细胞数目逐渐增多，这与Hammes LS 等[15]的研究结果相符。

Swangphon P 等[16]发现TAMs 的浸润与高危HPV E6/E7 mRNA 表达之间明显相关，并与宫颈病变严重程度相对应。

Chen XJ 等[17]亦有类似报道。

本研究结果显示，在CINI 、CINII-III 及宫颈鳞状细胞癌组内比较中，HPV16E7阳性患者其CD163+巨噬细胞数目明显高于HPV16E7阴性患者，由此提示HPV16E7的表达可能促进了TAMs
表2 宫颈癌变过程中CD163+巨噬细胞数目与E-cadherin 的相关关系
Tab. 2 Correlation between the number of CD163+ macrophages and E-cadherin during cervical carcinogenesis
HPV16E7E-cadherin
r P -++++++CD163
Positive
52.0±22.870.7±33.569.6±24.141.0±16.7-0.1800.045Negative 39.0±14.647.4±26.744.1±19.435.9±19.3-0.1920.046NC
48.4±21.4
62.4±32.8
59.7±25.5
37.7±18.5
-0.274
0.000
NC ，不考虑HPV16E7的表达情况NC, HPV16E7 expression was not considered
表3 鳞状细胞癌中CD163+巨噬细胞数目与N-cadherin 的相关关系
Tab. 3 Correlation between the number of CD163+ macrophages and N-cadherin in squamous cell carcinoma
HPV16E7N-cadherin
r P -++++++CD163
Positive
70.39±10.7889.93±22.3597.54±22.05107.80.5870.000Negative 58.45±12.9064.53±11.7293.60±1.41420.2520.122NC
64.61±13.21
81.99±22.75
97.05±20.58
75.3±45.96
0.531
0.000
NC ，不考虑HPV16E7的表达情况NC, HPV16E7 expression was not considered.
6 宫颈鳞状细胞癌中不同HPV16E7表达情况下CD163+巨噬细胞的数目与N-cadherin 表达的关系
宫颈鳞状细胞癌中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，N-cadherin 的表达逐渐增加（r =0.531，
P=0.000）。

HPV16E7阳性组中CD163+巨噬细胞数目与N-cadherin 的表达仍然呈正相关关系（r =0.587，P=0.000），而HPV16E7阴性组二者无明显相关关系（r =0.252，P=0.122）（图2C ，表3）。

中国组织化学与细胞化学杂志
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的浸润，与前述结果相符合。

研究发现，癌症募集和激活TAM的能力在很大程度上取决于恶性细胞获得未分化的间充质表型的能力，而获得未分化间充质表型也是EMT的一部分[18,19]。

在胆管细胞癌[20]、三阴性乳腺癌[21]、肺癌[22]、口腔癌[23]、结肠癌[24,25]、肝细胞癌[26]中，TAMs可以通过诱导EMT的发生来促进肿瘤的侵袭、进展或转移。

在宫颈癌变过程中情况又如何呢？本研究结果显示，宫颈癌变过程中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，E-cadherin的表达逐渐降低，二者呈负相关关系，在宫颈鳞状细胞癌中，随着CD163+巨噬细胞数目的增多，N-cadherin的表达逐渐增加，二者呈正相关关系。

从这些结果我们初步推测TAMs可能通过调节“cadherin switch”诱导EMT 的发生。

那么，HPV16E7的表达是否影响了此过程呢？我们的研究结果显示不管HPV16E7阳性或是阴性，CD163+巨噬细胞数目与E-cadherin表达均呈负相关关系，HPV16E7阳性组中CD163+巨噬细胞数目与N-cadherin的表达呈正相关关系，而HPV16E7阴性组二者无明显相关关系，提示HPV16E7的表达可能并非是影响CD163+巨噬细胞相关的E-cadherin 表达降低的直接因素。

但HPV16E7的表达可能参与了CD163+巨噬细胞相关的N-cadherin表达增高的过程。

所以我们推测，HPV16E7蛋白促进EMT 中N-cadherin蛋白表达增加可能是通过诱导TAMs 的浸润来完成的，而HPV16E7蛋白促进EMT中E-cadherin蛋白表达的降低，其机制并没有TAMs的参与，具体途径还有待进一步研究。

参 考 文 献
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