分子生物学之表观遗传学

分子生物学：表观遗传学
表观遗传学( epigenetics):指非基因序列变化导致的基因表达的可遗传的改变。

细胞中生物信息的表达受两种因素的调控：遗传调控提供了“生产’维持生命活动所必需的蛋白质的“蓝本”，而表观遗传调控则指导细胞怎样、何时和何地表达这些遗传信息。

表观遗传学研究的主要内容：DNA的甲基化，染色质的物理重塑和化学修饰，非编码RNA基因调节。

依赖ATP的染色质的重塑由ATP水解释放的能量可以使DNA和组蛋白的构象发生改变；包括DNA的甲基化和组蛋白N端尾巴上特殊位点的化学基团修饰，同样可以直按或间接地影响染色质的结构和功能。

二者之间相互渗透，相互作用，共同影响着染色质的结构和基因的表达。

此外，近些年发现转录组(transcriptome)中组有多种非编码RNA广泛参与基因表达调控，非编码RNA的基因调节也可属于表观遗传学的研究的范畴。

DNA甲基化的概况
DNA的甲基化既可以发生在腺嘌呤的第6位氮原子上，也可以发生在胞嘧啶的第5位碳原子上。

*在真核生物中，DNA甲基化只发生在胞嘧啶第5位碳原子上。

真核DNA甲基化由DNA甲基转移酶(Dnmt, DNA methyltransferase)催化，S-腺苷甲硫氨酸(SAM, S-adenosyl methionine)作为甲基供体，将甲基转移到胞嘧啶上，生成5一甲基胞嘧啶(5-mC)。

在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG双核苷酸序列，全部CG二核苷酸中约
70%~80%的C是甲基化（mCpG), 所以CpG称为甲基化位点。

CG抑制:DNA中CG的排列出现的概率小于期望值1/16（A42+4=16），如人的基因组中CG排列小于1%，而非随机期望的约6%（1/16）.
基因组中的CpG位点并非均一分布。

在某些区域中(大约有300～3 000 bp)，CpG位点出现的密度高(50%或更高），这些区域即所谓的CpG岛。

大部分CpG岛(>200bp, C+G含量=/>50%. CpG观测值/期望值=/>0.6) 位于基因的5’端，包括基因的启动子区域和第一外显子区，而且60%的人类(哺乳动物40%)基因组的启动子区都含有CpG岛(几乎所有管家基因都存在CpG岛），它们在基因表达调控中可能发挥着重要的作用。

另外,DNA复制起始点也往往与CpG岛位置相互重合，但是具体的生物学意义尚待研究。

甲基化反应分为：维持性甲基化(maintenance methylation)和从头甲基化(de novo methylation)。

从头甲基化：是对DNA上甲基状态的重新构建，不依赖DNA复制，由DNMT3a/3b催化, 在完全非甲基化的位点上由引入甲基。

这是甲基化的建立机制。

维持性甲基化：与DNA的复制相关联，DNA复制后，新合成的子代链是非甲基化的，DNMT1识别新生成的DNA双链中亲代单链上的mCpG位点，催化互补链相应位置的甲基化，以维持亲代双链甲基化的状态。

DNA（CpG岛）甲基化修饰，主要发挥对DNA的保护作用，抑制基因转录。

这种修饰已发现这和许多重要的生物现象相关，包括：染色质结构改变、基因印迹、转座子和X 染色体活性抑制、细胞分化、以及包括癌症等疾病发生。

DNA（CpG岛）甲基化由各种DNA甲基化转移酶(DNA methyl transferase, DNMT) 完成。

其生物效应则主要通过一些含有与mCpG结合(methyl-CpG-binding domain, MBD)结构域的蛋白MBDP介导。

DNMT1:发挥DNA维持性甲基化的重要作用，此外还参与了许多重要生命活动，如在DNA 复制修复过程中发挥要的作用。

甲基化DNA的最小结构单位称为甲基CpG结合域(Methyl-CpG-binding domain, MBD), 甲基化结合蛋白家族据其结构域不同, 分为三大类：
第一类：蛋白质仅含有MBD结构域(有的还有转录抑制结构域),包括MeCP2、MBD1、MBD2、MBD3、和MBD4，共5种;
第二类：蛋白质除了MBD结构域外，其C端还有DDT、PHD、bromodomain三种蛋白质
结构，包括人类BA22a和BA22b以及鼠TIP5等；
第三类：蛋白质在MBD的C端有Pre-SET和SET的结构域，如人类的SETDB1和CLLD8。

MBD2a 的双重作用: 抑制CRE甲基化基因的转录；增强CRE非甲基化基因的转录。

(A) 当基因启动子区的DNA元件CRE甲基化时，
MBD2a可以识别甲基化修饰，通过招募其他蛋白形成MeCP1复合物抑制基因的表达。

(B)当CRE非甲基化时，转录因子CREB与该元件结合，通过RHA招募RNA聚合酶，启动转录，此时MBD2a可以与RHA结合，增强转录激活的效应。

DNA甲基化模式的建立:
1、在哺乳动物中，DNMT3a/3b催化DNA重新甲基化；但也在一定条件下参与DNA维持性甲基化，DNMT3a/3b的定位依赖于其本身或相关染色质蛋白与DNA甲基化的识别；
2、在哺乳动物中，DNMT1在体细胞中维持DNA甲基化模式的遗传中发挥主导作用；但DNA甲基化的维持可能是染色质相关蛋白和几种DNA甲基化转移酶协同作用的结果；
3、DNA甲基化模式的维持不是简单的点对点的精确维持，而是一种“状态”维持，即DNA某一区域总体甲基化的状态在细胞分裂过程中是稳定遗传（维持）的，但具体到某个特定的CpG位点，不同细胞克隆或亲代与子代之间可能是不同的。

4、无论基因是激活的还是失活的，体细胞中大部分CpG岛是非甲基化的。

体细胞内的DNA甲基转移酶可能不是以游离状态而是与染色质结合存在的。

5、组蛋白的化学修饰和染色质重塑与DNA甲基化之间有着密切的联系，染色质相关蛋
白的化学修饰和染色质（物理）重塑与DNA甲基化相互影响。

普遍认可的DNA甲基化模式是：DNMT3a/3b催化DNA重新甲基化，DNMT1在体细胞中维持DNA甲基化模式的遗传。

DNA甲基化的维持可能是染色质相关蛋白和几种DNA甲基化转移酶协同作用的结果（DNA 维持甲基化的新模型）
维持甲基化的新模型：
1、DNMT1通过PCNA和/或NP95定位在复制叉并识别半甲基化的DNA，将子链DNA新
掺入的胞嘧啶甲基化，当复制叉过后，被DNMT1遗漏的胞嘧啶可由DNMT3a/3b甲基化。

2、DNMT3a/3b对半甲基化DNA和非甲基化DNA没有选择性，亲代与子代DNA甲基化
的维持是“状态”而非“点对点”的维持。

DNA甲基化的作用机制
DNA甲基化参与的生命活动主要包括：基因调控、DNA的复制与组装、细胞的损伤修复与凋亡，及DNA的转座和重置等方面。

（一）DNA甲基化对基因表达的调控作用
DNA甲基化对基因表达的抑制活性是多方面的作用共同导致的，既有甲基化对转录激活因子直接的排斥作用，也包含有甲基化结合蛋白所介导的对基因表达的抑制活性。

1.甲基化影响一部分转录因子的DNA结合活性
甲基化时，阻碍了转录因子对DNA序列的识别，不能有效启动转录。

2.MBD家族介导的转录抑制（间接抑制）
MBD家族蛋白的MBD结构域可以与甲基化或半甲基化的DNA相互结合；其转录抑制相关的结构域(TRD)可以与多种转录抑制因子相互结合以发挥抑制基因表达的活性。

3.DNMT家族介导的转录抑制
通过影响组蛋白的活性而影响基因的表达。

这一功能的意义可能在于抑制DNA复制过程伴随的基因转录，从而保证复制过程的顺利完成。

4.DNA甲基化和基因表达抑制之间的关系不仅是单向的
（二）DNA甲基化与DNA的复制与染色体的组装
在S期早期，由于常染色质DNA首先进行复制，因而子代产物的组装比较疏松；而在S 期后期，异染色质的DNA开始复制，因而组装的子代DNA结构变得紧密。

这种组装的差异性一部分是通过识别局部甲基化的程度而精密调节的。

碱基序列的合成复制，同时也是维持甲基化的过程，两者的偶联也是依赖一个精密的机制而实现的。

复制初期的复制复合物较小，除了DNA复制的基本成分，还有DNMT1和DMAPl(DNA methyltransferase associated protein l)结合到复制复合物上，抑制可能伴随发生的基因的转录，并且催化实现DNA的维持甲基化。

而在复制晚期，DNA复制复合物逐渐变大，HDAC2．DNMT3a/3b，MBD2-MBD3等都参与了复制复合物的形成，并促进了异染色质结构的形成。

（三）DNA甲基化与细胞损伤与修复
1、甲基化可以引起DNA的多种损伤。

2、甲基化参与到DNA损伤修复并可调控相关基因的表达。

（如DNMTl-/- 的胚胎往往未能出生就死去了，可能就是因为甲基化程度降低，导致凋亡基因的活化，以及染色体的不稳定性增加，从而使细胞对环境变化非常敏感，机体抵抗力下降。

）
3、在错配修复中，甲基化还起着识别新链和旧链的作用，从而正确指导这一过程。

（四）DNA甲基化与DNA的转座
真核基因组DNA大量的转转座成分的存在，一方面可以缓冲对基因组的打击；另一方面，其自身也构成基因组的不未定因素，因此，转座子的活性必须得到有效控制。

逆转座子由于缺失了启动子是没有活性，而少部分有活性的转座子则因为甲基化对它的抑制作用而失活。

在甲基化异常降低的情况下，它们的活性可能增加，而产生逆转录可能会导致关键基因的失活而引起细胞的死亡或癌变。

DNA甲基化的生物效应
（一）甲基化与遗传性疾病的相互关系
（二）甲基化在癌症发生、发展中的作用
肿瘤细胞的甲基化模式与正常细胞相比有较大的改变。

全基因组的甲基化有所下降，但CpG岛的高甲基化异常增高。

基因组的低甲基化会导致基因组不稳定性的增加；局部的高甲基化会抑制抑癌基因的表达，诱使基因突变，还可以导致基因的丢失。

1．甲基化的胞嘧啶是体内突变的热点：(1)甲基化胞嘧啶自发脱氨基增加了C转变为T 的突变频率。

甲基化的胞嘧啶无论是在体内还是体外不需酶的参与就能发生自发脱氨基反应，使m5C转变为T，且不易被修复。

(2)甲基化胞嘧啶的外源性的突变概率也会增高。

甲基化胞嘧啶对紫外线的物理损伤更加敏感，而且与致癌物的亲和力也会增加。

2．CpG岛异常高甲基化：抑癌基因DNA启动子区域的甲基化被看作肿瘤抑制基因失活的主要机制。

3．基因组广泛低甲基化：肿瘤基因组中广泛低甲基化的程度和肿瘤的恶性程度密切相关，低甲基化在诱导染色体不稳定性中也起了极大的作用。

4．癌症演进过程中，甲基化状态的改变：由于不同癌细胞甲基化进展的程度不同，使之成为癌组织异质性的重要原因之一。

DNA甲基化的生物应用
5-氮胞苷和5-氮-2‘-脱氧胞苷是通有效的DNMT抑制剂。

能掺人到DNA直接抑制DNA 合成，并且还能作为胞嘧啶的类似物有效地与DNITl结合，使其不能够再甲基化其他DNA 中的胞嘧啶，失去维持甲基化的能力。

前者还可掺人RNA抑制翻译而后者DNA并与DNMT1不可逆结合，应用性强。

DNA 去甲基化药物
DNA甲基化的检测方法
（一）亚硫酸氢钠法：依赖亚硫酸氢钠(sodium bisulfite)对甲基化和非甲基化的胞嘧啶的化学活性不同把两者区分开来使DNA中的C在转变为T，仅mC 保留为C。

（二）甲基化敏感的限制性内切酶法：
一些限制性内切酶的识别位点中含有CpG双核苷酸序列，而对含mCpG序列则没有结合活性。

这类酶中比较重要的有BstUI、Notl、SmaI 。

设计出的方法有：RLGS、DMH、MCA等
DNA主动去甲基化
哺乳动物主要发生在生殖发育过程的两个阶段：1 受精卵的雄原核；2 胚胎的原生殖细胞
受精卵中的主动去甲基化：在受精卵形成后至雄原核和雌原核融合前，雄原核和雌原核都有明显的甲基化，在受精4~8h(小鼠)后，雄原核的甲基化完全消失，这个过程发生在受精卵形成后的第一次复制之前，因此认为是DNA主动去甲基化，并且推测未知的DNA 去甲基化酶可能存在于卵细胞中。

偶联于DNA损伤一修复的DNA主动去甲基化：哺乳动物中可能也存在与植物中类似的偶联于DNA损伤一修复的DNA主动去甲基化机制。

组蛋白修饰
组蛋白N末端带正电荷的赖氨酸、精氨酸残基和带负电荷的DNA链相互作用也十分重要，它们被修饰能改变DNA和组蛋白的相互作用而影响基因表达。

组蛋白的修饰主要发生在核心组蛋白伸展出来的N端尾巴上(主要是保守性极高的H3和H4)，目前所知的修饰方式有6种：乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化和ADP-
核糖化。

组蛋白乙酰化与去乙酰化修饰
通常情况下，组蛋白的乙酰基化过程总是维持着动态平衡，这种平衡是由组蛋白乙酰基转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰基酶(HDACs)的共同作用来维持的。

组蛋白甲基化
组蛋白甲基化及其调控较其他修饰更为复杂：不仅对转录具有正向或反向调控，同时有多种甲基化修饰状态及多种甲基化酶协同、竞争或特异性调节的组合。

因此，组蛋白甲基化可能广泛参与了基因时空特异性表达等精细调控。

组蛋白N端尾巴上的精氨酸与赖氨酸可以发生甲基化修饰，而且甲基化的修饰是多步进行的。

其中，精氨酸可以发生对称和不对称的双甲基化修饰，而赖氨酸可以产生双甲基化和三甲基化的修饰。

组蛋白调控模式及组蛋白修饰之间的相互作用
在组蛋白调控模式中，与染色质相关的蛋白大致可分为3类，即writers、erasers 与readers 。

其中writers指能特异性产生组蛋白修饰的酶，包括组蛋白甲基化酶和乙酰化酶；erasers旨能去除组蛋白修饰的酶，如去甲基化酶和去乙酰化酶；readers指能特异识别组蛋白修饰并与其结合的蛋白，这类蛋白通常具有一定的结构基础，统称为染色质相关结构域，主要包括Royal超家族的Chromo，Tudor，MBT结构域以及PHD结构域等.三类蛋白构成了writing，reading，erasing的循环路径，是组蛋白修饰精细调控的基础。

组蛋白密码说: 存在一种组蛋白密码将每种组蛋白修饰与特定的生命过程相联系，即参与转录激活或抑制。

组蛋白修饰对基因表达的调控是由众多蛋白结合模块对组蛋白修饰的识别与结合而实现的。

越来越多的研究表明，组蛋白修饰对基因转录活性的调控是局部染色质区域多种修饰共同作用的结果，在此过程中形成了复杂的协同或拮抗作用。

DNA甲基化与组蛋白修饰之间的关系
由于组蛋白的乙酰化状态处于动态平衡过程中，因而对染色体活性的调节有着重要的意义，同时它也是DNA甲基化调节基因表达的重要机制。

组蛋白乙酰化的改变还可能影响DNA甲基化的状态，一些蛋白质兼有DNA甲基转移酶和组蛋白乙酰化识别的结构域，暗示这些蛋白质具有通过识别组蛋白的活性状态来调节DNA甲基化改变的功能。

组蛋白甲基化作为一种稳定的表基因修饰的标志，与DNA的甲基化也有着相互作用。

一方面，H3K9三甲基化被认为是DNA甲基化的必要条件；另一方面，甲基化的DNA与甲基结合蛋白MBD1相作用，继而招Suv39Hl-HP1的复合物，从而抑制相关基因的表达；MBD家族的另一成员MeCP2也具有相似的活性；DNA甲基转移酶DNMT1也被报道可以与Suv39Hl-HP1β相互作用。

两种不同的甲基化遗传模式
表观遗传与疾病
肿瘤发生
DNA甲基化异常与肿瘤发生相关，通常以导致基因表达功能缺失的方式使细胞出现癌变。

1、DNMTs在多种癌变组织中表达增加，可能是引起DNA甲基化异常的原因。

（如在前列腺癌中，CpG岛高甲基化导致谷胱甘肽硫转移酶(Glutathione S-transfcrasc pi 1，GSTPl)失活；乳腺癌、结肠癌与胃癌中也存在特定基因高甲基化的状况。

）
2、DNMT基因表达异常与DNA甲基化异常的发生可能与细胞衰老有关。

衰老细胞发生DNA甲基化漂移，这种现象可能由DNMTs活性降低或表达过高引起。

5一氮杂一2 7一脱氧胞苷（5-aza-2 7-deoxycitydine，作为一种DNMTs抑制剂，被证明有抗癌作用。

）
3、组蛋白乙酰化也与肿瘤发生发展密切相关。

其中组蛋白乙酰化酶p300／CBP可与多种原癌基因及抑癌基因表达产物相互作用，这些蛋白包括Jun，fos，p53，RB等o p300／CBP基因广泛参与了涉及白血病的染色体移位，导致多种包含HAT活性的融合蛋白产生，与白血病的发生发展密切相关。

组蛋白去乙酰基酶包括HDACs及SIRTs等，亦通过多种机制参与癌症进程
组蛋白甲基化也与癌症的关联。

有实验表明H3K4、H3K9及H3K27甲基化通过调控特定基因表达而参与肿瘤发生过程；H3K9与H4K20甲基化的广泛下调与癌症相关
表观遗传与发育
许多重要的转录因子以及DNA甲基化、组蛋白修饰等表观因素参与其中c参与早期的胚胎发育过程。

受精卵形成后，来自卵细胞胞浆中的一系列转录因子如OCT4、SOX2，表观修饰因子EZH2、EED以及染色质重塑因子Brgl对受精卵的发育至关重耍。

卵裂初期：OCT4、SOX2等在维持细胞的多分化潜能；EZH2介导分化相关基因的可逆性失活与激活，调控分化进程；Brgl作为染色质重塑复合物SWIZ SNF的重要组成部分，维持发育初期染色质处于转录活化状态。

8细胞期时，卵裂中细胞出现极性，细胞可对称分裂成两个极性的外细胞(OC)，或者非对称分裂为一个外细胞和一个内细胞(IC)，分别形成外滋养层和内细胞层(ICM)。

转录因子CDX2和OCT4分别对外滋养层和内细胞层的发育是必不可少的。

此外NANOG与ICM 多分化潜能的维持有关。

研究表明精氨酸甲基化转移酶CARM1参与了对NANOG表达的调控，提示表观遗传调控也参与了这个阶段胚胎的发育。

在雌性胚胎的发育早期，父源X染色体非编码RNA XIST的表达，以及随后出现的H3K4me2、H3K4me3的减少和H3K9me2、H3K27me3及H2A泛素化的增加而失活。

当胚胎发育到胚泡阶段，ICM中的原始外胚层细胞(PEct)失活的X染色体上抑制性标记被清除，两条X染色体都处于转录活化状态，而外滋养层细胞中失活的X染色体仍保持失活状态。

失活X染色体的活化是ICM细胞染色质处于“开放”状态的一个表现，是胚胎发育中染色质重编程(reprogamming)的一个过程。

在受精卵植入前，卵裂的细胞基因组经历一个被动DNA去甲基化过程，推测这个过程与建立转录活化的染色质状态有关，有利于发育相关基因的表达。

植入后，胚泡中的ICM 细胞重新建立DNA甲基化模式，而外滋养层细胞仍处于广泛DNA低甲基化状态。

这种差异是由于ICM细胞中DNMT3b特异性表达所致。

当胚胎发育到11.5～12.5天时（人），原生殖细胞(PGC)的DNA再次去甲基化，这个过程同时伴随着亲本印记基因的去甲基化，这种表观遗传变化推测与PGC来源的生殖细胞的多分化潜能维持有关。

在精子发生或卵细胞发育时，印记基因的甲基化模式才再次建立。