有机酸工艺学-柠檬酸发酵微生物与发酵机制

上海工微所 东酒2号 N-588 Co827 T419
初糖浓度18-19%，60-90h,产酸率19%，转化率 97%.
川柠-17-66（四川食品研究所），8668（黑龙江轻工 所），产酸14%，生长特性粗放，抗金属离子能力强， 以甘蔗糖蜜不需要黄血盐预处理。
葡萄糖： r-130 薯渣固态发酵： G2B2, 川柠1-1，Co827，T419
• 顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬 酸：=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋 向于合成柠檬酸，而柠檬酸分解活力低，一旦柠檬酸浓 度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从 而进一步促使柠檬酸的自身积累，PH降至2.0以下，顺乌 头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的 积累并排出体外。
丙酮酸激酶（PK）
• 变构酶 • 1,6-二磷酸果糖活化 • ATP和丙氨酸抑制 • 受柠檬酸或ATP抑制 • 被NH4+ ，K+激活
• 丙酮酸脱氢酶系的调节
• ATP/ADP,NADH/NAD+
• 产物抑制 • 乙酰COA，NADH抑制酶活性，
COASH,NAD+解除抑制 • 能荷调控 • GTP抑制，AMP活化
• 由于严格限制供给锰离子，从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑 制，使EMP途径的代谢流增大。
和线粒体中的依赖于NAD+的异柠檬酸脱氢酶均表达下调。
2020407 思考题
• 黑曲霉柠檬酸发酵过程中为什么控制MN2+浓度，与柠檬酸合成过程中 的酶调控有什么关系，请阐述机理。
• MN2+缺乏→抑制蛋白合成→NH4+↑，当培养基中MN2+缺乏时，微生 物体内积累几种氨基酸(GA、GLU、ARG、OIN等)，这些氨基酸的积 累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受 到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高。 NH4+能有效 的解除柠檬酸、ATP对PFK酶的抑制作用
• 丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制， 可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生 成乙酰COA和草酸乙酸的供给，柠檬酸合成酶又 基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成 能力。
• Α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使 黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱 TCA循环降低细胞内ATP浓度，另使Α-酮戊二酸浓度升高， 反过来反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分 解。
成能力。 • 丙酮酸脱氢酶，Β-氧化作用
柠檬酸合成酶（CS）
• 释放能量，不可逆反应 • 变构酶 • 高能荷：ATP降低CS与乙酰COA亲和力 • NADH,脂酰COA，琥珀酰COA，柠檬酸合酶反馈抑制 • 草酰乙酸的浓度保持CS催化活力
异柠檬酸脱氢酶（ICD）
• ADP和CA2+别构激活， • ATP,NADH抑制酶活性。
第二节 柠檬酸发酵微生物和发酵机制
• 一、柠檬酸发酵生产菌种 • 二、黑曲霉柠檬酸高产菌的形态特征 • 三、黑曲霉发酵柠檬酸的机制 • 四、黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征 • 五、黑曲霉积累柠檬酸基本条件 • 六、黑曲霉分离纯化和诱变筛选
第二节 柠檬酸发酵微生物和发酵机制
• 一、柠檬酸发酵生产菌种 • 1. 柠檬酸生产菌 • 黑曲霉（ASPERGILLUS.NIGER）、棒曲霉
2
磷酸己糖 异构酶
磷 酸 葡
ADP ATP 葡 萄
1糖
萄 己糖激酶
糖
2 3-磷酸甘油醛
磷酸二羟丙酮
醛磷
2NAD+
脱 氢
酸 甘
6
酶油
2NADH+
H+
2 1，3-二磷酸甘油酸
酸磷
2ADP
激酸7
酶甘 油
2ATP
2 3-磷酸甘油酸
变磷
位酸
酶甘 8
油
酸 2 2-磷酸甘油酸
2 丙酮酸
2ATP 丙酮酸激酶
10 2ADP 9 H20
NADP+ NADPH+H+
COOH C CH2 COOH
丙酮酸
L-苹果酸
草酰乙酸
黑曲霉柠檬酸 生物合成途径
C6H12O6+1.5O2 C6H8O7+2H2O
无水柠檬酸转化率106.7%， 一水柠檬酸转化率116.7%。 葡萄糖经EMP途径完全氧化： 底物水平磷酸化4个ATP 氧化磷酸化6个ATP， 葡萄糖磷酸化-2个ATP， 丙酮酸羧化-1个ATP 丙酮酸脱氢氧化磷酸化 3个ATP 净生成10个ATP.
的表达量下降了2/3；
TCA循环
• 5个柠檬酸合酶，2 个定位于线粒体的柠檬酸合酶的表达均 下调，说明比菌体生长阶段更低的代谢流也可以维持柠檬酸 的生成与分泌。
• TCA 循环在柠檬酸合酶下游的反应均在转录水平下调。 • 4 个顺乌头酸酶有2 个定位于线粒体，其表达水平都下降。 • 3 个异柠檬酸脱氢酶，其中细胞质中的依赖于 NADP+的异柠檬酸脱氢酶
转录组分析高产柠檬酸的机制
• 柠檬酸主要通过糖酵解途径和随后的线粒体中的TCA 循环产生。 • 糖酵解途径的酶基因的表达受到影响较少，仅3 个基因的表达变化。 • 而TCA 循环中的大部分基因都发生了下调
EMP途径
• 葡萄糖激酶的表达在发酵过程中逐步增加。 • 磷酸丙糖异构酶的表达上调。 • 糖酵解途径中，丙酮酸激酶是唯一被下调的酶，暗示酶的转录可能受
2 磷酸烯醇式丙酮酸 烯醇化酶
(EMP )
66-
糖 酵 解 途 径 途 径
丙酮酸羧化之路
（1）丙酮酸生成草酰乙酸，进入TCA循环
COOH
OC +
CH3
丙酮酸
丙酮酸羧化酶
CO2
生物素
ATP H2O
ADP Pi
COOH OC
CH2 COOH
草酰乙酸
丙酮酸羧化之路
（2）磷酸烯醇式丙酮酸转变为草酰乙酸，进入TCA循环
• Α-酮戊二酸脱氢酶系 • 琥珀酰COA,NADH抑制酶活性
（2） 黑曲霉
积累 柠檬酸
代谢 的 相关酶
（3） ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增 大。
• 存在一条呼吸性强的侧系呼吸链，对氧敏感，但 不产生ATP，这样使细胞内ATP浓度下降，促使 EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成。
柠檬酸
构建高产柠檬酸菌株的基因改造策略
已糖激酶（HK）
• 变构酶专一差，催化：葡萄糖、甘露糖和果糖。 • 葡萄糖激酶诱导酶，葡萄糖浓度高时起催化作用。 • 受到6-磷酸葡萄糖，6-磷酸果糖的抑制作用。
磷酸果糖激酶(PFK）
• PFK 变构酶有4个亚基。 • ATP/AMP • ATP浓度上升降低磷酸果糖激酶对6-磷酸果糖亲和力。PFK被
有霉味。
③麦芽汁琼脂培养基 上:菌落生长较快,室 温下4天达5 ～6cm， 平坦,密集遍布炭黑色 孢子,反面无色或微黄, 稍有霉味。分生孢子 头典型地着生于较短 的分生孢子枝上,成熟 时呈柱状。
孢子
发芽早期
菌丝迅速生长
由足细胞生出 分生孢子梗
孢子梗 顶端膨大
成为顶囊
初生小梗形成
初初生生小小梗梗形形成成 初生小梗形成
黑曲霉TN在PDA培养基中菌落生长情况
48 h，菌落直径增加到3～4 mm，菌落周 围出现明显透明圈，透明圈直径/菌落直径 为1.5左右 60h，菌落直径4～5 mm，菌落周围透明 圈明显增大，透明圈直径/菌落直径为2.5左 右
黑曲霉TN在PDA培养基中12h已形成 较长芽管并且具有很多分支和芽点， 这种生长特性与该菌株在液体深层培 养时形成菌丝球相关。
三、 黑曲霉发酵柠檬酸的机制
• （1）黑曲霉柠檬酸代谢途径 • （2）黑曲霉积累柠檬酸代谢的相关酶 • （3）黑曲霉发酵柠檬酸的机制 • （4）发酵柠檬酸的黑曲霉所具有的特征 • （5）高产柠檬酸黑曲霉的选育
ADP ATP
1，6-二磷酸果糖 二磷酸果 糖醛缩酶
3
磷酸果糖
磷 酸 果 糖
45
激酶
磷酸丙糖异构酶
COOH C O PO32CH2
烯醇式丙酮酸磷酸
羧化酶
+ CO2
O
GDP
GTP
COOH C CH2 COOH
烯醇式丙酮酸磷酸
草酰乙酸
丙酮酸羧化之路
（3）丙酮酸变成苹果酸，进入TCA循环
COOH
苹果酸酶
O C + CO2
CH3 NADPH+H+ NADP+
COOH CH2 HC OH COOH
苹果酸脱氢酶 O
2、发酵方式和原料
• 我国柠檬酸生产以发酵状态可分为: • 液体深层，液体浅盘 ； • 以原料可分为: • 糖蜜 、淀粉水解糖 、葡萄糖母液、淀粉 、淀粉质原料。
采用不同原料所用菌种不同
淀粉原料:
TD-01,初糖浓度20.8%，96h,产酸率20.24%，转化 率97.28%.
薯干原料: 糖蜜原料:
孢子形成
黑曲霉生活周期
➢黑曲霉属半知菌纲,一般只进行无性繁殖,由孢子发芽 开始到新孢子形成、成熟,为一个生活周期.
• 分生孢子头
• 幼时呈球形,渐变为放 射形或裂成二瓣或多 瓣,柱状,一般700～ 800ΜM,典型大的呈黑 色,小而不典型的呈褐 色,近球形,较大的不 全部着色. 菌丝顶端着生稀疏的 大型的黑褐色孢子穗， 成熟后呈开花状而迸 裂
液体石蜡： 解脂假丝酵母PC711,B74,NV
二、 黑曲霉柠檬酸高产菌的形态特征和生理特征
（1）黑曲霉菌落的形态特 征 ① 马铃薯汁葡萄糖琼脂 培养基上:菌落有辐射状 沟纹,中间炭黑色,四周新 生的菌丝为白色,树枝状。
②察氏琼脂培养基上: 室温培养7 ～10天，菌落直径达2.5～3CM， 由致密或中度疏松的白色或微黄色菌丝组成; 菌丝着生丰富密集的直立分生孢子梗。 菌落为碳黑色或深褐色,反面为无色或中央呈淡黄色,
到调控，为调控的节点。 • 2个丙酮酸脱羧酶，但只有定位于细胞质的丙酮酸脱羧酶被表达，其表
达水平与菌体生长阶段相比，减少至 1/3 水平
丙酮酸羧化支路
• 3 个细胞质定位的苹果酸脱氢酶仅 1 个基因被转录，而线粒体定位的苹 果酸脱氢酶的表达水平也急剧下调。
• 2个丙酮酸羧化酶，仅细胞质定位的基因可以被转录，该基因在产酸阶 段比发酵 6 H
(A.CLARATUS)、文氏曲霉(A.NENTIC)、泡盛曲霉 (A.AWAMORI)、芬曲霉 (A.FENICIS)、淡黄青霉 (PERUCILLIUM.LUTEAN) 、桔青霉(P.CITRIUM)、二歧 拟青霉(PAECILOMYCES.DIRARICATUM)、及梨形毛霉 (MUCOR.PICRIFOROMS)等。 • 黑曲霉（A.NIGER），文氏曲霉(A.NENTIC)和解脂假 丝酵母等菌种的深层发酵法
• 乙酰COA/COASH 酶磷酸 化失活
• 丙酮酸抑制磷酸化 • CA2+增加去磷酸化作用
• 磷酸化共价调节
• ATP酶分子中丝氨酸残基磷酸 化失活，磷酸基团被水解后复 活。
丙酮酸羧化酶
• 组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提 供草酰乙酸，
• 含生物素蛋白酶催化 • 需要ATP供能 • 乙酰COA是必需的变构激活剂 • 又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合
ATP变构抑制。可被AMP解除抑制。 • 柠檬酸调节 • 柠檬酸加强ATP对PFK的抑制作用 • H+调节 • PH下降，PFK被H+抑制
• AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、 ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。
• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高， 使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。