细菌降解木质纤维素的研究进展

细菌降解木质纤维素的研究进展
戴芸芸;钟卫鸿
【摘要】木质纤维素结构的复杂性导致其生物降解需要多种微生物协同完成。

细菌具有生长快、结构简单、适宜酸碱性条件生长等特点，在降解木质纤维素方面具有潜在应用前景。

介绍了近年来报道的降解木质纤维素的细菌种类，综述了细菌对木质纤维素的降解机理及木质纤维素含量的测定方法。

%The biodegradation of lignocellulose needs the participation of synergism of multi-microorganisms due to its complexed natural structure.Bacteria have potential application prospects in degradation of lignocellu-lose due to their characteristics,such as rapid growth,simple structure,suitable for acid and alkaline conditions. The types of bacteria for degrading lignocellulose in recent years are introduced,and the degradation mechanism and detection methods for content of lignocellulose are summarized.
【期刊名称】《化学与生物工程》
【年(卷),期】2016(033)006
【总页数】6页(P11-16)
【关键词】细菌;木质素;纤维素;生物降解
【作者】戴芸芸;钟卫鸿
【作者单位】浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州 310032;浙江工业大学生物工程学院，浙江杭州 310032
【正文语种】中文
【中图分类】TQ352.78;X172
生物质作为一种可再生资源，其开发利用是解决目前人类能源危机的重要途径之一，但是其主要成分天然纤维质原料的结晶性和木质化限制了其可利用性[1]。

木质纤
维素包括三大类聚合物：木质素、半纤维素与纤维素。

纤维素的纤丝在高等植物细胞壁维管组织中与木质素和半纤维素通过共价键和非共价键紧密缠绕相互嵌合，形成木质纤维素。

木质纤维素在不同种、不同年龄及同一植物的不同部位的数量和种类都会有所不同。

一般来说，木质纤维素含纤维素39%、半纤维素30%、木质素25%[2]。

纤维素是以纤维二糖(葡萄糖-β-1，4-葡萄糖)为基本重复单元，由成千上万个葡萄糖分子组成的线状多聚物。

纤维素链中β-1，4连接的葡萄糖残基相对邻近单位旋转180°，链内以氢键维持稳定。

在一般植物纤维中，微晶纤维素约占70%，另30%为无定形纤维素[3]。

纤维素在种属间结构变化很小。

半纤维素高度分枝且一
般是非结晶状多糖，较纤维素和木质素更易降解。

木质素存在于较高等植物(裸子
植物和被子植物)、蕨类植物与石松的细胞壁中，主要在维管组织中负责液体的运输，而在无管胞的苔藓、地衣、藻类中无木质素[4]。

木材组织的木质化作用主要
是指生长中的木质素分子填满细胞壁中还未完全形成的纤维素纤丝及半纤维素链之间空间的过程，可提高木材组织的机械强度。

木质素是地球上数量最多的芳香族聚合物[5]，是一种分子量很大的由苯丙烷单位随机构成的不规则的多聚物(图1)[6]，由对位取代的苯丙烯羧醇——香豆醇、松伯醇和芥子醇的连续苯氧基反应形成，
其生物降解要依靠一系列自由基介导的反应完成，因而，木质素较纤维素和半纤维素更难降解。

在植物组织中，木质纤维素的各聚合物之间通过共价键和非共价键结合，形成坚固的天然屏障将纤维素分子包埋其中，使一般微生物很难进入其中分解
纤维素。

所以，木质素降解的顺利与否也是能否有效利用纤维素的关键。

在降解木质纤维素的微生物中，霉菌的降解能力较细菌强，但因霉菌生长缓慢、相关酶类结构复杂且热稳定性较差、不耐碱性条件，使得以霉菌为主要模式菌株的木质纤维素生物降解途径未能实现工业化。

因此，急需寻找其它种类的模式菌株或降解途径[7]。

真菌中有小部分酵母也具有降解木质纤维素的能力，但国内外的研究
报道较少，主要是因为其降解能力较弱。

放线菌在一定程度上能改变木质素的分子结构，继而分解溶解了的木质素，但它很少利用纤维素，而且放线菌与真菌相似，繁殖均要较长时间。

细菌具有来源更广、种类更多、生长更快等优点，且生长温度和适应pH值很宽，能在各种极端环境生存，在木质纤维素降解方面显现了潜在的应用前景，降解效果较好[8-9]。

目前，国内外对细菌降解木质纤维素的研究报道较少，且由于木质纤维素的结构复杂，至今未能直接检测，尤其是木质素的检测，所建立的相关检测模型也仅针对某一种植物。

鉴于此，作者对近年来报道的降解木质纤维素的细菌种类、细菌降解机理及木质纤维素含量的测定方法进行综述，拟为细菌降解木质纤维素的深入研究提供帮助。

1.1 降解木质素的细菌
木质素是自然界中含量仅次于纤维素的有机物。

因其致密的结构可抵御一般水解酶的作用而成为目前微生物界公认的难降解芳香族化合物之一。

利用微生物降解木质素不仅具有环保、后续污染少等优点，还能实现资源的再利用。

能降解木质素的细菌主要包括不动杆菌属、新鞘氨醇杆菌属、气单胞菌属、假单胞杆菌属、芽孢杆菌属和丛毛单胞菌属等，如表1所示。

1.2 降解纤维素的细菌(表2)
从生理学角度可将纤维素降解细菌分为可发酵的厌氧菌(代表属有高温厌氧杆菌属、芽孢梭菌属、热解纤维素菌属等)和好氧菌(代表属有好氧革兰氏阳性细菌和好氧滑
动细菌)。

1.3 降解木质纤维素的细菌
Ventorino等[23]在研究蔬菜生物质降解动力学及木质纤维素降解细菌的工业应用时发现，BacillusamyloliquefaciensCA81及LysobacterenzymogenesCE71不仅具有纤维素酶活性，也具有漆酶活性。

Thompson等[24]报道了一株嗜热嗜酸细菌Alicyclobacillusacidocaldarius，当pH值小于7和温度高于50 ℃时均能高效降解木质纤维素。

Aston等[25]还特别研究了Alicyclobacillusacidocaldarius在降解酚类物质时所展现出的高木质素降解相关酶活性。

其它报道的能降解木质纤维素的细菌如表3所示。

2.1 纤维素的降解机理
目前较为大家熟知的是通过胞外游离纤维素酶起作用的以瑞氏木霉为部分好氧真菌代表的降解模式，以及通过复合纤维小体(cellulosome)起作用的以热线梭菌为部分厌氧细菌代表的降解模式。

杨腾腾等[28]发现了第三种降解模式——细胞结合型非复合体纤维素降解模式，即通过细胞表面的非游离纤维素酶来实现纤维素的降解。

这是以哈氏噬纤维细菌(Cytophagahutchinsonii)为代表的部分好氧菌和以产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)为代表的部分厌氧菌可能具有的独特纤维素降解方式。

以上3种降解机制中，细菌对纤维素的降解主要是通过细菌分泌的纤维素酶以复合纤维小体上的纤维素结合域(CBD)附着在细胞壁的表面，被细菌吸附的纤维素因受到细菌直接的物理或化学作用而易于膨胀、被破坏，进而分解整个纤维素结构[29]。

2.2 木质素的降解机理
木质素分子一般结构复杂、分子量大，所以，微生物主要通过产生胞外酶对其进行非特异氧化降解。

部分细菌中存在完整的木质素降解酶体系，主要包括木质素过氧
化物酶(LiP)、锰过氧化物酶(MnP)与漆酶(Lac)。

LiP在H2O2的驱动下从木质素的酚型或非酚型苯环上夺取电子将其氧化成苯氧自由基，再通过链式反应产生的不同自由基来促使木质素分子结构中主要键的断裂。

MnP在H2O2的驱动下将
Mn2+氧化成Mn3+，Mn3+再通过与有机酸的螯合作用形成一种稳定结构，在该结构的作用下，木质素中的酚型苯环被氧化成苯氧自由基，从而使芳香环和Cα之间化学键发生断裂而降解木质素。

Lac不需要H2O2的驱动，有O2存在时即可催化木质素中酚类化合物的连续单电子氧化，并在氧化过程中将分子氧还原成水[15，30]。

细菌通过分泌与真菌类似的木质素降解酶系来降解木质素，同时，细菌具有简单的细胞结构、较小的细胞尺寸，易穿透木质素与其结合起作用，从而将木质素降解为低分子量的聚合木质素片断，增强木质素的溶解性等功能[31]。

3.1 纤维素含量的测定方法
纤维素含量的测定方法主要包括凡氏法及由其延伸的酸碱醇处理法[32]、重铬酸钾法[33]、差重法[34]等。

国内外对纤维素含量的测定方法进行了大量研究。

早在1970年，Goering 等[35]就提出动植物材料分为中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维及酸不溶木质素，这是较早的关于纤维素分类的报道。

中性及酸性洗涤纤维是去除样品中的淀粉、脂肪、糖类和蛋白质等成分后所残留的不溶物质的总称，包括绝大部分的纤维素、部分木质素和少量的硅酸盐等[36]。

它们的主要区别在于所用洗涤剂种类及纤维素成分的不同。

之后，越来越多的国内外学者在此基础上对纤维素含量测定方法进行改进。

崔宗均在1989年提出用醋酸-硝酸试剂处理固体纤维素底物(经微生物处理过的)，然后用清水去除非纤维素物质，再采用重量法综合测定纤维素含量[37-38]。

酸碱醇处理法、重铬酸钾法、差重法的测定前提均是要求将生物质原料经过不同酸碱醇处理后再进行后续操作。

如重铬酸钾法是将生物质粉末在加热的情况下用醋酸、硝酸和重
铬酸钾等处理，将纤维素分解成单个纤维，再除去木质素、半纤维素和其它物质；差重法是用酸碱等处理后，再依据相互之间的差值进行含量测定。

在这些测定方法中，凡氏法是根据纤维素的不同性质分别测定样品中各种纤维素类物质的含量；而酸碱醇处理法、重铬酸钾法、差重法等测定的是以纤维素为主、含有少量半纤维素和木质素的一个不确切的化学实体，主要用于比较同一测量体系中各种纤维素类物质的含量。

因此，凡氏法测定的纤维素含量更接近生物质中纤维素的真实含量。

3.2 木质素含量的测定方法
木质素是含量仅次于纤维素的可再生资源。

木质素含量的测定一般分为直接测定法(硫酸木质素法，主要针对酸不溶木质素)和间接测定法(紫外分光光度法、反相高效液相色谱法、红外光谱定量分析法等)。

下面主要介绍间接测定法。

3.2.1 紫外分光光度法
木质素是以苯丙烷为基本结构单元组成的生物有机大分子，全波长扫描显示它在200～300 nm之间有强的紫外特征吸收峰，所以可用紫外分光光度法测定木质素含量。

首先，木质素在280 nm附近有很强的吸收，其次是210 nm，同时在230 nm和320 nm附近有弱吸收。

其中，210 nm处是共轭烯键的吸收带，280 nm 处是芳香环中不可取代的m-位置引起的吸收带。

此吸收值基本遵从朗伯-比耳定律，所以可选择280 nm作为木质素的定量测定波长[18，39]。

3.2.2 反相高效液相色谱法
反相高效液相色谱法的基本原理是木质素与硫酸亚铁铵水合物和碱性氧化铜在高温条件下使待测样品生成酚类化合物，然后经碱、酸、醚、醇等处理后进样检测。

Pecina等[40]采用反相高效液相色谱法清晰地检测出木质素的9种降解产物，色谱条件为：Nucleosil 5 RP C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.01 mol·L-1KH2PO4(pH=2)缓冲溶液，流速0.8 mL·min-1，柱温50 ℃，进样量25
μL，检测波长280 nm，梯度洗脱：0～45 min，甲醇5%～50%；45～50 min，甲醇50%～70%。

Chandra等[41]采用HPLC法检测3种细菌处理造纸废液木质素的降解产物。

用浓H2SO4酸化样品至pH值为1～2，再用乙酸乙酯萃取3次，进样测定，HPLC条件为：反相C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙
腈-水(70∶30，体积比)，流速0.8 mL·min-1，柱温27 ℃。

结果发现，经过6 d
的降解，样品的峰强度较对照组明显减弱，而且未产生其它新峰，表明该细菌确实能降解木质素，且不会形成其它的降解产物。

3.2.3 红外光谱定量分析法
红外光谱在20世纪50年代就已被广泛应用于木质素含量的测定，到80年代许
多研究人员开始利用傅立叶变换红外光谱(FTIR)分析木质素及其模型化合物[42-43]。

如Robinson等[44]利用红外光谱技术预测白杨木质素单体的组成，取得了
较好的效果。

Sun等[45]通过红外光谱技术对硬木、软木、禾本科和豆科植物建立了木质素的S/G单体比例多变量化学预测模型，能够快速准确地测定木质素中
S/G单体比例。

3.2.4 其它方法
此外，还可根据总有机碳(TC)和化学需氧量(COD)的变化测定木质素含量。

其原理是培养基中可溶性木质素是作为唯一的有机物(碳源)参与反应，如果TC或COD
降低了，就表明培养基中的木质素被降解了。

以上各种木质素含量测定方法中，紫外分光光度法简便易行，具有重复性好、样品用量少、简便快速等特点，但因为紫外分光光度计检测的最低阈值较高，对于那些活性不高的细菌没有明显的效果。

反相高效液相色谱法具有检测精密度高的特点，尤其适合降解活性较低的细菌的检测，但液相色谱仪需要定期维护，成本较高。

红外光谱定量分析法不仅能够推测出木质素的结构模型，还能够通过快速测定木质素S/G单体比例来确定木质素含量，但此法的理论还需要不断完善，应用不是很广泛。

基于TC和COD的测定方法只限于对水溶性木质素的检测，而且TC的检测不适用于无矿化能力但有明显降解木质素能力的细菌。

所以，在测定木质素含量时应根据客观要求选择合适的方法。

细菌是自然界中木质纤维素降解的主要作用者之一，由于其来源广、生长快、易于大规模工业生产而成为降解木质纤维素的具有潜在应用前景的新候选者。

目前已发现多种具有木质纤维素降解能力的细菌，由于各种细菌都有其最适宜的独特生活环境，所以可根据各种细菌降解机理的差异而适时选择不同的细菌。

但关于细菌降解木质纤维素的机理研究还不是特别透彻，需要进一步深入研究。

木质纤维素是生物降解抗性最强的物质之一，在不同的植物或同一植物不同部位所提取的木质纤维素结构均不相同，而且迄今为止研究者还未能解析出木质纤维素的完整结构。

木质纤维素含量和组成的检测方法各有优缺点，一般只适用于某一种或一类木质纤维素含量与组成的检测，没有一个系统的标准来直接实现木质纤维素的各方面测定，而只能根据测定对象的客观要求和特点选择合适的方法。

今后应努力寻求一种快速、简便、准确的方法测定木质纤维素的含量与组成，这对资源利用和环境保护的意义重大。