实验十二杀菌剂的生物测定孢子萌发法

三、实验步骤 （1）药剂配制
水溶性药剂直接用无菌水溶解稀释 其他药剂选用合适的溶剂（如丙酮、二甲基亚砜、 乙醇等）溶解，用0.1%的吐温80无菌水溶液稀释。根 据预备试验，设置5-7个系列质量浓度，有机溶剂最终 含量不超过2%。
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（2）孢子悬浮液配n）5min
实验十二 杀菌剂的生物测定——孢子萌发法
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一、试验目的 学习并掌握杀菌剂的生物测定方法之一------孢子萌发法。 二、试验原理
将孢子培育在含有一定药剂的介质中，在保温、保湿 条件下培养一定时间后镜检，根据杀菌剂对病原真菌孢子 萌发抑制作用来测定药剂的生物活性。
载玻片
含药介质
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孢子
校正(萌 % 发 对 ) 1率 照 0对 0萌 处 照 发 理 萌 率 萌 发 10发 0 率率
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实验结果统计
处理 浓度ppm 浓度对数 检查孢子总数 孢子萌发数 孢子萌发% 更正萌发% 机率 硫酸铜
多菌灵 CK
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● 计算各处理的孢子萌发相对抑制率，采用浓度对数-几率 值法计算各药剂的EC50、EC90,标准误及其95%置信限，评价供 试药剂对靶标菌孢子萌发的抑制活性。
倒去上清液，加入去离子水
离心
去离子水将孢子重悬浮 （每毫升1×105-1×107个孢子，并加入0.5%葡萄糖溶液）
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（3）药剂处理
低浓度
药液
0.5mL
高浓度
孢子悬浮液 0.5mL
混合均匀 微量加样器
凹玻片
然后架放于带有浅层水的培养皿中，加盖保湿培养于适宜温度的培养箱中。
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四、结果调查与统计分析
当空白对照孢子萌发率达到90%以上时，检查各处理孢子萌发情况。 每处理各重复随机观察3个以上视野，调查孢子总数不少于200个，分别 记录萌发数和孢子总数。孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发。同 时还应观察记录芽管生长异常情况、附着胞形成数等。
孢子萌(发 %率 )萌 检发 查孢 孢子 子 10数 数 0
100检查孢子数萌发孢子数孢子萌发率100100对照萌发率处理萌发率对照萌发率校正萌发率实验结果统计处理浓度ppm浓度对数检查孢子总数孢子萌发数孢子萌发更正萌发机率硫酸铜计算各处理的孢子萌发相对抑制率采用浓度对数几率值法计算各药剂的ec50ec90标准误及其95置信限评价供试药剂对靶标菌孢子萌发的抑制活性
● 但在观察试验结果时，除要观察孢子萌发与不萌发这两 种截然不同的形态外，更要注意萌发芽管的形态变化，即 芽管是否有膨大现象，是否有附着器形成，附着器颜色的 深浅，发芽管长度、以及侵入菌体形成情况等，即从微细 观察中来了解药物的作用方式。
● 孢子萌发法的突出优点是快速，试验当天即可获得结果， 尤其适合于保护剂的筛选。
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