肠道病毒71型灭活疫苗ppt课件

Sinovac 分别以 400 U 加以氢氧化铝佐剂的疫苗或安慰剂随机接种 10 077 名受试者， 其疫苗效能可达 88% 以上。
CAMS 则对 12 000 名 6 ～ 71 月龄的婴儿和儿童随机接种了 100 U 疫苗或安慰剂，疫苗也显示出了良好的安全性和免疫原性，但具体信息不详
NHＲI 研制的疫苗不仅对EV71B1、 B5 和 C4A 亚型具有较强的中和活性，对柯萨奇病毒 A16 也有一定的交叉中和活性
ＥＶ７１灭活疫苗免疫原性检测及保护性研究
ＥＶ７１灭活疫苗制备一般流程
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病毒液的灭活收获病毒液按 １∶４０００（Ｖ／Ｖ）加入福尔马林，３７ ℃灭活，并每间隔2ｈ取样，采用微量滴定法进行感染性滴度检测以观察其灭活效果。
病毒微量滴定法：将灭活后的病毒液按１０ 倍梯度稀释，以 １００μ ｌ／孔置于９６孔平底细胞培养板，每个稀释度接种８孔， 每孔按 １×１０４细胞／１００μｌ培养液加入Ｖｅｒｏ细胞，３、７ｄ时观察记录病变，超过５０％细胞病变孔判为病变阳性
在Ⅲ期试验中
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中国医学科学院医学生物学研究所全球首个针对肠道病毒71型（EV71）感染所致手足口病的创新疫苗
通用名称：肠道病毒71型灭活疫苗（人二倍体细胞）
（1）疫苗毒种是我国流行株，具有良好的免疫原性和抗原交叉反应性。（2）细胞基质采用人胚肺二倍体细胞，有效保证在儿童群体中使用的安全性。（3）生产技术采用细胞工厂大规模培养技术，有效提高疫苗产能和质量。（4）建立的疫苗保护性评价婴猴动物模型，为开展疫苗保护性效果的系统分析和评价创造基础条件。（5）对不同基因型毒株的交叉保护试验，进一步证明该疫苗对多数基因型别的EV71感染均具有保护效果。
EV71简介
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人血浆中含有的中和抗体可在细胞基质上中和不同的 EV71。可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病及死亡现象，而在毒株攻击乳鼠的同时或其后限定的时间内注射含 EV71 中和抗体的人血浆，可起到保护乳鼠的作用
EV71 感染或疫苗免疫动物后产生的抗体具有病毒中和活性；中和抗体在体外与 EV71 中和后，可减少或消除毒株攻击乳鼠后的致病性；
（6）疫苗诱导免疫反应的相关研究，为进一步阐明EV71感染致病机制及疫苗免疫学机理提供了大量数据和资料。是目前国内外新型疫苗研发中的重要创新点。
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北京科兴生物制品有限公司自主研发的预防用生物制品1类新药益尔来福获批
通用名称：肠道病毒71型灭活疫苗（Vero细胞）
全球首创预防用生物制品1类新药 对EV71所致手足口病的保护率高达94.6% 对EV71所致手足口病重症和住院病例保护率为100% ​稳定性良好，有效期长达3年 不添加防腐剂与稳定剂，进一步降低安全风险 全球最高标准控制Vero细胞宿主蛋白与DNA残留
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EV71 疫苗除能诱导中和抗体外，还能诱导细胞免疫应答，其也具有免疫保护作用。
EV71疫苗可行性
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全病毒灭活疫苗
减毒活疫苗
基因工程疫苗
病毒样颗粒( VLPs)疫苗
肠道病毒 71 型疫苗分类
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合成肽疫苗
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为什么选择灭活疫苗
生产工艺成熟， 具有良好的免疫原性及安全性， 众多研究证明灭活 EV71 病毒疫苗较其他形式疫苗， 如 VP1 亚单位疫苗、 DNA 疫苗、 VLP 疫苗有更好的免疫效果， 是 EV71 疫苗发展的主要类型。目前进入临床研究的 5 株 EV71 疫苗均为灭活疫苗， 而临床试验结果表明这些疫苗均有较好的免疫原性及安全性。（2014）
在中国内地1998 年后流 行株均为 C4， 故中国企业研发的疫苗均以 C4 型毒株作为疫苗株。
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二倍体细胞疫苗生产工艺：ＥＶ７１疫苗株 ＦＹ －２３Ｋ－Ｂ株在人二倍体细胞 （ＫＭＢ１７株）上适应传代，收获病毒液，经灭活、浓缩、层析过滤，吸附氢氧化铝佐剂后，制备成为肠道病毒７１ 型灭活疫苗成品。
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参考文献
[1].梁燕, 赵红玲, 刘龙丁, 廖芸, 董承红, 纳锐雄, et al. 肠道病毒71型灭活疫苗的规模化制备和免疫原性研究[J]. 中国病毒病杂志. 2012(06).[2].梁争论. 我国肠道病毒71型灭活疫苗研发现状[J]. 中国病毒病杂志. 2012(06).[3].马洁, 邓永强, 秦成峰, 秦鄂德. 肠道病毒71型疫苗研究进展[J]. 军事医学. 2015(07).[4].王一平, 姚昕, 毛群颖, 梁争论. 肠道病毒71型疫苗质量控制研究进展[J]. 微生物学免疫学进展. 2015(05).[5].肖慧, 明平刚, 陈晓琦, 徐葛林. 肠道病毒71型灭活疫苗分离纯化方法的研究进展[J]. 中国生物制品学杂志. 2015(10).
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Vigoo 以 160、 320和 640 U 剂量加以氢氧化铝佐剂的福尔马林灭活疫苗随机接种包括 12 ～ 36 月龄儿童和 6 ～ 11 月龄婴儿在内的 12 000名受试者。结果显示，疫苗仍然具有较好的疫苗效能， 可使约 90% 的受试者能抵御 HFMD，80% 的抵御疱疹性咽峡炎或相关神经症状。
离子交换层析（ ion-exchange chromatography，IEC ）
肠道病毒 71 型灭活疫苗分离纯化方法
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疏水相互作用层析（ hydrophobic interaction chromatography，HIC）
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疫苗标准方面国家质量控制和审评部门结合2010版 《 中华人民共和国药典》 和修订企业注册标准中对预防性疫苗的要求，对申报临床试验的灭活疫 苗 毒 株、原 液 和 成 品 标 准 进 行 规 范 和 统一。对种子库要求 疫 苗 主 要 保 护 区 ＶＰ１ 氨 基 酸 序列在三级种子批均保持一致；
肠道病毒71型灭1 型( enterovirus 71， EV71) 为单股正链 ＲNA病毒，是小 ＲNA 病 毒 科 肠 道 病 毒 属 中 的 重 要 成 员 之 一。EV71 基因组由 7400 多个核苷酸构成， 包含一个开放读码框，编码大约 2200 个氨基酸的多聚蛋白。该多聚蛋白可被进一步水解成 P1、 P2 和 P3 三个前体蛋白，P1 前体蛋白编码VP1、 VP2、 VP3 和 VP4 四种结构蛋白，P2、 P3 前体蛋白编码 7种非结构蛋白( 2A ～ 2C 和 3A ～ 3D) EV71 包括 A、 B 和C 3 种基因型，11 个基因亚型， 每种亚型感染均可引起手足口病( hand， foot and mouth disease， HFMD
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灭活疫苗仍然存在问题
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EV71 免疫保护机制复杂，除体液免疫外， 细胞免疫也发挥着重要的作用。然而，灭活疫苗主要诱导的是体液免疫， 细胞免疫不够充分。
灭活疫苗生产和运输成本高昂。疫苗效力较高而疫苗价格较低的常规免疫才符合我国的成本效益 ， 这可能会制约灭活疫苗的应用。
EV71 本身存在抗体依赖性增强感染现象，不恰当的疫苗接种有可能会增加重症病例的风险。
Ｖｅｒｏ细胞疫苗生产工艺：疫苗株ＥＶ７１ＡＨ－ＦＹ７ＶＰ５株或Ｈ０７株感染 Ｖｅｒｏ细胞后，收获病毒培养液，经超滤浓缩、凝胶过滤、离子交换层析纯化、甲醛灭活，吸附氢氧化铝佐剂后，制备 ＥＶ7１灭活疫苗成品。
ＥＶ７１灭活疫苗两种类型
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ＥＶ７１病 毒 液 的培养 及 灭 活
EV71病毒的纯化、检测及制备
疫苗纯度控制方面在疫苗纯度控制上，
高效液相色谱法 （ＨＰＬＣ）规定颗粒峰面积不低于９５．０％，疫苗动物效力统一修定为以１针后半数有效量 （ＥＤ５０）作 为 效 力 指 标， 保证了疫苗生产的一致性和有效性；
标准品方面中国食品药品检定研究院 （中检院）联合３家企业已完成了疫苗中和抗体检测标准品和疫苗抗原定量标 准品的研制（２０１０国生标字００２３、００２４） 。正在开展的疫苗标准研究 包括：比 活 一 致 性 标 准，Ｖｅｒｏ细 胞 残 余ＤNＡ标准等；开展的疫苗标准品研究 包括疫苗效力标准品和冻干标准中和抗体检测株等
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目前， 亚洲地区进入临床试验阶段的灭活疫苗有 5 家( 其中 3 家来自中国大陆，另外 2 家分别来自我国台湾和新加坡) ，他们采用的病毒株、细胞系、 培养技术和免疫佐剂有所不同( 表 1)
北京微谷生物医药有限公司( Vigoo) 、 中国科兴生物制品有限公司( Inovac) 和中国医学科学院( CAMS) 所研制的疫苗在 2013 年已完成了临床Ⅲ期试验， 而我国台湾国家卫生研究院( NHＲI) 和新加坡Inviragen公司研制的疫苗正在进行临床Ⅰ期试验( 表 2) 。
ＥＶ７１病 毒 液 的 灭 活
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EV71病毒的纯化、检测及制备
ＳＤＳ －ＰＡＧＥ 分 析
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分 析
ＨＰＬＣ 检测
将纯化后的产品进行灭活疫苗成品的制备
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膜分离技术
超速离心
凝胶过滤层析（ gel filtration chromatography，GF ）