海水养殖鱼哈维弧菌分离株的耐药谱型分析

中国水产科学 2015年1月, 22(1): 129-138 Journal of Fishery Sciences of China
研究论文
收稿日期: 2014-03-07; 修订日期: 2014-04-22.
基金项目: 国家自然科学基金项目(31202027); 中央级科研院所基本科研业务费专项资金项目(2013A0604). 作者简介: 曾德乾(1986−), 男, 硕士研究生, 主要从事海水鱼类弧菌病害研究. E-mail: qianqian052@ 通信作者: 冯娟(1973−), 博士, 研究员. E-mail: jannyfeng@
DOI: 10.3724/SP.J.1118.2015.00098
海水养殖鱼哈维弧菌分离株的耐药谱型分析
曾德乾1, 2, 冯娟1, 徐力文1, 苏友禄1, 郭志勋1
1. 中国水产科学研究院 南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300;
2. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306
摘要: 为了解和分析南海沿岸地区临床分离的哈维弧菌(Vibrio harveyi )菌株耐药谱多样性, 采用K-B 法对84株哈维弧菌分离株进行了12种抗生素的敏感性实验, 并通过聚类分析对分离菌株耐药性进行研究, 探讨其抗生素耐药性同菌株时空分布的关系。

实验结果显示, 84株哈维弧菌的耐药谱型数量为26种, 谱型丰富度为31.0%; 多重耐药谱型数量(耐药种数3种以上)为13种, 占总耐药谱型数量的50.0%, 谱型丰富度达59.1%。

海南、广东、广西、福建的分离株分别包含有18种、15种、3种、1种耐药谱型, 4个地区均具有J 型(FUR/AMO)耐药谱; 2007―2012年各年份菌株耐药谱型为: 2007年2种(J 、M, 耐2种抗生素)、2010年4种(A 、B 、J 、M, 耐5种抗生素)、2011年24种(除Y 、Z 外的A-X 耐药谱型, 耐7种抗生素), 2012年26种(包括Y 、Z 耐药谱型, 耐8种抗生素)。

聚类分析将实验菌株分为i~vi 共6个亚群, 进而聚类为Group I 、Group II 两个组群; 各亚群菌株具有独特的耐药谱型, 耐药谱型分别是N 、P 、T 、U 、Y(i 亚群), R 、S(ii 亚群), K 、P(iii 亚群), F 、H 、O 、X 、V 、W(iv 亚群), E 、G 、Q(v 亚群), C 、L 、Z(vi 亚群); 两个组群菌株没有共同的耐药谱型。

研究结果表明, 哈维弧菌分离株耐药谱型多样, 谱型丰富度较高, 来源不同的菌株耐药谱型存在差异, 聚类分析方法能够根据耐药性情况有效地对菌株分型。

关键词: 哈维弧菌; 海水养殖; 耐药谱; 聚类分析; 亚群
中图分类号: S941 文献标志码: A 文章编号: 1005-8737-(2015)01-0129-10
耐药谱是菌株对抗生素耐药形成的耐药抗生素谱, 是指依据抗菌药物药敏纸片判断标准将菌株对每一种抗生素的敏感性以抑菌圈直径划分为敏感(S)、中介敏感(I)、耐药(R), 使得菌株对同一种抗生素的耐药性具有统一、可比的结果, 1株菌株对多种抗生素可形成1种耐药谱。

细菌所处的环境及宿主的不同导致细菌耐药性的情况在不断变化, 不同地区、不同时期的临床分离株耐药谱构成存在着一定差异[1]。

病原菌耐药谱的调查是流行病学调查的重要组成部分, 对于病原菌的分布及分型有着重要的意义。

哈维弧菌为端生单鞭毛、革兰氏阴性、氧化酶阳性、葡萄糖氧化发酵型的弧菌, 菌体大小为
0.44~1.38 μm, 形成的菌落在营养琼脂平板上呈圆形灰色, TCBS 培养基为黄色, 对O/129敏感[2], 是一种广泛存在于海洋环境中的条件致病菌[3–4], 可引起多种水产经济动物的感染[5–8], 给海水养殖业带来了巨大的经济损失。

许多学者对哈维弧菌耐药性的调查研究发现, 从患病凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei )、水产养殖环境、海产品分离得到的一至十几株哈维弧菌对不同的抗生素具有不同的耐药率, 存在多种耐药谱, 如患病凡纳滨对虾分离株耐药谱为GEN/TET/CHL/FUR/ AMO/EN, 水产养殖环境分离株耐药谱为CZ/CX/ CD/MF/NA, 海产品分离株主要耐药谱为DOX/ AMP/PEN/GEN/CIP 、DOX/AMP/PEN/GEN/CIP /NOR/
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AK 等[9–11]。

分析以上3种不同来源的分离株耐药性发现哈维弧菌耐药谱广而丰富, 而且不同来源的菌株耐药谱有明显的差异。

鉴于此, 本研究测定了分离自 2007―2012年南海沿海养殖地区海水养殖鱼的84株哈维弧菌对12种常见抗生素的敏感性, 分析其耐药谱型多样性及其与地域、时间、宿主的关联性, 并进一步以抑菌圈直径为变量, 对样本菌株的耐药性情况进行聚类分析, 探讨菌株的抗生素耐药性同类性关系, 为进一步解析哈维弧菌的耐药情况及其流行病学调查奠定基础。

1 材料及方法
1.1 菌株来源
84株哈维弧菌菌株分离自2007年11月至2012年8月的广东、广西、海南沿海的患病的养殖鱼类, 其中海南地区(包括海南东海岸线的文昌烟堆、万宁港北、陵水新村港、三亚红沙湾)分离株39株, 广东地区(包括湛江的流沙湾、徐闻、湛江港, 茂名水东港、阳江闸坡大洋港、珠海万山、深圳南澳、惠东盐洲、深圳南澳、饶平欧边)分离株40株, 广西北海铁山港分离株4株, 福建漳州东山后林分离株1株。

采样时间为2007、2010、2011、2012年。

细菌分离的宿主有青石斑鱼(Epi-nephelus awoara )、鞍带石斑鱼(E. lanceolatus )、棕点石斑鱼(E. fuscogottaus )、珍珠龙趸(鞍带石斑鱼♂×棕点石斑鱼♀)、鳃棘鲈(Plectropomus leopa-rdus )、红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus )、花尾胡椒鲷(Plectorhinchus cinctus )
、卵形鲳(Trachin-otus ovatus )、点蓝子鱼(Siganus guttatus )
、黑 (Miichthys miiuy )、尖吻鲈(Lates calcarifer )
、 (Seriola quinqueradiata )鲌、翘嘴(Erythroculter ilishaeformis )。

1.2 药物敏感性实验
采用纸片扩散法(K-B 法)进行12种常见抗生素的药物敏感性实验, 药敏纸片包括头孢克肟(CEF, 5 μg/片)、庆大霉素(GEN, 10 μg/片)、四环素(TET, 30 μg/片)、环丙沙星(CIP, 5 μg/片)、诺氟沙星(NOR, 10 μg/片)、氯霉素(CHL, 30 μg/片)、复
方新诺明(T/S, 1.25/23.75 μg/片)、利福平(RIF, 5 μg/片)、呋喃唑酮(FUR, 300 μg/片)、阿莫西林(AMO, 10 μg/片)、红霉素(ERY, 15 μg/片)、恩诺沙星(ENR, 5 μg/片), 均购自于杭州天和微生物试剂有限责任公司。

取100 μL 浓度为108cell/mL 的菌悬液涂布含2% NaCl 的MH 平板, 贴上抗生素纸片, 于28℃倒置恒温培养24 h 后, 记录抑菌圈直径。

以大肠杆菌ATCC25922为质控菌, 参照《抗菌药物
药敏纸片判断标准》
[12]
判断耐药性。

1.3 哈维弧菌耐药谱分析
将受试抗生素进行排列, 将菌株对每一种抗生素的耐药情况对应以S 、I 、R 记录, 则每株受试菌株对所有受试抗生素形成唯一的耐药谱(图1), 对所有耐药谱进行归类并命名。

计算耐药率, 分析比较耐药谱型所包括的抗生素及菌株量差异, 统计分析具有3种以上抗生素的耐药谱型差异情况。

耐药率: 对某一种抗生素耐药的菌株数量占受试菌株总量的比率;
耐药谱型: 对应于若干耐药抗生素组成的唯一耐药谱;
耐药谱型丰富度: 菌株具有的耐药谱型数量与菌株数量的比值;
耐药谱型率: 部分菌株具有的耐药谱型数量占全部菌株具有的耐药谱型数量的比率。

1.4 基于耐药谱的哈维弧菌分型
为进一步研究哈维弧菌菌株的耐药性情况特征, 以抑菌圈直径作为变量, 用SPSS19.0 软件进行菌株耐药性聚类分析, 聚类分析采用分层聚类法中的ward 聚类法, 菌株间的耐药性同类系相关性以欧式距离的平方表示, 结果以树状图的形式显示[13]。

2 结果与分析
2.1 哈维弧菌的耐药谱
耐药谱型分为A −Z 共26种(图1), 谱型丰富度为31.0%, 各谱型对应的耐药谱见表1。

其中A 型耐药谱仅抗阿莫西林1种抗生素, 包括27.4%的菌株量; D 、I 、J 、K 、M 、X 6个耐药谱型抗2种抗生素, 且除X 耐药谱型外均抗阿莫
第1期曾德乾等: 海水养殖鱼哈维弧菌分离株的耐药谱型分析 131
图1 84株哈维弧菌耐药谱及其聚类分析
CEF: 头孢克肟; GEN: 庆大霉素; TET: 四环素; CIP: 环丙沙星; NOR: 诺氟沙星; CHL: 氯霉素; T/S: 复方新诺明; RIF: 利福平; FUR: 呋喃唑酮; AMO: 阿莫西林; ERY: 红霉素; ENR: 恩诺沙星. G表示菌落颜色为绿色; Y表示菌落颜色为黄色.
Fig.1 Antibiogram and cluster analysis of the 84 Vibrio harveyi strains
CEF: Cefixime; GEN: Gentamicin; TET: Tetracycline; CIP: Ciprofloxacin; NOR: Norfloxacin; CHL: chloroamphenicol; T/S:
Trimethoprim/Sulfamethoxazole; RIF: Rifampicin; FUR: Furazolidone; AMO: Amoxicillin; ERY: Erythromycin; ENR: Enrofloxacin.
G denotes green; Y denotes yellow.
132 中国水产科学 第22卷
西林, 具有菌株数为30株, 占总菌株数的35.7%; G 、N 、P 、S 、T 、U 6个耐药谱型均抗3种抗生素, 包括8株菌株, 菌株含量为9.5%; 其余13种耐药谱型均抗3种以上抗生素, 共包括22株菌株, 占26.2%, 耐药谱型丰富度为59.1%。

对3种以上抗生素耐药的菌株包括14株海南株, 8株广东株, 分别占本地区分离菌株总数的35.9%和20.0%; 海南地区的分离株多重耐药谱(耐药种数3种以上)包括CHL/RIF/FUR 、RIF/
FUR/AMO 、CHL/RIF/AMO 3种耐药谱之一, 广东地区的分离株多重耐药谱大都包含CEF/GEN/ AMO 或CEF/FUR/AMO 。

84株哈维弧菌对12种抗生素耐受程度不同(图2), 其中对阿莫西林的耐药率达到了90.5%, 对头孢克肟、庆大霉素、利福平、呋喃唑酮的耐药率维持在30.0%左右的较高水平; 对环丙沙星、恩诺沙星、复方新诺明的耐药率为10.0%左右; 而所有菌株对诺氟沙星不耐药。

表1 哈维弧菌菌株耐药谱型
Tab.1 Antibiogram types of Vibrio harveyi strains
谱型
type 菌株数/株
total number/strain
耐药谱 antibiogram
谱型type
菌株数/株 total number/strain
耐药谱 antibiogram
A 23 AMO
N 1 CEF/GEN/FUR B 5 CEF/GEN/RIF/FUR/AMO O 2 TET/CHL/RIF/FUR/AMO
C 2 TET/CHL/T/S/RIF/AMO P 2 CEF/FUR/AMO
D 1 TET/AMO Q 1 CEF/GEN/TET/CHL/T/S/RIF/FUR
E 1 CHL/T/S/RIF/FUR R 2 CEF/GEN/FUR/AMO
F 3 CEF/TET/CHL/RIF/FUR/AMO S 1 GEN/FUR/AMO
G 2 CHL/T/S/RIF T 1 CEF/GEN/AMO H 1 TET/CHL/RIF/FUR U 1 RIF/FUR/AMO
I 8 CEF/AMO V 1 GEN/CHL/RIF/FUR/AMO J 8 FUR/AMO W 1 TET/RIF/FUR/AMO K 1 RIF/AMO
X 1 CHL/RIF
L 1 CEF/GEN/CHL/T/S/RIF/FUR/AMO Y 1 CEF/GEN/RIF/AMO M 11 GEN/AMO
Z 1 CEF/GEN/TET/CHL/T/S/RIF/FUR/AMO
图2 哈维弧菌菌株对抗生素的耐药性情况比较
CEF: 头孢克肟; GEN: 庆大霉素; TET: 四环素; CIP: 环丙沙星; NOR: 诺氟沙星; CHL: 氯霉素; T/S: 复方新诺明; RIF: 利福平; FUR: 呋喃唑酮; AMO: 阿莫西林; ERY: 红霉素; ENR: 恩诺沙星.
Fig.2 Comparison antibiotic resistance of Vibrio harveyi strains
CEF: Cefixime; GEN: Gentamicin; TET: Tetracycline; CIP: Ciprofloxacin; NOR: Norfloxacin; CHL: chloroamphenicol; T/S: Trimethoprim/Sulfamethoxazole; RIF: Rifampicin; FUR: Furazolidone; AMO: Amoxicillin; ERY: Erythromycin; ENR: Enrofloxacin.
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2.2 基于耐药谱的哈维弧菌分型
以12种抗生素的抑菌圈直径作为变量对84株哈维弧菌做样本聚类分析得到的聚类树状图见图1, 欧式距离平方为1时, 所有菌株先聚类为i~vi 共6个亚群。

当欧式距离平方为2时, 亚群i 与亚群ii 先合并, 再与亚群iii 于欧式平方距离为3处合并为Group I; 亚群iv 与亚群v 、vi 合并的
组群于欧式平方距离为4处再合并为Group II 。

亚群i~vi 分别含有9、6、6、6、3、3种耐药谱型(表2); 耐药谱型率依次为34.6%、23.1%、23.1%、23.1%、11.5%、11.5%; 耐药谱型丰富度各为39.1%、35.3%、22.2%、66.7%、75.0%、75.0%。

亚群i 的耐药谱主要为AMO(A)、CEF/GEN/ RIF/FUR/AMO(B)、FUR/AMO(J); 亚群ii 的耐药
表2 哈维弧菌不同亚群的耐药谱情况
Tab.2 Antibiotic resistance patterns of different Vibrio harveyi subgroups
组群 group 亚群 subgroup 菌株量/株 total number/strain 谱型数
number of types
谱型率/%type rate
谱型丰富度/%type abundance
耐药谱(谱型/菌株数)
antibiogram(type/number of strains) AMO(A/8) FUR/AMO(J/5) CEF/ AMO(I/2) RIF/FUR/AMO(U/1)
CEF/GEN/FUR(N/1)
CEF/FUR/AMO(P/1) CEF/GEN/AMO(T/1) CEF/GEN/RIF/AMO(Y/1) i 23
9 34.6 39.1 CEF/GEN/ RIF/FUR/AMO(B/3) AMO(A/3)
TET/AMO(D/1)
FUR/AMO(J/3) GEN/AMO(M/6)
GEN/FUR/AMO(S/1) ii 17
6 23.1 35.3
CEF/GEN/FUR/AMO(R/2) AMO(A/12) RIF/AMO(K/1)
CEF/AMO(I/6)
GEN/AMO(M/5)
CEF/FUR/AMO(P/1)
Group I
iii 27
6 23.1 22.2
CEF/GEN/RIF/FUR/AMO(B/2) CHL/RIF(X/1)
TET/RIF/FUR/AMO(W/1)
TET/CHL/RIF/FUR(H/1)
TET/CHL/RIF/FUR/AMO(O/2)
GEN/CHL/RIF/FUR/AMO(V/1)
iv 9
6 23.1 66.7
CEF/TET/CHL/RIF/FUR/AMO(F/3) CHL/T /S/RIF(G/2)
CHL/T /S/RIF/FUR(E/1)
v 4
3 11.5 75.0 CEF/GEN/TET/CHL/T /S/RIF/FUR(Q/1) TET/CHL/T /S/RIF/AMO(C/2)
CEF/GEN/CHL/T /S/RIF/FUR/AMO(L/1)
Group II
vi 4
3 11.5 75.0 CEF/GEN/TET/CHL/T /S/RIF/FUR/AMO(Z/1)
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谱主要为AMO(A)、GEN/AMO(M)、FUR/AMO(J); 亚群iii 的耐药谱主要为AMO(A)、CEF/AMO(I)、GEN/AMO(M); 亚群iv 的耐药谱主要为CEF/TET/ CHL/RIF/FUR/AMO(F)、TET/CHL/RIF/FUR/AMO(O); 亚群v 的菌株耐药谱有CHL/T/S/RIF/FUR(E)、CHL/T/S/RIF(G)、CEF/GEN/TET/CHL/T/S/RIF/FUR (Q), 均具有至少3种抗生素耐药性; 亚群vi 的菌株耐药谱包括TET/CHL/T/S/RIF/AMO(C)、CEF/ GEN/CHL/T/S/RIF/FUR/AMO(L)、CEF/GEN/TET/ CHL/T/S/RIF/FUR/AMO(Z), 耐药量最少为5种,
最高达到了8种。

GroupI 与GroupII 两个组群菌株的抗生素敏感性明显差异在于对TET 、CHL 、T/S 、RIF 、FUR 、AMO 的敏感率及耐药率(表3)呈现“此消彼涨”的关系, 如GroupI 菌株对TET 的敏感率为94.0%, 耐药率为 1.5%, 而GroupII 的菌株则分别为5.9%、64.7%; GroupI 与GroupII 菌株对TET 、RIF 、FUR 、ERY 的中介敏感率也存在较大差异。

另外, GroupII 的菌株耐药的种类明显多于GroupI, 且谱型丰富度高。

表3 两组群哈维弧菌群菌株对抗生素耐药性情况比较
Tab.3 Comparing results of antibiotic resistance between GroupI and GroupII Vibrio harveyi
耐药率/% resistant rate
组群 group
耐药性情况
results of
resistance
CEF
GEN TET CIP NOR
CHL
T /S RIF FUR AMO ERY
ENR
Group I S 35.843.3 94.0 97.0100 100 98.576.140.3 0 58.294.0
Group II S 29.441.2 5.9 100 100 0 52.90 11.8 35.3 70.688.2 Group I I 34.323.9 4.5 3.0 0 0 1.5 13.429.9 1.5 41.8 6.0 Group II I 35.335.3 29.4 0 0 5.9 0 0 17.6 0 29.411.8 Group I R 29.932.8 1.5 0 0 0 0 10.429.9 98.5 0 0 Group II R 35.323.5 64.7 0 0 94.147.1100 70.6 64.7 0 0
注: S 表示敏感; I 表示中介; R 表示耐药.
Note: S denotes sensitive; I denotes intermediary; R denotes resistant.
3 讨论
3.1 哈维弧菌耐药情况
细菌耐药性的获得主要是通过耐药质粒的转移
[14–15]
, 海洋环境是一个巨大的耐药基因库, 耐
药基因可以通过细菌间的相互接触而转移, 从而使细菌具有多种多样的耐药谱[16–17]; 耐药性形成的另一条途径是细菌的部分基因发生突变从而获得耐药性[18]。

哈维弧菌含有多种耐药质粒基因[19–20], 并可通过接合方式将耐药基因传播[21] , 环境的改变如抗生素的频繁使用也可以增加哈维弧菌对该药物或同类型药物的耐药性[22]。

研究者还发现哈维弧菌基因组中存在多重耐药基因, 通过检测菌株对溴化乙锭的外排作用推测, 哈维弧菌具有强有力的外排泵作用[23]。

Kumar 等[24]、Lee [25]等的研究指出, 养殖水体、沉淀物、养殖动物等含有多种抗生素, 从其中分离到的菌株具有多种耐药谱。

早期的一些研究者已经发现分离自不同虾养殖场和环境的哈维
弧菌对氨苄西林及其他抗生素产生了耐药性[19, 26]; 近期Parvathi 等[23]对印度东南沿海的不同斑节对虾孵化场的52株哈维弧菌分离株的耐药性试验得到, 所有菌株对受试的60%的抗生素具有耐药性, 包括阿莫西林、阿奇霉素、杆菌肽、头孢氨苄、头孢噻吩、卡那霉素、耐甲氧西林和青霉素G 。

可见, 哈维弧菌的耐药谱是在不断的变化中。

本实验对84株海水鱼哈维弧菌分离株的抗生素敏感性实验结果显示, 菌株对抗生素的耐药性存在差异, 耐药谱型丰富度达31.0%, 多重耐药谱型(耐药种数3种以上)为13种, 占耐药谱型的50.0%, 多重耐药谱型丰富度达59.1%, 耐药种类最多达8种。

这一结果表明南海海水养殖鱼类中的哈维弧菌的耐药性复杂多样。

3.2 哈维弧菌耐药性时空分布
从分离的地域来看, 本研究发现海南、广东、广西、福建的分离株分别包含有18种、15种、3种、1种耐药谱型, 4个地区均具有J 型耐药谱, 即耐呋喃唑酮和阿莫西林。

其中海南、广东地区的
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分离株均对沙星类和磺胺类抗生素敏感, 对头孢克肟、呋喃唑酮、阿莫西林有较高耐药率, 含有相同的多重耐药谱型B(CEF/GEN/RIF/FUR/ AMO)、F(CEF/TET/CHL/RIF/FUR/AMO)。

Musa 等[27]对马来西亚养殖场的哈维弧菌分离株的耐药性调查发现, 96.7%菌株对氯霉素、四环素、呋喃唑酮敏感, 90.0%菌株对氨苄西林耐药; Ransangan 等[28]研究马来西亚西部海岸养殖场的哈维弧菌分离株的耐药性得出, 所有菌株均对氯霉素、呋喃唑酮等敏感, 对青霉素、万古霉素耐药; Thangapalam 等[29]指出, 分离自印度对虾养殖场的哈维弧菌耐药谱为环丙沙星/庆大霉素/土霉素/呋喃妥因, 而西孟加拉邦的分离株耐药谱是复方新诺明/土霉素。

结合本研究结果可以看出, 不同地区的哈维弧菌分离株均对阿莫西林、氨苄西林、青霉素等β-内酰胺类抗生素具有较高耐药性, 而对其他抗生素耐药性存在差异性。

从分离的时间来看, 随着采样年份的递进, 分离株的耐药谱种类不断地更新, 耐药抗生素种类不断地扩大。

2007年的分离株具有耐药谱型J 、M, 耐药抗生素种类最多为2种; 2010年的分离株耐药谱型包括A 、B 、J 、M, 最多具有5种耐药抗生素; 2011年的分离菌株具有除Y 、Z 外的其余24种耐药谱型, 出现了耐受7种抗生素的情况; 2012年的分离株则含有了Y 、Z 耐药谱型, 耐药抗生素种类比2011年增加1种, 达到8种。

进一步的分析发现, 4个年份的分离株对头孢克肟的耐药率随时间依次递增, 分别为0、20.0%、27.9%、66.7%; 对庆大霉素、呋喃唑酮的耐药率都较相近, 处于27.9%~50.0%的水平; 对阿莫西林的耐药率都高于75.0%以上; 对红霉素的耐药率均为0。

而中介敏感率各年却相差较大, 2010年分离株为80.0%, 比其他3个年份的高出至少35.0%。

从分离的宿主来看, 分离自同一种宿主的菌株耐药谱具有多样性, 如分离自青石斑鱼、棕点
石斑鱼、鳃棘鲈、卵形鲳、珍珠龙趸的菌株的耐药谱型依次有6、6、7、9、10种。

不同宿主的分离株耐药谱多样性差异显著, 除以上5种宿主的分离株外, 其余宿主的分离株耐药谱型仅为
1~3种。

然而, 不同宿主的分离株也可具有共同的耐药谱型, 如青石斑鱼、卵形鲳、珍珠龙趸分离株的共同耐药谱型为A(AMO)、B(CEF/GEN/ RIF/FUR/AMO)、I(CEF/AMO)、J(FUR/AMO), 且均对红霉素有60.0%左右的敏感率; 鳃棘鲈、点蓝子鱼分离株均含有耐药谱型F(CEF/TET/CHL/ RIF/FUR/AMO)。

分析一些研究者对其他宿主的哈维弧菌分离株耐药性情况的研究也得到相近的结果[21, 30–31]。

由此可见, 分离自不同宿主的哈维弧菌菌株具有多种耐药情况。

综上可知, 来源相同的菌株, 其耐药谱型可以多样, 而不同来源的菌株也可能具有相同的耐药谱型, 这表明本实验室获得的哈维弧菌的耐药性与其来源无明显的相关性, 这可能是因为南方养殖海水鱼交流比较频繁, 且养殖模式相似, 从而导致本批实验菌株的流行病学特征差异不显著。

3.3 哈维弧菌耐药谱的聚类分析
聚类分析(cluster analysis)又被称为集群分析, 是数理统计中通过计算样品相似性系数或距离对样品进行分类的一种方法, 可以将具有同类性质的样品聚合在一起, 在生物医学的分类分析中有着广泛的应用[32–33]。

本实验以12种抗生素的抑菌圈直径作为变量进行耐药性聚类分析, 将84株哈维弧菌样本分为2个组群, 6个亚群。

6个亚群在欧式平方距离为1时明显地各自聚为1个亚群, 2个组群则在欧式平方距离为25时聚在一起, 说明各亚群中菌株的抗生素耐药性相似度高, 亚群间菌株的抗生素耐药性差异较大, 通过抑菌圈直径对菌株聚类分析能较好地揭示菌株间的同类系关系。

采用Hunter [34]介绍的计算分型方法辨别力的公式可以知道, 本次聚类分析分型的辨别力为0.774。

这与Sloos 等[35]对53株多重耐药的金黄色葡萄球菌的聚类分辨力为0.716的结果相一致。

而张燕等[36]和Blanc 等[37]等运用该方法对40株流行病学不相关的金黄色葡萄球菌进行聚类分析时, 辨别力分别为0.988和0.972, 造成这种方法辨别力差异的原因是菌株的流行病学相关性, 与流行病学不相关的菌株, 耐药质粒的来源差异更大,
136 中国水产科学第22卷
接触的药物也复杂多样, 其耐药性差异也越显著, 故在进行耐药性聚类分析时更容易区分。

本实验中采集的样品来源于华南地区海水养殖鱼类, 流行病学上相关性较高, 因而分辨率受到一定影响。

此外, 聚类分析中, 作为变量的抗生素种类数与聚类分析结果的客观准确性与科学合理性有关, 如李景云等[13]对聚类分析应用于大肠埃希菌耐药性研究中发现, 选择8种抗生素作为变量进行聚类, 与选择12、19种抗生素作为变量聚类的结果存在差异, 这说明变量数量的不同造成了聚类结果的不同。

本研究选择12种抗生素作为变量进行聚类分析, 各亚群特征明显, 其中亚群i具有5种特异耐药谱型, 亚群ii含2种独特的耐药谱型, 亚群iii有2种独特的耐药谱型, 亚群iv仅9株菌形成了6种独特耐药谱型。

其次, 同类型的耐药菌株可以聚为一群, 如亚群i、ii、iii都含有A、B、I耐药谱型, 可进一步聚类形成GroupI; 具有相近耐药谱的亚群iv、v、vi聚类为Group II。

可见,聚类分析能较好地将耐药性相近的菌株分为一类, 使具有独特耐药谱型的各小类菌株聚为有共同耐药谱型的大的类群。

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138 中国水产科学第22卷Antibiogram types of Vibrio harveyi strains isolated from maricultured fish
ZENG Deqian1, 2, FENG Juan1, XU Liwen1, SU Youlu1, GUO Zhixun1
1. South China Sea Fisheries Research Institute, China Academy of Fishery Science; Key Laboratory for Exploitation and Utilization of Marine Fisheries Resource in South China Sea, Ministry of Agriculture, Guangzhou 510300, China;
2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 210306, China
Abstract: The present study investigated the antibiogram types of Vibrio harveyi isolates collected from diseased fish that were cultured along the south China coast. The antibiotic resistance profiles of 84 strains were tested with 12 common antibiotics using Kirby–Bauer disc diffusion methodology. The antimicrobial susceptibility data were used to identify correlations between antibiogram and subgroup types using cluster analysis software (SPSS 19.0, Statistical Product and Service Solutions). Eighty-four V. harveyi isolates formed 26 antibiogram types with an antibiogram abundance of 31.0%. The number of multiple antibiotic resistant types (i.e., resistant to more than three antibiotics) in the strains was 13 and comprised 50.0% of the total antibiogram types, causing the multi-antibiogram abundance value to increase to 59.1%. Isolates originating from Hainan, Guangdong, Guangxi, and Fujian Provinces possessed 18, 15, 3, and 1 of the antibiogram types, respectively, and all shared the J antibiogram type (FUR/AMO). Representative antibiogram types were J and M from 2007, A and B were added in 2010, 24 A to X types (A to X except for Y, Z) were added in 2011, while Y and Z appeared in 2012. The kinds of suppressive antimicrobial agents was 2, 5, 7, and 8, thereby mirroring the sampling years, 2007, 2010, 2011 and 2012, respectively. Strains isolated from Epinephelus awoara, E. fuscoguttatus, Plectropomus leopardus, Trachinotus ovatus and E. lanceolatus♂ × E. fuscoguttatus♀ contained 6–10 antibiogram types, while the remaining fish sampled had only 1–3 types. The strains clustered initially into six subgroups (i–vi) and further formed groups I and II. Each subgroup contained characteristic antibiogram types comprising N, P, T, U, Y; R, S; K, P; F, H, O, X, V, W; E, G, Q; and C, L, Z. Common antibiogram types were not found in the Group I and II strains. Our research revealed that the V. harveyi isolates displayed polymorphic antibiogram types of moderately high abundance and could be typed for resistance effectively by cluster analysis. The resistance patterns of the isolates gathered from different sources were diverse.
Key words: Vibrio harveyi; mariculture;antibiogram; cluster analysis; subgroup
Corresponding author: FENG Juan. E-mail: jannyfeng@。