一份磷酸化抗体的收藏贴，CST呕心总结技术群常见问题

WB 实验得不到目标蛋白条带，怎么办？
做磷酸化抗体的时候一定要用脱脂奶粉稀释吗？
怎么判断这个抗体是否做够做免疫组织化学实验？
……
WB 简单又复杂，当你闭着眼都能出条带的时候，恭喜你，你是WB 大赢家。

但大多数人，还是会有或多或少的实验困扰，工作排查起来也十分不易。

CST科学家生产验证每一支上市的抗体的每一种应用，CST中国已经总结出一套成功的经验推荐给大家，希望大家能注意这些小细节，拿到高品质的漂亮结果。

如何选择抗体篇
1.我该如何找到我需要的抗体？两个或多个货号，该如何选择？
答：可以进入CST中国官网，在search 方框中输入所需研究蛋白的英文名称，根据Applications（实验种类）和Species-Reactivity（反应种属）去选择。

Species-Reactivity 一栏是验证过的可识别的样本种属，有些种属会加上括号，这表示根据序列同源比对，是100% 符合的，但是我们并没有做过关于这些种属的实验，所以不建议使用。

同等条件下，首选带XP® 标签的抗体，这是我们通过XMT® 技术产生得到的灵敏度、特异性和稳定性表现极佳的抗体，如果所需要的抗体都不带XP® 标签（质量也得到非常好的验证），在实验种类和种属都符合的情况下，可以任意选一个。

若使用CST 抗体，建议严格遵照产品说明书和实验Protocol 来进行操作。

2. 有些抗体名称里有个括号，数字和大写字母组成，什么意思？
括号里面的是克隆号，只是针对单克隆抗体而言。

比如JNK2 (56G8) Rabbit mAb #9258，56G8这个就是抗体的克隆号，对你选择抗体无实质意义。

3.有些抗体名称中有个（pan）是什么意思？
表示该抗体可以检测该靶点的所有亚型。

4.我看到很多抗体都加了一个XP®，XP® 是什么意思？
XP®（eXceptional Performance）单克隆抗体经由CST公司研发的XMT®( eXceptional Monoclonal Technology)单克隆抗体技术生产得到。

这项革命性的专利技术使我们能够得到更多分泌抗体的B细胞，而这些细胞不是传统单克隆技术所能够得到的，这就使我们能够进行更全面的筛选和制备XP®单克隆抗体。

5.在抗体的Reactivity一栏，为什么有些种属加了个括号？
有些种属会加上括号，这表示序列同源比对有100%的同源性，预测该抗体可与该种属反应，但是我们并没有做过关于这些种属的验证实验，所以不建议使用。

6.我在网上发现我所需要的产品已停产，有替代品吗？
如果你输入了你所需产品的英文名称之后，发现该产品已停产，在下方会出来一个推荐产品，如果没有出现这一栏，很抱歉，你可能需要等待一段时间到新产品出来。

WB/IP实验疑难解答篇
7.WB 实验得不到目标蛋白条带，怎么办？
千里之堤毁于蚁穴，样品制备至关重要！！！
经过长期处理客户技术问题，我们发现，很多问题竟都是出在样本制备这一步，抗体出现问题的比例极小。

做WB 和IP 的时候，一些抗体对实验条件尤其敏感。

我们建议客户首先要考虑并确定以下几个基本问题：
a）目的细胞是否表达这种蛋白，丰度如何？你确定你的样本中包含活化的蛋白？细胞
裂解液样品制备活化蛋白会由于细胞数量，药物诱导时间，细胞传代数量和储存条件不同而改变。

b）提取蛋白的细胞裂解液中是否加入蛋白酶抑制剂，防止降解。

c）刺激处理是否恰当？
d）是否按照CST 建议的操作方法进行改善实验？
e）抗体是否有问题，CST中国提供专门的细胞裂解物来用于检测你的抗体是否存在问题，这是最好和最快捷的方法。

抗体存储和抗体使用过程是否有问题？我们推荐-20°C（偶联抗体可能储存在4°C，详见说明书）保存原始抗体管，不分装。

抗体稀释后不建议重复使用。

8.制备样品为什么CST建议超声？如果没有超声仪，有什么替代方法？
每个超声仪的最佳设置需单独确定，我们推荐在35%-40% 功率下处理10-15秒，重复3次（处理期间样品置于冰上），以期完全裂解细胞并打碎核染色质，减少样品的粘稠度，对检测膜结合蛋白和核蛋白非常重要。

如果没有超声波破碎仪，也可用细的21G 针头抽吸样品来破碎。

若样本太黏稠，可先用16 或18G ，然后再用21G。

9.WB封闭用牛奶还是BSA好？
CST建议转膜后迅速在TBS中洗涤膜几秒，以便移除残留的转膜缓冲液，随后使用5%脱脂牛奶（请使用实验级的#9999）的TBST室温封闭1h，这一封闭步骤有助于降低非特异性一抗结合并降低背景。

另外应避免膜封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。

CST建议所有抗体均应如此。

封闭完后，孵育一抗前最好在TBST中洗涤5min。

10.能用室温孵育抗体1小时代替4℃过夜吗？
不建议。

有一些活化特异的抗体是用于区分一或两个翻译后修饰（包括磷酸化，乙酰化
等）的氨基酸残基，与识别总蛋白的抗体相比，大多数针对这些修饰位点的抗体具有较低的亲和性。

通过4℃过夜孵育保证抗原和抗体的反应时间，可以获得最好的信噪比，这是非常关键的。

即便表达量高亲和性好的蛋白，也建议4℃过夜孵育，以得到最好的结果。

11.二抗稀释液用什么？
和封闭一样，建议二抗稀释用5%的脱脂奶粉（请使用实验级的#9999）。

12.裂解细胞，要用什么缓冲液？可以自己配制吗？
CST 每个产品说明书中包含的Western blot 操作步骤中有推荐的缓冲液。

CST 提供以下缓冲液( 见下表)，或者，如果你想自己配制，CST 网站上列出了特别的缓冲液组分。

CHAPS 缓冲液专为获得细胞质的提取物而设计，适应于Caspase的检测，但并非关键。

13.转膜时，该如何选择膜孔径?对大分子量和小分子量蛋白有哪些需要特别注意的地方？
对所有的蛋白，我们推荐用Nitrocellulose Sandwiches #12369 （0.2um）的杂交膜去转膜，尤其是分子量低于30 KD 的蛋白，建议使用较高浓度（12-15%）的蛋白分离胶并缩短转膜的时间，建议在1 小时以内。

大分子量蛋白(>150 kDa)推荐使用tris-acetate SDS-PAGE 凝胶系统，而不是传统的(tris-glycine)，以及5% 的甲醇。

因为tris-acetate 凝胶是在一个中性pH 的条件下，所以分辨率比较高而且迁移的也更加精准。

低浓度的甲醇可以使转膜的效率更高(25 mM Tris base, 0.2 M glycine, 5% methanol)。

长时间的转膜(3小时，70 伏)也是很有帮助的。

对mTOR 来说长时间的转膜可能不一定有效，因为mTOR 是一个高表达的蛋白，一般来说用常规的protocol 也可以得到比较好的实验结果，但对于BRCA1 , ATM ,ATR等这些大分子量蛋白却十分有帮助。

14. 为什么有些抗体的实际分子量和说明书中的分子量会有所偏差？
原因很多，要根据实际情况加以判断。

a) 如果是1~5kD 的偏差，都是正常的，因为很多蛋白在不断研究中发现，存在多种蛋白翻译后修饰，如磷酸化、泛素化、糖基化等等，会造成蛋白电泳行为的偏移，从而影响蛋白实际条带的位置；b）如果蛋白被体外的蛋白酶降解，也会造成分子量变小的情况，这时偏移较大，需要考虑样品制备和保存的问题，防止降解；c）如果出现条带比预期分子量成倍增加，考虑是不是存在多聚体的情况；d）一些蛋白复合体在裂解时没有充分分离，个别情况下会存在条带偏差，如ATG5-ATG12 复合体，当使用ATG5 的抗体去杂交，就有可能出现ATG5-A TG12 复合体的条带；e）所使用的细胞系是否多次传代，因为多次传代的肿瘤细胞，有可能出现蛋白分子量偏移的问题，主要是转录本发生了变化；f）个别情况下，蛋白对应基因发生异位，造成重组蛋白，影响分子量；g）抗体质量问题，特异性受到影响，建议使用我们提供的阳性对照裂解物去查找抗体是否有问题。

h）SDS-PAGE 凝胶的成分和跑胶的条件以及marker 也都是一些重要的影响因子。

15.使用CST抗体时，为什么我不能使用我们自己实验室的免疫印迹操作流程?
CST™抗体经过优化以提供最强的信号，最少的背景，使用CST推荐的免疫印迹操作流
程，对于终端客户的优点是节约时间和材料。

16.收到了你们寄来的阳性对照，该如何使用？需要加Loading Buffer吗？为什么你们的对照有些是蓝色液体，有些又是红色液体？
建议电泳加样之前先对对照细胞提取物煮沸两分钟。

每个泳道加入10-15μl的细胞对照提取物，无需再加入Loading Buffer，至于阳性对照有不同的颜色，这是因为我们的Loading buffer的颜色有红色和蓝色之分。

17.湿转和半干转，哪个效果更好？
CST美国科研团队已尝试用不同的方法去转膜，但并非每一种方法都尝试过。

曾测试过的转膜系统有Life Technology’s iBind , Life Technology’s iBlot, Millipore’s SNAPi.d. , BioRad’s TransBlot Turbo 。

当用不同的转膜系统时，建议优化SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜以及各种条件。

通常，CST推荐用湿转法。

18.WB 时，如何选择阳性对照？
CST 的科学家制定了一个一些抗体的对照表格，可在网页
/support/controls.html
找到答案，但是有些蛋白可能只是在特定模型中或者特定的刺激中表达，所以这些蛋白并没有合适的对照，你可参考说明书中提供的图片上的细胞系来做对照。

19.不同的细胞组分有相应的loading control 吗？
可以在/catalog/loading-controls.html 网页上找到答案。

比如VDAC (D73D12) Rabbit mAb #4661 可以作为线粒体内参。

CellFractionation Antibody Sampler Kit #11843 就包含几种不同的内参：Histone H3 (D1H2) XP® Rabbit mAb #4499 可以作为核内参；AIF(D39D2) XP® Rabbit mAb #5318 可以作为线粒体内参；Vimentin(D21H3) XP® Rabbit mAb
#5741 是细胞骨架的标志物；MEK1/2 (D1A5)Rabbit mAb #8727 可以作为细胞质内参。

20.荧光WB 和CST 推荐的常规WB 有什么区别？
区别主要有2 点：
(1) 在封闭液中不要加入Tween-20 ；
(2) 在曝光之前要保持膜的干燥。

一般在LI-COR Odyssey® 和其他的荧光体系下，CST 的抗体都会有不错的表现。

当用荧光WB 出现问题的时候，我们建议客户在最亮的通道（通常是DyLight® 680 Conjugate）下检测并且避免多通道检测。

也可参考网页上CST中国推荐的荧光WB 步骤：https:///contents/resources-protocols/western-blotting-protocol-(fluoresc ent)/western-fluorescent。

21.为什么我用其他公司的试剂盒做IP的时候，得知你们的蛋白浓度之后，发现抗体不够用？
CST产品的活性都很高，IP 实验时直接参考说明书上建议的稀释体积比即可。

22.假如说明书上某个种属未被列出与CST抗体有交叉反应，是否意味着这个种属未被检测过呢？
可能未被检测过。

CST 科学家检测所有CST 抗体在多个物种的交叉反应性，如果可能的话（这个依赖于目标蛋白和实验系统的可行性）。

假如我们没有获得某个种属的交叉反应的阳性结果，我们就不会列出这个种属。

然而，有可能我们检测的这个细胞系包含一个低水平的特定蛋白，或者，我们使用的诱导条件对那个特定的细胞系不起作用。

如果你需要针对某个种属交叉反应的更多信息，请随时联系我们的技术支持团队**************.cn来获取帮助。

23.如何使用固相抗体来做免疫沉淀？
要得到最佳的结果，获得均匀的微珠悬浮液是重要的。

以下步骤可确保同质：
• 将包含微珠悬浮液的管子放入冰桶10 分钟。

• 倒置管子几次以获得50% 微珠- 缓冲液悬浮液。

• 假如可能，温和漩涡管子。

• 为了迅速吸出产品，切掉吸管端头，将吸管端头插入微珠悬浮液使靠近固相抗体微珠混合物。

孵育抗体和200μg 的细胞裂解物( 约1mg/ml ) 4℃过夜，用推荐的抗体稀释浓度。

24.这个抗体是否做够做这些实验（免疫印迹，免疫沉淀，免疫荧光，免疫组织化学，流式细胞术，染色体免疫沉淀）？
CST 会例行在相关的实验中测试抗体。

这些被推荐的应用，都通过了严格的应用特定的验证标准。

我们仅会推荐通过严格验证标准的应用，如果这个实验数据是模棱两可的，我们是不会推荐这个应用的。

关于某个特定的抗体的更多信息或者咨询哪种抗体将在你的实验中表现最佳，可以联系CST的技术支持团队**************.cn。

25.这个抗体能否用来做荧光免疫印迹？
CST 并没有对抗体是否能够做荧光免疫印迹进行常规测试，尽管在这个实验中许多抗体是发挥作用的。

使用CST 的抗体做荧光免疫印迹时，需要使用经修改过的免疫印迹的操作流程。

我们发现去除封闭步骤中的Tween® 20 去污剂（在TBS 中只使用5% 的脱脂奶粉）和在显影前干燥膜是针对标准流程做出的仅有的必要改变。

详细信息能够在荧光Western 免疫印迹操作步骤（一抗用BSA 孵育）和荧光Western 免疫印迹操作步骤（一抗用牛奶孵育）中找到。

另外，PrestainedProtein Marker, Broad Range (Premixed Format) #7720 在近红外
波段中具有自发荧光。

26.为什么我用了#5633，p38的抑制剂SB203580，磷酸化的p38却没有下降？
SB203580 能够结合到p38 MAPK 与ATP 结合的位置从而抑制p38 MAPK 的催化活性，但不会通过上游激酶抑制p38 MAPK 的磷酸化，也就是说，这个抑制剂不能抑制p38 本身的磷酸化，而是抑制p38 的激酶活性的，只会影响p38 下游蛋白的磷酸化。

27.你们的产品可以用于动物实验吗？
CST所有的产品都是Research-Use-Only(RUO)，只能用于in vitro 实验。

28.我的抗体的浓度是多少？
在CST，我们依据抗体活性来制备抗体，会为你做出调整。

为了达到最优的效果，不同批次抗体的浓度有时会做出调整。

咨询特定批次抗体的浓度，请联系CST 中国技术支持：**************.cn或电话4006-473287/GreatQ。

29.我该如何找到我做的这个蛋白的操作步骤？
首先，登陆CST中国的英文网站，/ 在search 的方框里输入你所需要的货号，然后就可以跳到这个产品的网页，在Applications 一栏点击所做的实验，再点击下面的protocol 即可。

30.如何储存SDS 裂解的磷酸化蛋白样本？
如果短期内使用( 少于3 个月)，SDS 样本细胞裂解液可以储存在-20℃，如果长期储存，应保存于-80℃。

活化的蛋白样本的降解变化很大，其降解率取决于每种蛋白的性质和样本里究竟含有多少活化的蛋白。

31.做磷酸化抗体的时候一定要用脱脂奶粉稀释吗？
一些客户认为在做磷酸化抗体的时候，用脱脂奶粉来封闭会引起比较高的背景，并且喜欢用PBS 来作为稀释液，但是这些说法是没有科学依据的。

CST 的技术专家团队推荐用5% 脱脂奶粉，TBS ，0.1%Tween® 20 ，室温下1 小时来封闭一抗。

更多关于磷酸化抗体使用注意事项总结，可搜索文章《磷酸化抗体使用建议，听听CST 专家怎么说》。

在组织样本中如何操作篇？
32.CST 的抗体是否适用于全组织样本裂解物？
CST 并未测试所有抗体是否适用于全组织样本裂解物，但是CST 的很多抗体已经被其他客户用于整个组织而且取得巨大成功。

33.我用的是组织样本，该如何破碎？
通常破碎体积大的植物或者动物组织需要用可旋转、带有刀片的匀浆仪或者搅拌器。

这些仪器通常通过一个电动的马达带动不锈钢可旋转切割刀片，可以从顶部或者底部启动，这个过程中产生很少热量，但是样品需要置于冰上。

匀浆仪的转速和刀片的尺寸，需要根据样品的体积和组织大小来确定。

大部分匀浆仪产生的颗粒较大，然而，一些带特殊旋转刀片的匀浆仪可以切割产生小到4微米且一致的颗粒，这种破碎对于一些小的单细胞样本（如细菌、酵母）效果不明显，但是对于大块的、骨质的、纤维较多的样本特别适用。

研磨匀浆器特别适合软组织和细胞悬液，它是由一个不锈钢或玻璃的活塞样槌头和一个玻璃槌管组成，匀浆器槌头表面和槌管壁是磨砂面的，以提高研磨的效果。

槌头在管底部的缝隙通常是几百微米，小的组织（通常被切割成1mm 的小段）放在槌管底部，同时加有预冷的少量裂解液，槌头在匀浆槌管中旋转可以使小的组织碎片粉碎。

某些组织研磨相关仪器
也会加入玻璃粉，氧化铝珠或细沙去增强样品的粉碎。

值得注意的是，在加入裂解液之前，一般陶瓷或者石制的研磨钵和冷冻过的研磨棒可以用来磨碎部分已经用液氮动过的固体组织。

其他更进一步的组织粉碎的方法可以与冷冻研磨一起合用。

细胞因子篇
34.人细胞因子适用于老鼠吗？
有些可以，然而大部分细胞因子在另一种属的细胞中会出现更高ED50或者没有ED50值。

CST公司生产人和老鼠的重组蛋白。

35.在我使用蛋白时是否应该使用载体蛋白？
CST公司的细胞因子和生长因子是冻干的，以两种方式提供，一种是每1µg细胞因子伴随20µg BSA（有载体蛋白），另一种是不含有添加的蛋白（无载体蛋白）。

牛血清白蛋白（BSA）载体蛋白将吸附到表面的量减至最少，并使重构恢复的量最大化。

含有载体蛋白的细胞因子通常用于组织培养应用。

而不含有载体蛋白的细胞因子通常用于动物研究或者其他受BSA 影响的步骤。

36.不同的细胞因子需要不同的重构缓冲液吗？
由于蛋白质之间的差异，我们测试并推荐特定的重构缓冲液。

如果不使用指定的缓冲液，蛋白有可能不能完全溶解。

37.应该怎样配制PH3.0，20 mM的柠檬酸？
为了配制PH3.0，20 mM的柠檬酸缓冲液，先将适量的柠檬酸溶解在去离子水中，用NaOH将PH调至3.0，然后用0.2 µM过滤器进行无菌过滤。

例如，要配制100ml的柠檬酸
缓冲液，先将0.384g无水柠檬酸溶解在90ml去离子水中，然后滴几滴5M NaOH调节PH值，当PH达到3.0，用去离子水定容至总体积100ml。

也可以购买20 mM Citrate pH 3.0 (Sterile) #9871。

38.为什么有些产品是液态的？
作为我们产品保证的一部分，所有的瓶装批次在用于销售分装之前都经过了生物测试。

这保证了所有的瓶装蛋白质具有最好的生物活性和充足的量。

一些细胞因子冻干后会失去生物活性。

例如HumanInterferon-γ (hIFN-γ) #8901, HumanLatent TGF-ß1 #5154 和Mouse FGF basic #5414 就以溶液的形式出售。

39.什么是ED50，它与单位有什么联系？为什么ED50都是一个范围？
ED50是指引起50%最大生物反应所需要的细胞因子或者生长因子的浓度。

细胞因子的ED50通常指的是1单位。

许多基于细胞的实验都会出现不同测试之间的变动，这与蛋白本身的生物活性无关。

ED50的范围是来自于一个批次的许多独立的测试。

这个范围决定了将来的批次中的生物活性强弱。

新的批次通常与旧的批次一起检测，从而保证测试之间变化的一致性。

40.什么是特定活性？怎样测定？
特定活性（用units/mg表示）是细胞因子或生长因子纯度和适宜的蛋白折叠的功能。

为了测定特定活性，细胞因子处理后的读数在标准的生物实验中测量。

ED50（用ng/ml表示），是指引起50%最大生物反应所需的细胞因子或生长因子的浓度，它在试验中可以测定。

下面的公式可以用来将以ng/ml为单位的ED50转换成以units/mg为单位的特定活性：特定活性（units/mg）=10E6 / ED50（ng/ml）
41.国际单位指的是什么？它们和我们的产品有何关联？
特定蛋白质的生物活性的检测会由于实验室生物试验系统和细胞培养条件的不同而发生变化。

为了标准化许多细胞因子和生长因子的检测，世界卫生组织（WHO）和英国生物学标准与控制研究院（NIBSC）生产了几批确定生物活性的蛋白，从而可以测试不同细胞因子样品的活性。

这个尝试的目的是为测试和生产生物治疗用品提供国际化的“金标准”。

为了计算一个细胞因子的IU，细胞因子必须同时用NIBSC标准检测。

CST公司提供的细胞因子和生长因子是以重量出售的，而不是IU。

我们现在还没有用NIBSC标准检测我们的细胞因子。

siRNA篇
42.siRNA有两个或多个的情况，该如何选择？哪个效果好？
一般而言，两个或多个siRNA只是沉默的序列不同，但是具体还是建议打开网页看一下Species-Reactivity/ Sensitivity这一栏，我们都可以保证实验质量。

但常规而言，建议你购买2个以确保文章的发表质量。

ELISA标准品篇
43.ELISA 有标准品吗？我如果买了其他公司的标准品，可不可以配套使用？
CST的ELISA试剂盒均无标准品，所以只能半定量。

如果你购买了其他公司的标准品，可以搭配使用。

定制抗体篇
44. 我能够订购一个定制配方的抗体吗？
针对客户（不含载体）的订单，许多制备在不含BSA或甘油的PBS中的抗体都有库存。

这个配方可以为了偶联而更改，能够连接到荧光素，微珠，或者染料。

为了满足你分析的需
要或者你实验室的需要，我们也很高兴向你整批出售。

关于价格和可用性的问题，你可以联系我们**************.cn。

45. CST能够定制我的抗体吗？
CST不会开发定制抗体，但我们提供CST已有抗体不同偶联标记需求的定制，另外我们很高兴接受你的目标蛋白抗体建议。

请发送你的建议到**************.cn，CST中国的科学家将在短期之内联系你。