作业PCR
PCR作业
广西医科大学研究生08级3班周鑫华200820315翻译PCR原理PCR（聚合酶链反应）的目的是制造大量基因的拷贝。
PCR有三个主要步骤，重复30-40个循环，这在一个自动化循环中完成，它在很短的时间内加热和冷却装有反应混合物的试管。
1.在94℃变性：变性过程中，双链解开成单链DNA，所有酶反应停止（例如前面循环的延伸）2．在不同的温度退火：引物由于布朗运动而快速移动，离子键在单链引物和单链模板之间形成和破坏，更稳定的键会持续更长时间（引物正好合适），在小片的双链DNA（模板和引物）上，聚合酶粘附并开始复制模板，一旦安装少量碱基，引物和模板之间的离子键就变牢固而不再分离。
3.在72℃延伸：这对聚合酶来说是理想的工作温度。
已经有几个碱基安装的引物对模板有强烈的吸引力，超过了破坏这种吸引的力。
就位但没有精确配对的引物再次松解（因为高温）并不再延伸片段。
碱基（模板互补）从3’端连接到引物（聚合酶从5’-3’添加dNTP,阅读模板从3’-5’，碱基互补的加入模板）做PCR之前首先应考虑下面一些问题实施流程：模板获取、引物设计、体系建立、PCR扩增、结果鉴定、体系优化一、模板的获取来源：病原体标本（Virus, bacteria, fungal cells）病理生理标本（Cells, blood, urine）类型：DNA模板RNA模板二、引物的设计：引物包括两条，即5’端引物和3’端引物。
引物决定PCR扩增产物的特异性和长度引物设计的基本要求：（1）引物长度: 15~30 nucleotides（2）碱基的分布尽可能随机，避免出现嘌呤或嘧啶碱基的堆积现象。
（3）自身不应该存在互补序列（4）引物间不应该存在互补，尤其是两条应避免3’端的互补重叠（5）引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%（6）3’端的碱基最好是G或C，且一定要与模板配对（7）5’端的游离碱基不影响PCR反应的进行三、PCR反应体系的建立与条件控制：DNA扩增体系（25ul）：缓冲液体系 2.5（pH8.3－8.8）模板DNA 2（50－100ng）Taq酶0.5～2udNTP 0.5～1（50－200umol/L）上游引物0.5～1（0.1－1umol/L）下游引物0.5～1Mg2+ 1～2.5（1.5－2mmol/L）水补齐至25ul四、反应过程确定变性，退火，延伸的温度、时间，循环次数五、PCR的结果检测分析及条件优化（一）PCR结果的常用分析方法1、琼脂糖凝胶电泳2、聚丙稀酰胺凝胶电泳（PAGE）3、PCR－RFLP4、PCR－SSCP5、核酸探针杂交法6、PCR－ELISA（二）PCR扩增的常见问题：1、假阴性（没有结果）2、假阳性（有结果，但没有目的带）3、引物二聚体4、非特异性扩增（有目的带，但杂带多）5、PCR产物污染6、RT-PCR中RNA的降解（三）PCR结果优化：1、假阳性原因: PCR产物、含靶DNA的质粒、阳性对照、标本交叉污染、Taq酶中带细菌DNA 避免方法：严格实验步骤操作，注意标本的采集、运输、和处理，设立阴性对照2、假阴性原因：（1）标本处理（DNA丢失、杂质去处不干净、模板降解等）；（2）PCR试剂（Taq酶失活、镁离子浓度过低或不加）（3）PCR过程中（PCR仪出问题、变性、退火、延伸温度不适宜等）（4）PCR产物鉴定中（没有加EB、凝胶浓度不够）避免方法：设立阳性对照3、引物二聚体引物间碱基互补过多引物模板比太高退火温度过低循环次数太多4、非特异性PCR产物原因：引物特异性不高或用量过多；酶质量不好或过多Mg2＋浓度过高；退火温度过低或退火延伸时间过长；循环次数过多。
很实用的pcr操作方法
很实用的pcr操作方法PCR （聚合酶链式反应）是一种用于在实验室中扩增DNA序列的技术。
它是迄今为止最常用、最有效的DNA分析方法之一。
PCR可以在短短几个小时内扩增出数百万份DNA复制品，这对于基因工程、基因组学研究和医学诊断具有重要意义。
以下是一种常用的PCR操作方法：1. 制备反应混合液：将PCR反应所需的试剂和模板DNA加入到一个无核酸酶的管或微孔板中。
一般反应液组分包括：扩增缓冲液（含有聚合酶反应所需的离子和缓冲剂）、两个引物（用于扩增所需的DNA片段）、聚合酶（用于DNA复制）和模板DNA（待扩增的目标DNA序列）。
2. 混合反应液：使用微量吸管或移液器轻轻混合反应液，确保所有试剂均匀分布。
3. 放置反应液：将反应液置于热循环仪（PCR仪）中，该仪器能够精确控制反应液的温度。
根据所需的扩增程序，设置温度周期。
4. 前变性：将反应液加热至95，这会使DNA解开成两个单链。
此步骤通常需要数分钟，以确保所有的DNA双链都被解开。
5. 扩增循环：在扩增循环中，每个循环都包含三个步骤：变性、退火和延伸。
变性步骤：将反应液加热至较高温度（通常为94-98），使DNA双链解开成两个单链。
退火步骤：将反应液降温至两个引物结合的最佳温度，使引物与目标DNA序列特异性结合。
延伸步骤：将反应液加热至较低温度（通常为72），使聚合酶在引物上合成新的DNA链。
6. 扩增周期：重复扩增循环，通常需要20-40个循环，以扩增目标DNA序列。
7. 扩增结束：最后一个扩增周期完成后，将反应液保持在72的延伸温度下，以确保最后一个DNA链的完整合成。
8. 储存PCR产物：将PCR产物保存在低温下，通常为-20或更低的温度。
这样可以防止PCR产物的降解和污染。
需要注意的是，PCR是一种高度敏感的技术，可能会受到有机体DNA和其他环境DNA的污染。
为了避免假阳性结果，必须采取有效的实验室措施来防止污染。
这包括使用无核酸酶的操作区域、每次PCR反应前进行模板准备和混合的准备区域等。
PCR基本操作包括哪些步骤
PCR基本操作包括哪些步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
它在基因工程、药物研发、疾病诊断等领域具有广泛的应用。
PCR基本操作包括以下几个步骤：1. DNA样本处理与提取PCR反应所需的DNA样本可以从细胞或组织中提取获得。
常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐析法、商用DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要进行定量和质量检测，确保PCR反应的可重复性和准确性。
2. 反应体系准备PCR反应体系主要由DNA模板、引物、缩合酶、反应缓冲液和可调节的离子浓度组成。
根据实验需要，可以添加特定的辅助试剂、核苷酸等。
反应体系的设计和优化对PCR反应的灵敏度和特异性有重要影响。
3. PCR反应程序设置PCR反应需要按照一定的温度和时间控制，以使DNA片段在不同温度区间中完成变性、退火和延伸等步骤。
一般情况下，PCR反应的程序包括初始变性、循环反应和最终延伸等阶段。
4. PCR反应条件优化PCR反应的条件优化对于提高扩增效率、特异性和产物纯度至关重要。
优化参数包括反应体系组分、引物浓度、反应温度、扩增周期数等。
通过优化反应条件，可以解决一些常见问题，如非特异性扩增、抑制性物质的影响等。
5. PCR产物分析与检测PCR产物可通过凝胶电泳、定量PCR、测序等方法进行分析和检测。
凝胶电泳是常用的PCR产物分析方法，可以确定目标DNA片段的大小和纯度。
定量PCR则可以精确测量DNA模板的初始量或PCR产物的多少。
通过以上几个步骤，PCR技术可以在较短的时间内扩增目标DNA片段，从而满足各种科研和应用需求。
PCR反应的成功需要仔细的实验操作和条件优化，以保证结果的准确性和可靠性。
检验科PCR室作业指导书
检验科PCR室作业指导书一、背景介绍PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种基因扩增技术，是在无需使用活性细胞的情况下通过体外扩增DNA序列，使其达到可检测的水平。
PCR技术被广泛应用于医药研究、生物学、遗传学、法医学等领域。
PCR室是PCR技术应用的关键场所，主要用于PCR反应、样品前处理和DNA制备等工作。
PCR反应是由特定的酶催化模板DNA的复制，在PCR实验中必须严格控制PCR反应的条件才能获得可靠的结果。
为了保证PCR反应结果的准确性和可靠性，PCR作业人员必须了解PCR室的操作规程和指导手册，遵守标准实验室操作程序。
二、 PCR反应的基本原理PCR反应是通过体外扩增DNA序列的一种技术。
PCR反应主要涉及两个重要的酶，即DNA聚合酶和引物。
DNA聚合酶是催化DNA聚合反应的核心酶，在PCR反应中必不可少。
引物是一种短的DNA或RNA分子，在PCR反应中用于酶的选择性识别和复制。
PCR反应主要包括三个步骤：变性、退火和延伸。
变性：将目标DNA加热到94℃的高温，使其断裂成两条单链DNA，并使引物和单链DNA互相结合。
退火：将温度降低到50-60℃，使引物与目标DNA结合，这个温度称为退火温度。
延伸：将温度升高至72℃，此时引物与DNA被催化成链延伸，成为双链DNA。
PCR反应重复进行以上步骤几个周期，就可以得到足够多的DNA扩增产物。
三、 PCR室操作规程1. 实验前准备(1)检查PCR实验室设备和试剂，检查是否缺少必要试剂和器具，并确认其备份。
(2)将外部样品进入PCR实验室前进行一定的处理，如冻存、粉碎等。
(3)制作引物工作应该在正式实验之前进行，并对其进行信号静电荷、目标大小、引物配对和特异性等核酸相关参数测试，确保可靠和有效。
制备引物的地点和PCR反应室应分开操作，单独使用平台和器具。
(4)戴上防护手套、口罩、帽子等个人防护设备，穿戴实验室制定的实验服。
PCR定量丙肝RNA作业指导书
丙型肝炎病毒(H C V)核酸扩增(PCR)荧光定量检测标准操作程序一、目的：明确丙肝病毒核酸定量检测的操作规程，指导检验人员正确进行丙肝病毒核酸定量的检测,保证检测结果及时可靠。
二、范围：适用于进行丙肝病毒核酸定量检测的检验人员。
三、职责：实验操作人员应严格按操作规程进行实验。
四、检测原理：本试剂盒从血清或血浆中提取HCV RNA，在逆转录酶作用下将RNA逆转录为HCV cDNA，在引物的指导下，以四种脱氧核苷酸为底物，通过耐热DNA聚合酶的酶促作用，对cDNA进行体外扩增，用Taqman探针法检测扩增产物。
通过标准曲线，即可计算出被检物的含量。
五、试剂：1. 来源：上海复星HCV核酸扩增荧光定量检测试剂盒〕。
2. 规格：32人份/盒。
3. 试剂盒组成：3.1 病毒RNA提取试剂：用于从血清或血浆中提取HCV RNA。
裂解液 4ml×1瓶含有硫氰酸胍的溶液助沉剂1瓶含有助沉剂的冻干粉末去抑制剂1瓶含有去抑制剂的冻干粉末洗涤液A 14ml×1瓶含有硫氰酸胍的溶液洗涤液B 4ml×1瓶含有Tris的溶液洗脱液1×2支含0.04% NaN3的灭菌双蒸水（无RNase）核酸提取柱32支×1包含连接套管3.2 核酸扩增（PCR）―荧光检测试剂：RT―PCR试剂PCR主反应液 250ul×1支含有一对引物和dNTP的溶液酶混合物 180ul×1支含有Taq酶、逆转录酶和RNA酶抑制剂的溶液荧光探针20ul×1支含有荧光探针的溶液250ul×1支阴性对照含有0.05% NaN的HCV RNA阴性的混和人血清3强阳性对照 250ul×1支含有约2×106 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA弱阳性对照 250ul×1支含有约2×104 IU/ml的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品1 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品2 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品3 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品4 250ul×1支含有适量的HCV基因片段的非传染性体外转录RNA工作标准品①～④的参数和强、弱阳性对照的定值允许范围根据批号不同而不同。
pcr操作流程笔记
pcr操作流程笔记PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于扩增DNA片段的技术，是分子生物学中常用的实验方法之一。
下面是PCR操作流程的笔记：1. 样品准备：首先需要准备PCR反应所需的DNA模板，可以是从细胞、组织或者其他来源提取的DNA。
确保DNA质量和浓度符合实验要求。
2. 反应体系准备：根据实验设计确定PCR反应的体系，包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、缓冲液和DNA聚合酶等。
根据实验要求调配反应体系，确保每个试管中的成分比例正确。
3. 反应条件设定：根据引物的Tm值（熔解温度）确定PCR反应的退火温度，通常在50-65摄氏度之间。
确定PCR反应的延伸温度，通常在70-75摄氏度之间。
确定PCR反应的循环次数，通常为20-40次。
4. PCR反应：将准备好的反应体系加入PCR仪器中，设置好反应条件，开始PCR反应。
PCR反应是一个循环的过程，每个循环包括三个步骤：变性、退火和延伸。
在每个循环中，DNA双链解旋，引物结合，DNA聚合酶合成新的DNA链。
5. PCR产物分析：PCR反应结束后，可以通过琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
通过分析PCR 产物的大小和浓度，可以判断PCR反应的效果和DNA扩增的成功与否。
6. 结果解读：根据PCR产物的分析结果，可以判断DNA扩增的效果，验证实验设计的合理性，进一步分析DNA序列等。
根据实验目的，可以进行后续的实验操作或者数据分析。
总结：PCR操作流程包括样品准备、反应体系准备、反应条件设定、PCR反应、PCR产物分析和结果解读等步骤。
正确操作PCR技术，可以快速、高效地扩增DNA片段，为分子生物学研究提供重要的实验手段。
PCR技术在基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域有着广泛的应用。
PCR性能验证作业指导书(1)
第 1 页/ 共 5页文件类型：□质量手册□程序文件■作业指导书审批纪录/Review history：修订记录/Revision history：1 目的根据医学实验室质量和能力认可准则在分子诊断领域的应用说明对实验室开展的定性及定量检测项目进行性能验证。
证明检测结果准确可靠，可以满足临床需求。
2 职责2.1 技术负责人负责性能验证报告的批准，质量负责人负责性能验证有效性的指导及审核。
2.2 组长负责对仪器厂家的验证报告进行确认。
2.3 组长负责组织本组工作人员一起进行项目性能验证的实验。
2.4 组长负责将项目性能验证的原始数据分析整理，形成验证报告。
3 验证内容3.1 仪器性能验证仪器的验证正常情况下每年进行一次，但如有以下（但不限于）的情况发生时：仪器出现故障，扩增仪灯泡更换时、仪器迁移等需要重新进行性能验证。
验证要求详见各仪器作业指导书。
3.2 项目的性能验证3.2.1 定量项目性能验证在新项目初次开展时,检测仪器性能验证通过后，进行精密度、线性、准确度、检测下限的验证。
但如有以下（但不限于）的情况发生时：项目方法学、试剂组分及仪器故障，仪器迁移等，需要重新建立方法学并进行相关性能验证。
3.2.1.1 精密度验证1）实验方案:重复性精密度均采用2个已知浓度阳性和弱阳性临床样本，每天在RocheLightcycler480上重复检测3次；连续检测5天。
并计算SD和CV值。
2）结果判断：按照试剂盒说明书中CV的要求范围来判断。
3.2.1.2 准确度验证1）实验方案：以最近两年参加卫生部临检中心EQA室间质量回报的数据为基础，对回馈的报告进行相应的数据分析。
2）结果判断：PT成绩在80％到100％之间，即认为该项目准确度符合要求。
3.2.1.3 线性范围验证1）实验方案：将高浓度的已知临床标本采用体检健康的人血清进行梯度稀释，对高浓度样本和稀释后的样本（7个浓度点）进行同批次检测，每个样本重复检测2次，计算此范围内一系列不同样本的测量值与其实际浓度(真值)的线性相关系数。
PCR实验室标准操作规程
PCR实验室作业指导书文件编号：第1版编制：审核：批准：生效日期：2015年*月*日质管部PCR实验室公正性声明1、坚持公正立场认真对待每一例检测，不受任何对检测工作质量有不良影响的、来自实验室内部或外部的不正当的商业、财务和其他方面的压力和影响。
避免卷入任何可能会降低技术能力、公正性、判断或运作诚实性的信任的活动。
2、严格遵循实验室认可依据的国际标准，严格按标准的管理要素和技术要素的要求建立自我完善的管理体系和控制检测全过程各环节的机制，所有与检测有关的人员熟悉与之相关的质量文件，并在工作中执行这些政策和程序，真正把标准作为科学管理检测实验室的先进管理模式，尽可能把差错降到最低限度，确保检测数据准确可靠，检测结果和技术判断正确有效。
3、坚持以“客户为中心、质量第一”的服务宗旨，严格保护客户的机密和所有权，热忱提供优质服务，努力实现让上级放心、客户满意的服务标准。
4、主动开展实验室的比对实验和其他有效地检测质量监控方案，并通过日常检测的监督机制，持续改进、不断完善管理体系，从而保证其充分性和有效性。
修订页目录前言 (1)质量方针 (2)质量管理体系组织结构图 (4)一、工作制度 (5)PCR实验室的设置及管理规程 (5)PCR实验室内务管理规程 (6)PCR实验室人员的配置及管理规程 (7)PCR实验室管理规程 (10)PCR实验室生物安全防护措施 (14)PCR实验室废弃物的处理管理规程 (16)PCR实验室清洁消毒管理规程 (17)PCR实验室仪器设备的管理规程 (18)试剂管理规程 (20)清洁剂、消毒剂管理规程 (21)异常情况应急处理管理规程 (22)采购管理规程 (25)仓库管理制度 (28)临床标本的管理规程 (31)PCR实验室记录管理规程 (32)检验报告单发放、保密管理规程 (33)PCR实验室岗位责任制 (34)二、操作指导书 (36)PCR实验室的清洁消毒操作规程 (36)冰箱、冷藏柜的使用操作程序 (37)冰箱、冷藏柜的维护保养操作程序 (38)洁净工作台使用操作规程 (40)洁净工作台维护、清洁操作规程 (41)ABI 7500实时跟踪荧光PCR仪使用操作规程 (43)ABI 7500实时跟踪荧光PCR仪维护保养操作规程 (44)高速冷冻离心机使用标准操作规程 (45)高速冷冻离心机维护保养操作规程 (46)生物安全柜使用操作规程 (47)生物安全柜的维护保养操作规程 (49)加样器的使用操作规程 (50)加样器的维护保养操作规程 (51)干式恒温箱的使用操作规程 (52)干式恒温箱的维护保养操作规程 (53)紫外灯的使用操作规程 (54)紫外灯的维护保养操作规程 (55)温湿度计自行检定操作规程 (56)PCR实验室试剂的质检标准操作规程 (57)PCR实验室标本唯一标识编号编制操作规程 (58)临床标本的采集、运送、接收操作规程 (59)临床标本的保存操作规程 (61)清洁剂、消毒剂配制操作规程 (62)乙肝病毒核酸扩增荧光检测操作规程 (64)室内质量控制标准操作程序 (66)室间质评操作规程 (69)三、引用图表 (70)实验室负责人简历 (70)实验室工作人员一览表 (72)拟开展的临床基因扩增检验项目 (75)实验室质量管理程序文件和作业指导书（SOP）目录 (76)北京市医疗机构临床基因扩增检验实验室自查/审核表 (78)前言1.临床基因扩增实验室质量管理手册由以下部分组成：管理性程序；仪器设备标准操作程序、维护保养程序；检测项目操作程序；相关图表；相关复印件2.现有文件编号与本公司现行ISO9001质量体系一致；3.文件管理：现有的文件由公司行政办公室负责管理；实验室主任保存全套文件一份；各工作区保存该区使用的文件，以方便工作人员随时使用。
PCR室内质量控制标准操作程序-检验科PCR室作业书
PCR室内质量控制标准操作程序1．目的：随时了解并控制实验室检测的精密度变化。
2．适用范围：核酸扩增荧光定量检测实验室。
3．负责人：操作人：4．程序：4．1血清质量控制品制备及操作4．1．1质控品制备：收集本室检测的临床样本，HBVDNA定量为106copies/ml的样本混匀，并分装于0.5ml的离心管中，每支110µl，编号后（如Qb0201-n），-20℃保存。
4．1．2操作：每次检测过程中将此分装的室内质控品与样本同时检测，记录此标本的检测结果；计算前10次检测结果的平均值作为本批质控品的靶值。
4．1．3如果使用商品化的质控品，按4．１．２要求执行。
4．2室内质控图的使用方法4．2．1描点a）图中X线为靶线，X±2s为警告线，X±3s为失控线。
对于同一批号的质控血清不论使用几个月，其空图均不变化。
只要将图纸上方“起止日期”项填入每个月的实际起止日期即可。
b）每天将该批号质控血清按有关规定程序复融随同病人的标本同时检测。
将日期、检测结果和操作者如实记录在图下方的相应位置，并按前面的方法画出图上的对应点，用直线将该点与前一天的点连接。
c）月底计算当月全部质控血清检测结果的X、s和CV，并进行图形分析和小结，将质量控制图存入质控资料档案。
4．2．2图形分析a）如果在X±3s线以外，则为失控，应立即报告有关负责人，迅速查找原因。
必要时复测标本，然后方可发出报告，并将失控情况、查找过程及处理结果等详细记录。
b）如果在X±2s线以外，或出现连续6点以上在一侧等规律变化，均应即使向有关负责人反映，并积极查找原因。
但当天的检验结果一般可以发出。
4．2．3通过观察图形的规律性变化进行误差分析，消除误差来源a）曲线漂移：提示有系统误差，准确度发生了一次性的向上或向下改变。
这种变化往往是由于一个新的情况引起的。
如更换不同批号试剂，启用新批号的质控血清、操作人员的变换等。
乐普全自动pcr仪作业指导书
乐普全自动pcr仪作业指导书摘要：乐普全自动pcr 仪作业指导书I.简介A.乐普全自动pcr 仪的背景和介绍B.乐普全自动pcr 仪的主要特点和功能II.操作流程A.准备工作1.检查试剂和仪器2.设置仪器参数B.样本处理1.样本的准备和处理2.样本的加样和混合C.PCR 反应1.PCR 反应的设置和运行2.反应过程中注意事项D.结果分析1.结果的解读和分析2.结果的记录和报告III.常见问题及解决方法A.操作过程中的常见问题B.仪器故障的排除和解决方法IV.维护和保养A.日常维护和清洁B.定期检查和保养V.结论A.乐普全自动pcr 仪的优势和应用B.乐普全自动pcr 仪在实验中的重要性和贡献正文：乐普全自动pcr 仪作业指导书乐普全自动pcr 仪是一款高性能的PCR 仪器，它具有高效、准确、快速等特点，被广泛应用于生物学、医学等领域。
为了帮助用户更好地使用该仪器，我们提供了以下详细的作业指导书。
一、简介乐普全自动pcr 仪是一款先进的PCR 仪器，它采用了全自动化技术，能够实现样本的自动处理、PCR 反应的自动运行和结果的自动分析。
该仪器具有操作简便、结果准确、效率高等优点，能够大大提高实验的效率和准确性。
二、操作流程乐普全自动pcr 仪的操作流程包括准备工作、样本处理、PCR 反应和结果分析四个步骤。
1.准备工作在进行实验前，需要先检查试剂和仪器是否齐全，并设置仪器参数。
试剂包括样本处理液、引物、探针、模板等，仪器包括pcr 仪、离心机、移液器等。
2.样本处理样本处理是实验的重要步骤，需要将样本进行适当的处理和加样。
首先，需要将样本进行裂解、提取等处理，然后进行核酸的扩增。
3.PCR 反应PCR 反应是实验的核心步骤，需要设置合适的反应条件，并运行反应。
根据实验目的的不同，可以选择不同的PCR 反应条件，例如温度、时间、引物、探针等。
4.结果分析结果分析是实验的最后一步，需要对实验结果进行解读和分析，并记录和报告。
PCR实验室标本唯一标识编号作业指导书
第 1 页/ 共 2页文件类型：□质量手册□程序文件■作业指导书
审批纪录/Review history：
修订记录/Revision history：
1 目的
规范标本编号的唯一性，保证检验结果的准确性和可溯源性。
2 适用范围
分子组检验的所有标本。
3 职责
3.1 由分子组操作人员依照该作业指导书对标本进行唯一编号。
3.2 实验室部门负责人负责监督实施。
4 操作程序
4.1 标本唯一编号
4.1.1 接收到的样本根据检测项目不同进行编号，每个检测项目应对应唯一的编号。
4.1.2 一个病人样本的编号应确保样本、仪器编号和正式报告中完全统一。
4.1.3 样本送至分子组后，根据项目类型进行检验编号。
详细编号规则见分子项目编号附表。
4.2 样本信息输入
4.2.1 根据样本的唯一标识，将样本条形码直接扫描入电脑，电脑自动记录样本类型、病人姓名﹑性别﹑年龄﹑门诊/住院号﹑送检医院﹑检验项目等信息。
4.2.2 信息输入操作程序具体操作见LIS操作规范。
5 相关文件和记录表单
无。
2017-09-30发布 2017-10-10实施。
《DNA 片段的 PCR 扩增》 作业设计方案
《DNA 片段的 PCR 扩增》作业设计方案一、作业目标1、使学生深入理解 PCR 扩增的原理和过程。
2、培养学生的实验操作技能和数据分析能力。
3、增强学生对分子生物学的兴趣和探索精神。
二、作业内容1、理论知识巩固（1）要求学生复习PCR 扩增的基本原理，包括DNA 双链的解旋、引物的结合、DNA 聚合酶的作用等。
（2）让学生描述 PCR 反应体系中各成分的作用，如模板 DNA、引物、dNTPs、DNA 聚合酶和缓冲液等。
2、实验设计（1）给定一个特定的 DNA 片段，要求学生设计 PCR 扩增的实验方案，包括引物的设计、反应条件的选择（温度、时间等）。
（2）让学生思考如何优化PCR 反应条件以提高扩增效率和特异性。
3、实验操作（1）在实验室条件下，学生亲自进行 PCR 扩增实验，记录实验过程中的操作步骤和遇到的问题。
（2）要求学生严格遵守实验室安全规范，正确使用实验仪器和试剂。
4、结果分析（1）学生对 PCR 扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察条带的位置和亮度。
（2）根据电泳结果，让学生判断实验的成功与否，并分析可能存在的问题。
5、拓展思考（1）引导学生思考 PCR 技术在医学诊断、法医学、生物技术等领域的应用。
（2）让学生探讨 PCR 技术的局限性和未来的发展方向。
三、作业形式1、书面作业（1）完成理论知识的简答题和实验设计的报告。
（2）撰写实验操作的心得体会和结果分析的报告。
2、实验作业（1）在实验室进行 PCR 扩增实验，并提交实验记录和结果照片。
3、小组讨论（1）组织学生分组讨论 PCR 技术的应用和发展，每组提交一份讨论报告。
四、作业评估1、理论知识评估（1）根据学生对 PCR 原理和反应体系的理解程度进行打分。
（2）检查实验设计报告的合理性和科学性，给予相应的评价。
2、实验操作评估（1）观察学生在实验室中的操作规范和熟练程度。
（2）根据实验结果的准确性和可靠性进行评估。
3、结果分析评估（1）评估学生对电泳结果的分析能力和判断的准确性。
PCR基因扩增实验室的要求-检验科PCR室作业书
PCR基因扩增实验室的要求1．目的：规定在各区内所进行的工作及其操作。
2．适用范围：所有在本区内进行的工作。
3．负责人：操作人：4．程序：实验室分四区:标本接收区；试剂贮存、准备区；标本制备区；扩增区。
进入各区严格按照单一方向进行，即试剂贮存、准备区——标本接收区——标本制备区——扩增区。
各区及其设备、物品必须有明确的标记，严禁混用。
进入PCR实验室的工作人员（含卫生员），都必须遵守实验室的规则，尤其严格遵守进入PCR实验室的唯一流向。
不可进入PCR扩增后区打扫卫生，再返回扩增前区工作。
防止非本室工作人员串岗，进入本室。
尤其不得为找人，而逆向误入PCR实验室。
总则PCR实验室工作人员应具备医学检验、微生物检验基本知识，大专以上学历，并受过PCR实验的基础知识和技能培训。
PCR实验室分试剂准备，样本准备，PCR扩增和产物检测四个室，各室的实验物品（含加样器，试管架，吸头，记录纸，笔等），不得混用，须贴上标签予以区别。
实验室技术人员必须严格按照PCR实验室操作程序进行，包括实验室擦洗。
台面消毒，离心管，吸头的无菌灭活准备，仪器使用和废弃物处理等。
进入实验室的工作人员必须更换各室不同的工作服（含帽和鞋），勤换洗工作服，以及遵守实验室的唯一流向的规定，严禁反向流动。
进入PCR实验室后区的物品不许带进PCR实验室前区。
每天实验开始前，必须清洁地面和消毒实验室前区。
实验结束应紫外线消毒实验台面，产物分析室紫外灯最好彻夜开启，排风扇应昼夜工作。
每天下班前处理好废物，应关好水、电、煤气和门窗。
定期校准和维修PCR仪、酶标仪及离心机、水浴箱等仪器设备。
实验室内不得饮食、吸烟。
4.1标本接收区4.1.1实验人员进入该区须穿本区白色工作服，接收标本须戴一次性手套。
4.1.2记录实验室干、湿度，绘制冰箱温度图。
使用带有本区标识的记录本、纸和笔，每项记录，书写工整详细。
4.1.3对送检的标本实行双签制度，并仔细检查是否符合检测要求，对有不符合要求的标本及时通知相关科室重新采样，并作记录，每份标本需给出唯一性编号。
PCR法快速鉴定重组载体作业指导书
PCR法快速鉴定重组载体作业指导书实验目的掌握PCR法快速鉴定重组载体的基本操作。
实验原理PCR(polymerase chain reaction)是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。
在分子生物学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA 序列测定等方面，也可以用来鉴定重组载体，是分子生物学中一项极为常用的技术。
PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。
两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3＇端互补，由此限定扩增片段。
PCR反应由一系列的变性——退火——延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。
由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。
理论上，经过n次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。
PCR法快速鉴定重组载体的基本原理是直接取沸水浴裂解的重组质粒DNA为摸板，通过特异引物的特异扩增来鉴定外源片段是否重组。
实验内容仪器和试剂1．仪器PCR仪，微型水平电泳槽，电泳仪，水浴锅，离心机等。
2．试剂（1）50×TAE电泳缓冲液（2）10×PCR缓冲液：（3）4种dNTP混和10mmol/L液（5U/μl）（4）Pfu DNA聚合酶（5）引物（20μM）（6）10×溴酚蓝上样缓冲液方法和步骤1 取培养过夜的转化菌液20μl，沸水浴3-5分钟。
2 12000rpm 离心2分钟。
取上清液作为PCR的摸板3在PCR仪上设置好程序。
4在1个灭菌的0.5ml离心管中，按下列顺序加样，建立20μl反应体系。
ddH20 12μl10×PCR Buffer（无Mg离子）2μl25mM Mg离子 1.5dNTP(10mM each) 0.5μlPrimer l(20μM) 0.5μlPrimer 2(20μM) 0.5μl模板DNA TaqDNA聚合酶（2.5U）2μl 1μl总体积20μl5混匀，短暂离心．6放在PCR仪上进行PCR反应。
乐普全自动pcr仪作业指导书
乐普全自动pcr仪作业指导书摘要：一、乐普全自动医用PCR 分析系统概述二、荧光定量PCR 仪的性能特点三、操作步骤与注意事项四、常见问题与解决方案五、总结正文：一、乐普全自动医用PCR 分析系统概述乐普全自动医用PCR 分析系统是一款先进的荧光定量PCR 仪，具有高灵敏度、高精度和快速加热等特点，广泛应用于临床实验室、研究机构和生物制药等领域。
该系统采用半导体热电加热模式，使得样本升降温速度可达50/s，大大提高了检测效率。
此外，仪器还配备了四重检测稳定精确的加热及温控系统，以及cy5 多重荧光检测技术，确保了检测结果的准确性和可靠性。
二、荧光定量PCR 仪的性能特点1.高灵敏度：乐普全自动医用PCR 分析系统采用了cy5 多重荧光检测技术，能够实现对荧光信号的快速、准确检测，提高了检测的灵敏度。
2.高精度：仪器配备了四重检测稳定精确的加热及温控系统，能够保证样本在升降温过程中的稳定性，从而确保检测结果的精度。
3.快速加热：采用半导体热电加热模式，使得样本升降温速度可达50/s，提高了检测效率。
4.导热性能出色：仪器采用导热性能出色的材料制造，确保了加热和温控效果的均匀性。
三、操作步骤与注意事项操作步骤：1.开机：接通电源，打开仪器开关，使仪器进入工作状态。
2.样本准备：将待检测的样本进行处理，提取出待测DNA，并进行荧光标记。
3.设置参数：根据实验需要，设置PCR 反应的各项参数，如温度、循环数等。
4.加样：将处理好的样本加入仪器的反应槽中。
5.开始检测：点击开始键，仪器自动进行PCR 反应，并在反应过程中实时监测荧光信号。
6.数据处理：实验结束后，仪器会自动将检测数据进行分析，并生成报告。
注意事项：1.在操作过程中，应确保手部清洁，避免对仪器和样本造成污染。
2.样本处理过程中，要遵循实验操作规程，确保提取出的DNA 质量达标。
3.在设置参数时，要根据实验需要进行精确设置，以保证检测结果的准确性。
pcr证操作流程
pcr证操作流程PCR（聚合酶链式反应）是一种用于扩增DNA片段的技术，广泛应用于分子生物学和遗传学研究中。
PCR技术的操作流程相对简单，但需要严格控制实验条件以确保准确的结果。
下面将详细介绍PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
通常PCR反应体系包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、聚合酶、缓冲液和水。
将这些试剂按照一定比例混合在一起，制备PCR反应混合液。
接着，将PCR反应混合液分装到反应管中。
每个反应管中通常包含50-100微升的反应混合液，确保每个反应管中的成分均匀混合。
然后，在PCR仪中设置反应条件。
PCR反应的温度循环通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
根据引物的熔解温度和DNA片段的长度，设置合适的温度和时间参数。
接下来，将反应管放入PCR仪中开始反应。
PCR仪会根据预设的温度循环程序，自动控制温度的变化，使DNA片段在每个循环中被扩增。
在PCR反应结束后，将反应管取出，进行电泳分析。
通过电泳可以检测PCR反应产物的大小和纯度，验证扩增是否成功。
最后，对PCR产物进行测序分析。
如果需要对扩增的DNA片段进行测序，可以将PCR产物送至测序中心进行测序，以获取DNA序列信息。
总的来说，PCR技术的操作流程包括准备PCR反应体系、设置PCR反应条件、进行PCR反应、电泳分析和测序分析。
严格控制实验条件和操作流程，可以确保PCR反应的准确性和可靠性，为分子生物学和遗传学研究提供有力的支持。
PCR技术的应用范围广泛，对于基因克隆、基因表达分析、疾病诊断等领域都具有重要意义。
PCR技术的不断发展和完善，将为科学研究和医学诊断带来更多的便利和可能性。
pcr 操作流程
pcr 操作流程PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种用于复制DNA片段的技术，它可以在短时间内扩增出数百万份特定DNA序列。
PCR技术在分子生物学、医学诊断、法医学等领域有着广泛的应用。
下面将介绍PCR的操作流程。
首先，准备PCR反应体系。
PCR反应需要的基本组成包括DNA模板、引物、dNTPs（四种脱氧核苷酸）、DNA聚合酶、缓冲液和水。
引物是PCR反应的关键，它们是用来识别目标DNA序列并引导DNA聚合酶合成新链的短链DNA片段。
其次，进行PCR反应。
PCR反应通常分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，将PCR管中的混合物加热至95°C，使DNA双链解旋成两条单链。
在退火步骤中，将反应温度降至50-60°C，引物与目标DNA序列结合。
在延伸步骤中，将反应温度升至72°C，DNA聚合酶在引物的引导下合成新链。
最后，进行PCR产物的分析。
PCR反应结束后，可以通过凝胶电泳、实时荧光定量PCR等方法对PCR产物进行分析。
凝胶电泳可以用来检测PCR产物的大小和纯度，实时荧光定量PCR可以用来定量PCR产物的数量。
在PCR反应中，需要注意一些常见的问题，如引物的设计、反应条件的优化、污染的防止等。
此外，PCR反应的结果也需要谨慎解读，避免误判。
总的来说，PCR技术是一种简单、快速、高效的DNA复制技术，广泛应用于科研和临床实验中。
熟练掌握PCR的操作流程和技巧，可以提高实验效率和准确性，为科研工作提供有力支持。
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PCR定义
PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA 为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。
是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。
可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。
PCR技术的基本原理
一、PCR反应成分：
1.模板DNA；
2.引物；
3.四种脱氧核糖核苷酸；
4.DNA聚合酶；
5.反应缓冲液、Mg2+ 等。
二、PCR扩增过程
1、高温变性(denaturation)
在高温条件下，使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA变成单链DNA
变性温度：
94-97℃，30-50s
2、低温退火(annealling)
当温度降低时，由于模板分子的结构较引物复杂，且反应体系中引物的量大大多于模板DNA，使引物与其互补的模板在局部形成杂交链。
退火温度：
25-60℃，常55℃
60-90s，常60s
3、适温延伸(extension)
在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2 存在下，DNA聚合酶催化引物按5‟→3‟方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链。
延伸温度：
70-74℃，常72℃
60-120s
以上述三个步骤为一个循环，每一循环的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。
PCR反应体系中的各组分分析
一、引物(primer)
引物的设计决定PCR反应的成败
PCR的效率和特异性取决于：
1、引物与模板的特异结合
2、聚合酶对引物的有效延伸
引物设计原则
1、引物长度以16-30bp为宜
◆引物过短，特异性降低
◆引物过长，成本增加，PCR的最适延伸温度会超过Taq DNA pol的最适温度
◆若引物长8bp，则平均每隔48=65536bp就有一个结合位点。
人大约有43000个可能的
结合位点
◆若引物长16bp，则平均每隔416=4.29×109bp有一个结合位点。
2、引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段
3、引物碱基：G+C含量以40-60%为宜
4、碱基分布的随机性：ATGC随机分布，避免5个以上的相同碱基成串排列。
尤其是引物
的3…端，不应有连续3个G或C
5、避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引
物二聚体，产生非特异的扩增条带。
6、两引物之间不互补，一对引物之间不应多于4个连续碱基有互补性，以免产生引物二聚
体
7、引物3…端是引发延伸的点，不应错配：由于ATGC引起错配有一定规律，以引物3‟端A
影响最大，因此，3…端的末位碱基最好选TCG，而不选A。
8、引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
同源性不要超过70%
或有连续8个互补碱基同源
9、引物5…端可以修饰
◆加酶切位点；
◆用生物素、荧光物质、地高辛等标记；
◆引入突变位点；
◆引入启动子序列；
◆引入蛋白质结合序列
◆5…端修饰后不影响正常的PCR反应
引物的保存和使用浓度
◆冻干，-20℃，可保存1年，常保存6月
◆使用最终浓度：0.2-1.0μmol/L，适宜
◆小于0.2μmol/L，影响产量
◆大于1.0μmol/L，不经济，出现非特异性扩增产物和引物二聚体
二、Mg2+浓度
终浓度为1.5～2.0mmol/L，其对应dNTP为200 μmol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2 ，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。
Mg2 能影响反应的特异性和产率。
三、BSA
一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。
四、底物（dNTPs）
dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.0～7.5，一般存储浓度为10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20～200μmol/L。
高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。
五、Taq酶
能耐95℃高温而不失活，其最适pH值为8.3～8.5，最适温度为75～80℃，一般用72℃。
能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按5‟→3‟方向逐个将dNTP分子连接到引物的3‟端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。
无3‟→5‟的外切酶活性，没有校正功能。
某种dNTP或Mg2 浓度过高,会增加其错配率。
用量一般为0.5～5个单位/100μl。
六、模板
PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。
模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。
七、无Mg2 buffer
由纯水、kcl、Tris组成。
Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。
kcl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。
PCR反应条件的选择（影响因素）
温度参数：
1.变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94℃（或95℃）变性3～10min，
接着94℃变性30～60s。
2.退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5℃。
引物长度在15～25bp可通过公Tm=(G+
C)×4℃(A+T)×2℃计算退火温度，一般退火温度在40～60℃之间，时间为30～45s。
如果(G
C)低于50%，退火温度应低于55℃。
较高的退火温度可提高反应的特异性
3.延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在70～75℃。
延伸时间要根据DNA
聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min是够用的。
循环数：
PCR的循环数：
主要由模板DNA的量决定，一般20～30次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预试验确定。
PCR产物积累规律：
反应初期产物以2n呈指数形式增加，至一定的循环数后，引物、模板、DNA聚合酶形成一种平衡，产物进入一个缓慢增长时期（“停滞效应”），即“平台期”。
到达平台期所需PCR循环数与模板量、PCR扩增效率、聚合酶种类、非特异产物竟争有关
PCR常见问题
一、P CR 污染与对策
污染原因：
◆标本间交叉污染
◆PCR 试剂的污染
◆PCR 扩增产物污染
◆实验室中克隆质粒的污染
污染防治：
1. 戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套；
2. 使用一次性吸头，严禁与PCR 产物分析室的吸头混用，吸头不要长时间暴露于空气中，
避免气溶胶的污染；
3. 避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。
若不
小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面；
4. 操作多份样品时，制备反应混合液，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，
这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度；
5. 最后加入反应模板，加入后盖紧反应管；
6. 操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR 反应的可靠性，又可以协助判断扩增
系统的可信性；
7. 尽可能用可替换或可高压处理的加样器，由于加样器最容易受产物气溶胶或标本DNA 的
污染，最好使用可替换或高压处理的加样器。
如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区；
8. 重复实验，验证结果，慎下结论。
二.假阳性结果的预防
1、实验器材应一次性使用(吸咀、PCR管)
2、注意操作环境，戴一次性手套
3、严格PCR操作规程
4、多次取样的试剂应分装
5、设置阴性对照和阳性对照
三.非特异产物及电泳呈涂布状
1.Mg2 浓度调节
2.调整引物、模板、聚合酶的用量
3.适当减少循环数
4.适当提高退火温度，缩短退火或延伸时间。