实验二 荧光显微镜的基本使用方法

实验二荧光显微镜的基本使用方法
荧光显微术是在细胞或组织水平上对生物大分子进行定位和动态观察的最常用的实验方法。

它广泛地应用于核酸、蛋白质、细胞器、细胞骨架、激素、离子等多种细胞结构或物质的定位和功能分析。

很多生命科学的研究工作都需要频繁地使用荧光显微镜。

比如，采用荧光探针的原位分子杂交用于确定某个基因在组织中的表达或在染色体上的定位（Polak et al. 1999; Andreeff and Wiley-Liss 1999），绿色荧光蛋白基因（gfp）用于了解某个基因产物在组织和细胞中的特异性分布（Chalfie et al. 1994; Haseloff and Amos 1995）等等。

然而，在我们接触的一些低年级研究生中，一些同学并没有很好地掌握荧光显微镜的基本原理和使用方法。

他们拍摄的荧光显微照片往往不能满足国际性高水平学术刊物的要求。

这种状况既不利于科研效率的提高，也限制了研究成果的发表。

因此，了解荧光显微术中的一些基本原理和注意事项、掌握荧光显微镜的基本使用方法是非常重要和有意义的。

本实验讲解荧光显微镜的基本结构和使用方法。

要求学生通过细胞核、细胞质DNA的荧光显微显示以及转绿色荧光蛋白基因拟南芥根、茎、叶细胞的观察掌握荧光显微术的基本原理和注意事项，熟练掌握荧光显微镜的使用方法。

实验目的：
1. 了解荧光显微镜的基本结构；
2. 掌握荧光显微术的基本原理和注意事项；
3. 掌握核酸的荧光显示技术，直观地认识细胞质DNA的存在；
4. 了解绿色荧光蛋白（GFP）在蛋白质定位等研究中的应用，直观地认识GFP的荧光显微
效果。

实验内容：
1.荧光显微镜的基本原理和结构
荧光显微镜的放大成像原理与普通透射光显微镜完全相同。

不同的是荧光显微镜需要另外的激发光光源和光路。

因此，只要加上激发光光源和光路，再换上允许激发光通过的目镜（荧光显微镜的目镜在透镜玻璃的材质上与普通透射光显微镜不同），一台普通的透射光显微镜就可以被升级成一台荧光显微镜了。

图2是本实验室使用的荧光显微镜的实物照片。

与实验一使用的普通透射光显微镜相比，我们很容易找到荧光显微镜上多出来的部分。

这些就是荧光显微镜的激发光光源和光路。

图1是常用的落射式荧光显微镜的激发光光源和光路示意图。

所谓落射式是指激发光自上而下穿过物镜，继而照射材料顶面的激发方式。

这种激发方式可以得到较清晰的荧光图像。

与之相对应的是透射式荧光显微镜。

由于图像效果不如落射式，透射式荧光显微镜目前已很少使用。

在荧光显微镜的光源和光路中，最重要
的部分为汞灯（1）、激发光挡片、激发滤色镜
和分色镜（见图1、2）。

汞灯发出高亮度的
全色光，是荧光显微镜的激发光光源。

激发
光挡片用于适时地切断激发光光路（如图
1B），以减少样品的荧光淬灭。

激发滤色镜
是一些单色光滤镜，用于从汞灯的全色光中
滤出激发样品所需要的单色光。

在具体的实
验研究中，样品往往需要用不同的荧光物质
（染料）进行标记或染色，而不同的荧光物
质可能需要不同波长的激发光。

因此，使用
荧光显微镜时需要根据样品上标记的荧光
染料的激发要求更换激发滤色镜。

一般的科
研用荧光显微镜至少需要配备三套激发滤
色镜，即紫外光、兰光和绿光激发滤色镜。

分色镜是保证荧光显微成像质量的关键部件。

它的特点是完全反射某个特定波段的激发光，而允许该波段以外的光，如样品上的荧光信号自由通过（如图1A）。

分色镜的这种特性保证了只有样品荧光进入目镜光路。

由于一种分色镜只反射特定波段的一种激发光，所以在荧光显微镜的使用过程中它也必须随着激发滤色镜的更换而更换。

在一些厂家生产的荧光显微镜上，分色镜和激发滤色镜被做成了一个一体式的组件（如本实验使用的显微镜，见图2），以减少分别更换的麻烦。

2.荧光显微术的
基本原理和注意事项
尽管荧光显微镜与普通透射光显微镜外观相近且共用同一套成像光路，但它们的实验用途完全不同。

透射光显微镜用于观察细胞或组织的结构，而荧光显微镜则用于检测细胞或组织中特定的物质，如核酸、蛋白质等生物分子的存在和分布。

因此，荧光显微术实际上是一种化学检测手段。

它的原理是让细胞或组织中的特定分子带上荧光，我们通过观察荧光信号
来确定这种分子的存在和分布。

虽然荧光显微镜与普通透射光显微镜的分辨率是一样的（≤0.2μm），但由于荧光可以增强被标记分子的光学信号，加上荧光显微术的强反差特性，一些在透射光下无法观察到的分子组分，如由微管蛋白、肌动蛋白组成的细胞骨架等在荧光显微镜下就可以被清楚地显现出来。

可见，利用荧光显微镜检测细胞内物质时，最首要的条件是要让被检测的组分“亮起来”。

在个别种类的细胞中，一些特定的分子，如植物叶绿体中的叶绿素、花粉壁中的孢粉素等分子在常见的蓝色激发光下就可以发出持久、稳定的荧光。

因此，检测这类分子只需要把细胞放到荧光显微镜下观察即可。

这种除提供必要的激发光外不需要任何处理，物质自身可以直接发出的荧光被称为自发荧光。

然而，绝大多数生物分子并不具备给出自发荧光的特性。

要想观察和检测这些分子，必须通过人为的操作给这些分子带上荧光。

这个过程被称为荧光标记。

少数生物分子由于其分子上特殊的结构，很容易与一些可以被激发出荧光的小分子化合物形成紧密的结合。

这种结合为荧光标记提供了一种简便的途径。

比如，细胞中重要的大分子物质核酸具备与小分子荧光化合物溴化乙锭直接结合的特点。

这种结合为核酸的荧光标记提供了直接的标记分子。

我们把荧光标记分子与细胞组分直接结合而使细胞组分带上的荧光称为直接荧光。

除了溴化乙锭以外，可以与核酸直接结合的荧光小分子化合物还有很多。

比如荧光显微术中常用的DAPI、YO-PRO-1以及SYBR Green 1等等（2）。

这些荧光小分子化合物通常具有较强的核酸结合特性并能发出足够强度的荧光。

我们可以根据它们的不同特点，如激发光和荧光的波长、对DNA和RNA的选择结合能力以及抗淬灭特点等进行选择使用。

利用自发荧光和直接荧光进行细胞内组分定位的实验方法非常简单。

在细胞生物学的研究中，绝大部分细胞组分，如细胞内各种功能不同的蛋白质等既不能发出自发荧光，也不能与荧光小分子化合物结合。

在这种情况下，需要制备待检测蛋白质的抗体（一级抗体），使之与细胞内的待检测蛋白结合后，再用藕联有荧光素的二级抗体去标记一级抗体。

这种方法被称作间接荧光法。

具体的实验操作见后面的实验四。

理论上间接荧光法可以用于细胞内所有蛋白质的检测和定位。

上面已经提到了荧光的淬灭。

在荧光显微术中，所有的荧光染料或荧光素都会发生淬灭现象。

它表现为细胞上的标记荧光信号在最初开启激发光的时候强度较高，明显易见，而随着观察（激发光照射）时间的延长，信号逐渐减弱甚至完全消失。

显然，淬灭现象不利于实验结果的详细观察和记录。

我们因此必须尽量减少样品上荧光信号的淬灭。

一些有机化合物具有延缓淬灭的作用，被称为淬灭保护剂。

在荧光染液或样品的封片缓冲液中适量添加淬灭保护剂可以在一定程度上延缓淬灭。

但实际上良好的荧光显微观察操作习惯对于减少信号的淬灭更为有效。

首先，荧光的淬灭与激发光的照射时间成正比。

因此，我们应该尽量减少观察时间外激发光对样品的照射。

在本实验使用的荧光显微镜的左侧有一个激发光挡片调节柄（见图2）。

利用该调节柄可以完全阻断激发光光路。

在正式观察样品之前，激发光光路应该处于完全阻断状态。

否则，在我们将样品放到载物台上，移动样品台将样品调整到物镜位置，找到要观察的细胞并进行调焦的过程中，样品上的荧光可能已经发生了相当程度的淬灭。

为了避免观察前不必要的淬灭，上述一系列操作需要在透射光源下进行。

此外，当眼睛离开物镜进行记
录或将显微镜交给合作实验者观察时，要随手阻断激发光光路。

实践结果表明，熟练、规范和合理的观察操作可以将样品淬灭对观察和记录造成的影响降低到最小限度。

另外，荧光信号的淬灭还与激发光的强度成正比。

因此，在可以观察到荧光信号的情况下，应该尽量降低激发光的强度。

这样做还有利于降低背景（利用拍照记录实验结果时非常重要）。

在本实验使用的荧光显微镜的右侧还有一个激发光挡片调节柄（见图2），用于部分阻断激发光。

激发光的强度降低后，样品的淬灭时间可以得到有效的延长。

3. 细胞核与细胞质DNA的直接荧光染色和观察
本实验选用YO-PRO-1（3）作为荧光染料检测迎春花成熟花粉（4）细胞中的细胞核与细胞质DNA。

前面说过，可用于DNA荧光标记的染料很多。

本实验选用YO-PRO-1的原因有两条：1）其激发波长（491 nm兰光）与显微镜配置的滤镜系统相符；2）其荧光不易淬灭。

实验按下述方法（参见图3）操作：1）取
一干净的载玻片，在其中央同一位置滴置浓度
为1ug/ml的YO-PRO-1和3%的戊二醛各5ul；
2）用小镊子从迎春花中取一个花药，将适量
花粉（约100粒）抖入载片上的液滴；3）轻
盖盖玻片，尽量避免封入气泡；4）用拇指透
过双层滤纸用力推压该片；5）5分钟后在兰
色激发光下观察。

上述操作的意图是让新鲜花粉在推压力
量的作用下瞬间朝一个（推压）方向破裂，其
中的花粉细胞在涌出花粉的同时被压成一个
薄层并同时被固定和染色。

操作方法虽然简单，
但要得到理想的制样结果必须注意下面的要
点。

第一，细胞质DNA量少且布局分散，需
要将细胞质制备成足够薄的薄层（理论上接近
于线粒体的直径最为理想）时才能清楚地观察到其中线粒体、质体DNA的荧光信号。

这是在荧光显微镜下能否观察到细胞质DNA的关键。

因此，每次制片不宜取过多数量的花粉，否则其对盖片的支撑力较大，不易制备出足够薄的薄层样品。

基于类似的原因，盖片与载片之间的花粉宜分散不宜成堆。

第二，用力推压的目的是让花粉朝一个方向裂开并形成细胞质薄层。

如果推压的用力方向不明显（竖直施压），则花粉会在其四周发生多个小破口，导致花粉细胞质四分五裂，不易观察到典型的花粉细胞。

第三，尽管推压必须用力且拇指需要在滤纸隔层上横向滑动，但推压过程中一定不要使盖片和载片之间产生滑动，否则花粉细胞质会破碎变形，导致制样失败。

迎春花的成熟花粉由一个营养细胞和两个精细胞组成。

营养细胞的细胞质散开后占据很大面积，其细胞核性状不规则且荧光较弱。

两个精细胞呈长条状，细胞质内有明显的点状荧光，即细胞质DNA的荧光。

仔细观察这些荧光点，可以发现它们中有较大和较小的两种。

实验证明这两种荧光亮点分别发自质体和线粒体DNA（5）。

如果样品中只能看到精细胞的形状而无法看到其细胞质中的荧光亮点，则说明样品的厚度没有达到观察细胞质DNA的“足够薄”的要求，需要重新制片。

此时应该注意减少花粉量或加大推压力度。

需要说明的是，花粉细胞质经一次推压未达到“足够薄”的厚度时，再次推压并不能有效地使其厚度变薄。

此时只能再取新鲜花粉重新制片。

4. 绿色荧光蛋白（GFP）转基因拟南芥活组织和细胞的观察
绿色荧光蛋白是一种水母体内编码的小分子蛋白，具有在激发光下发出绿色荧光的特性。

该蛋白经过一定的氨基酸改良后，荧光强度得到了明显提高。

由于绿色荧光蛋白分子量小，通过基因操作的方法将之与动植物细胞内多数蛋白质进行融合后并不影响这些蛋白质的功能或构象。

因此，利用绿色荧光蛋白技术理论上可以为绝大多数已知基因序列的蛋白质提供荧光标记。

近年来，绿色荧光蛋白在细胞的结构与功能以及基因或蛋白的功能等研究中得到了越来越普遍的应用。

本实验选用一种将绿色荧光蛋白定位到线粒体膜上的转基因拟南芥（6），观察其幼苗植株的荧光特性及线粒体在根组织不同细胞、叶肉细胞及叶表皮细胞中的分布。

实验的操作方法如下：1）取一干净的载玻片，在其中央同一位置放一大滴蒸馏水；2）用小镊子从培养皿内拔一棵2-4叶龄的转基因拟南芥幼苗，在另一放有水的培养皿内洗净幼苗根部的琼脂糖后将其转移到载片上的水滴中；3）轻盖盖玻片，尽量避免封入气泡；4）取一棵同样大小的未转基因的拟南芥幼苗做对照，按上面的方法清洗根部并封入盖片与载片之间的水中；5）用兰色激发光，在4倍物镜下观察转基因幼苗根茎叶上不同部位的荧光分布情况并与未转基因的幼苗进行比较（为了减少淬灭，此项观察要尽量快）；6）从载物台上取下样品放到试验台上，用拇指透过双层滤纸垂直向下用力挤压盖片，使盖片与载片之间的拟南芥幼苗扁平变形；7）用40倍物镜观察幼苗根、茎和叶片细胞中线粒体的分布；8）另取一片拟南芥叶片，用小镊子撕取一小块叶片表皮，以上述同样的方法制样，观察表皮细胞、气孔保卫细胞及附带被撕下来的少量叶肉细胞中线粒体的分布。

通过上面的观察，请在实验报告上解释为什么整体根组织上的绿色荧光在根尖处最强，而离开根尖部位往上后逐渐减弱。

本实验还要求以文字和绘图的方式描述所有的实验结果并加以适当的分析。

参考阅读
Polak JM, McGee J, McGee JO (1999) In situ hybridization: principles and practice. Oxford University Press (2nd edition).
Andreeff M, Pinkel D (1999) Introduction to fluorescence in situ hybridisation: principles and clinical applications. Wiley-Liss.
Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science 263: 802-805.
Haseloff J, Amos B (1995) GFP in plants. Trends in Genetics 11: 328-329.
Sodmergen, Bai HH, He JX, Kuroiwa H, Kawano S, Kuroiwa T (1998) Potential for biparental cytoplasmic inheritance in Jasminum officinale and Jasminum nudiflorum. Sex Plant Reprod 11: 107-112.
Sodmergen, Niu JG, Li LJ, He JX, Guo FL (1999) Application of YO-PRO-1 as an epifluorescent dye for in situ detection of small amount DNA in plant cells. J Plant Res 112: 117-122.
注释：
（1）荧光显微镜需要高亮度的全色光作为激发光光源，所以使用特制的汞灯。

汞灯除了亮度和全色光特性以外，还发出巨大的热量。

因此，在使用荧光显微镜的过程中，不要用手触摸汞灯灯室，以免发生灼伤。

同时，不要用显微镜罩、书本、衣物等遮盖灯室，以避免火灾或散热不良造成的灯泡损坏（关机后也不要马上罩起显微镜）。

更换灯泡时，不要用裸手直接触摸灯泡（需配戴干净的棉质手套），也不能用眼睛直视亮起的灯泡。

否则留在灯泡上的指纹有可能导致灯泡散热不匀而爆炸；亮起的灯泡也可能造成眼底灼伤。

此外，汞灯灯泡价格昂贵，且平均寿命只有200小时。

因此在确认不再使用荧光显微镜时应及时把汞灯光源关掉。

但由于开关次数同样与灯泡的寿命直接相关，在关掉公共实验室的荧光显微镜光源前应确认已无他人继续使用。

关掉光源或断电等造成光源意外关闭后，需等待至少15分钟方可重新开启光源。

（2）核酸的荧光染料或与核酸紧密结合的小分子化合物进入细胞后都有可能引起基因转录错误或基因突变。

而后者则有可能导致细胞癌变。

因此，本实验过程中要避免皮肤、衣物、书本等学习用具接触含有YO-PRO-1的染液。

如不慎人体接触了染液，须立即用自来水进行认真清洗。

必要时与授课教师联系。

（3）YO-PRO-1购自美国Molecular Probes公司。

其结构式如下：
该染料的最大激发波长为491nm（兰色），被激发后发出509nm的荧光（黄绿色）。

除了DNA以外，YO-PRO-1还与RNA有一定的结合能力。

但两者相比与DNA的结合强于RNA。

实验证明，YO-PRO-1可用于细胞内微量DNA的显微荧光检测（参见Sodmergen et al. 1999）。

（4）迎春花的成熟花粉由一个营养细胞和两个精细胞组成。

其中精细胞是初学者观察细胞质DNA荧光的理想材料。

这是因为精细胞中的每一个线粒体和质体都包含有较多拷贝的线粒体和质体DNA，荧光强度高，易于观察。

但这种情况只出现于细胞质两系遗传植物（如迎春花、天竺葵、蟹爪莲、月间草、杜鹃、吊兰等）的精细胞。

而绝大多数被子植物（如烟草、拟南芥、百合、水稻等）的精细胞中是很难检测到细胞质DNA 的。

这一点应该引起注意。

有兴趣的同学可以自备各种花粉材料在本实验课上进行荧光检测。

此外，在迎春花花粉的营养细胞中同样存在大量的线粒体和质体。

但营养细胞中的线粒体和质体只含有较少拷贝的DNA，需要充分染色后借助100倍物镜观察。

（5）参见Sodmergen et al. 1998。

（6）本实验使用的转基因拟南芥整合了由线粒体ATP酶δ亚基基因和绿色荧光蛋白基因组成的融合基因（ATPase δ subunit-gfp）。

该融合基因由35s启动子调控。