抗癌烷化剂三溴基丙酮酸对秀丽隐杆线虫衰老指标及寿命的影响_魏倩囡

随着全球癌症发生率和死亡率的逐年提高，癌症已经成为人类死亡的重要原因之一[1]。

在众多抗癌药物中，烷化剂是最早应用于癌症治疗的药物，也是目前被广泛应用于肿瘤化学治疗的常规药物。

在长期临床实践中发现，单功能烷化剂普遍存在治疗效率较低、毒副作用强等缺陷，很难达到理想的化疗效果[3]。

近年来，三溴基丙酮酸（3-BrPA）作为新一代高效低毒烷化剂，通过抑制肿瘤细胞糖酵解过程中的己糖激酶Ⅱ（HK2）和甘油醛-3-脱氢酶（GAPDH），协作诱导细胞内ATP 耗竭，从而导致肿瘤细胞凋亡[4-5]。

同时，其抑制了琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性，导致细胞内氧化还原状态失衡[6]。

3-BrPA 因其细胞毒性小，作用范围广，对多种肿瘤细胞敏感，因而被认为是目前临床上最有前途的抗癌烷化剂[7]，而目前关于3-BrPA 对生命体生存状态（寿命）的系统评估尚未见深入报道。

秀丽隐杆线虫是衰老研究的经典模式生物，具有相对短的寿命（在20℃下2～3 周）、保守的发育模式、遗传操作容易、测序完全的基因组几个显著特点，且其蛋白质序列中约有83％与人类同源[8]，同时有着极为丰富的遗传学和发育生物学研究背景，是研究毒理学或人类疾病的良好生物模型[9-10]。

所以本研究选择秀丽隐杆线虫作为模型生物，以评估不同浓度的3- BrPA 对秀丽隐杆线虫生存状态的影响。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 线虫株和菌株本实验所选秀丽隐杆线虫
野生型N2 和大肠杆菌OP50 均由美国国家卫生研究院衰老研究所提供。

1.1.2 试剂与仪器3-BrPA、5-氟尿苷（5-fluoro-2′-deoxyuridine，FUDR）购自Sigma Aldrich 有限公司，氯化钠（分析纯）、无水氯化钙（分析纯）、无水硫酸镁（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、磷酸二氢钾（分析纯）、N，N二甲基甲酰胺（分析纯）、磷酸氢二钾（分析纯）、叠氮钠、制霉菌素、琼脂粉、LB 营养琼脂购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨购自BD 公司。

体视显微镜SZ61 型购自日本奥林巴斯（OLYMPUS）公司；超净工作台为新加坡ESCO 实验室仪器设备；生化培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 方法 1.2.1 基础配方①NGM 固体培养基：NaCl 3 g、琼脂粉18 g、胰蛋白胨2.5 g 加入975 ml 蒸馏水，121℃灭菌20 min，冷却至60℃左右，无菌条件下加入 1 ml 的 5 mg/ml 胆固醇乙醇溶液、1 ml 的 1 mol/L CaCl2、1 ml 的1 mol/L MgSO4、0.67 ml 200 mg/ml 硫酸链霉素溶液、0.17 ml 的40 mg/ml 制霉菌素DMF 溶液和25 ml 的1 mol/L pH 6.0 的磷酸钾缓冲液。

混合均匀后铺培养皿，冷却备用。

②S-basal 缓冲液：NaCl 5.85 g、K2HPO4 1 g、KH2PO4 6 g 加蒸馏水至1 L，高压灭菌备用。

③LB 液体培养基：LB 肉汤10 g 加入蒸馏水至500 ml，121℃高压灭菌20 min。

④LB 固体培养基：LB 营养琼脂16 g 加入蒸馏水至500 ml，121℃高压灭菌20 min，
冷却至60℃时，加入200 mg/ml 硫酸链霉素溶液0.33 ml。

1.2.2 菌株培养从-80℃冰箱中取出大肠杆菌OP50，用灭菌后的牙签钝端轻轻蘸取OP50，点在LB 固体培养基上，用接种环在LB 固体培养基上涂布OP50，涂布多个位置，然后将涂布后的LB 培养基放置37℃恒温箱培养15 h。

次日用接种环选取LB 培养基上的单个菌株，涂在LB 液体培养基的瓶口处，轻轻摇晃培养瓶，让菌株均匀，之后置于37℃恒温箱培养8～10 h。

将培养后的OP50 菌液滴加在提前制备好的NGM 培养基上，置于超净工作台中生长至实验所需的厚度。

1.2.3 线虫一般培养及同期化N2：选取性成熟的成虫15 条，挑入至食物充足无污染的NGM 培养基。

将培养基放在25℃恒温箱培养5 h，剔除成虫后转移到15℃恒温箱继续培养，直至卵生长到L4 期；之后将L4 期线虫挑入新的加入FUDR 和不同浓度3-BrPA 的食物充足的NGM 培养基上，此时线虫记为Adult 0 d 龄，然后将NGM 培养基放在25℃恒温箱96 h，再转移到20℃恒温箱继续培养。

1.2.4 线虫寿命实验选取同期化培养的野生型N2 线虫进行寿命实验，实验中梯度给药，梯度给药浓度为0.000、3.125、6.250、12.500 和25.000 mmol/L，共5 个梯度，0.000 mmol/L 为对照组，其余为实验组，每组均选取135 条线虫。

浓度选择参照前期预实验结果，从最高浓度100.000 mmol/L 以 2 倍递减至最小浓度
3.125 mmol/L，预实验结果显示选择50.000、100.000 mmol/L 时，线虫会在12～15 d 或更短时间内大批量死亡，不具有实验入组的价值。

所有实验均重复3 次，结果取平均值。

1.2.5 线虫吞咽能力实验选取同期化培养的野生型N2 线虫给药时间的第5 天和第10 天进行吞咽能力实验，实验中梯度给药，梯度给药浓度为0.000、3.125、 6.250、12.500、25.000 mmol/L，共5 个梯度，0.000 mmol/L 为对照组，其余为实验组，每组均选取10 条线虫。

计时1 min，500 倍显微镜下记录线虫咽部的吞咽次数，实验重复3 次，结果取平均值。

1.3 统计学方法采用SPSS 22.0 统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组样本均数的两两比较采用ANOVA 分析（方差齐时，采用LSD-t 检验，方差不齐时，采用Games－Howell 法），以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果2.1 lifespan 的结果3.125、25.000 mmol/L 实验组和对照组比较，实验组线虫寿命缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）；6.250、12.500 mmol/L 实验组和对照组比较，实验组线虫寿命并无缩短，差异无统计学意义（P＞0.05）（表1）。

3-BrPA 给药浓度为0.000、3.125、6.250、12.500、25.000 mmol/L 时秀丽隐杆线虫寿命曲线见图Wood 等[11]发现，在大肠杆菌OP50 中加入抗生素会影响线虫寿命，为避免3-BrPA 药物自身抗菌性会影响寿命实验结果，因此在实验组和对照组均加入2
mmol/L 的卡那霉素。

线虫寿命实验结果显示，3- BrPA 的给药浓度为3.125 mmol/L 或25.000 mmol/L 时，线虫寿命缩短，提示药物自身毒性会损伤线虫寿命。

3-BrPA 的给药浓度在6.250、12.500 mmol/L 时，线虫寿命并未缩短，提示在特定浓度线虫寿命并不受药物损伤。

线虫吞咽能力实验是线虫抗衰老实验的一种，正常生理状况下，线虫的吞咽速率反映线虫进食的能力，进而间接反映线虫的衰老程度。

线虫吞咽能力结果显示，与对照组比较，3-BrPA 的给药浓度为3.125 mmol/L 或25.000 mmol/L 时，线虫吞咽速率下降，衰老加速；而当3-BrPA 的给药浓度在6.250、12.500 mmol/L 时，线虫的吞咽速率无明显变化，衰老无明显加速。

线虫吞咽能力实验结果与寿命实验结果一致。

3-BrPA 在3.125 mmol/L 或25.000 mmol/L 浓度时，线虫寿命缩短，其加速衰老的机制可能与抗肿瘤的机制一致。

3-BrPA 通过抑制糖酵解过程的酵解酶阻止细胞得到能量，从而诱导肿瘤细胞凋亡。

3-BrPA 的抗肿瘤作用在体内外均被证实[12-14]，最新研究显示，3-BrPA 可以抑制多种肿瘤的恶性发展[15-17]。

3-BrPA 在6.250、12.5000 mmol/L 浓度时，线虫寿命并不受影响，衰老并未加速，与抗肿瘤机制及此前的毒性实验结果不一致，此特殊现象或许与丙酮酸水平及饮食限制（DR）有关。

Mouchiroud 等[19]的实验显示，丙酮酸稳态在秀丽隐杆线虫的寿命控制中起着核心作用，丙
酮酸增多可以在一定程度上延长秀丽隐杆线虫的寿命。

因此，除了高浓度的3-BrPA 自身的毒性会导致秀丽隐杆线虫寿命缩短外（付喜梅[18]等的研究认为，高浓度的3- BrPA 对线虫具有毒性作用，低浓度的3-BrPA 能抑制秀丽隐杆线虫幼虫发育），3-BrPA 引起的丙酮酸减少可能是导致秀丽隐杆线虫寿命缩短的其中一个原因。

DR 是延长寿命的重要干预措施，即减少热量摄入而无营养不良[20]。

Maeda 等[21-23]的研究显示，DR 不仅可以延长寿命，而且可以延缓与年龄有关的疾病如癌症的发生，而3-BrPA 引起的细胞内ATP 摄入减少，类似于DR 的状态。

在特定的浓度下，3-BrPA 可能通过丙酮酸模拟DR 状态作用于某个特定的基因，最终导致在特殊浓度范围内秀丽隐杆线虫的寿命无损伤，具体机制目前尚无法确定。

对于此种现象涉及的3-BrPA 的具体作用机制，接下来将会进一步加大实验的样本量，并深入测试与丙酮酸相关基因及上下游调节机制，以期对糖代谢及衰老与长寿等研究领域发现新的机制，并对进一步开发新的抗肿瘤药物提供启示性线索。