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Mutation-Screening in Xylanase-Producing Strains by Ion Implantation
班级：生物工程 学生：马春玲 2013年12月13日
LOGO
试验内容
1. Purpose and meaning 2. Introduction 3. Materials and methods
4.5 正交试验结果
Table 5. Results of ortho.1 Trend curve
Fig.2 Relationship between xylanase and time of fermentation in Aspergillus niger N212
通过对出发菌株注入不同剂量的氮离子，低能氮离子 束对菌体细胞均有一定程度的致死和损伤作用，细胞及其 损伤DNA又在其修复系统的作用下得到不同程度的修复， 从而导致黑曲霉孢子的存活率先下降，后上升，然后又下 降，并且菌种的修复出错会使其突变率大大提高，从而提 高了菌株的正突变率，从而确定了氮离子最佳注入参数。 以上试验可以得出最优培养基的组成（即各组分的最 适浓度），而且在以上培养得到了黑曲霉N212（表2），当 它发酵60个小时后酶活达到600IU/ml，比之前未优化的菌 株减少了12个小时，而且相对于原出发菌株酶活增加了100 ％。 试验证明离子注入对微生物进行诱变改良是一种行之 有效的诱变技术。
木聚糖酶是植物细胞壁的主要之一，属 于非淀粉多糖。可作为生物漂白剂用于造纸工 业，也可用于生物转化等等。目前木聚糖酶的 生产主要还依靠真菌。
对于产酶微生物的育种，国外多采用基因工程手段 构建高产菌，而国内多采用传统的诱变方法，如紫外辐 射、化学诱变剂处理等，这些诱变手段获得的突变株一 般稳定性差、容易产生回复突变且负突变较多及诱变选 育的工作量很大，而20世纪80年代末，人们发现离子束 可以引起靶物质原子移位和重排，使细胞表面刻蚀和穿 孔，并能影响和改变细胞电性等现象，提出了离子束可 以用于细胞加工和基因转移的设想，并陆续得到了研究 证实，由此产生了国内外普遍关注的离子束生物技术工 程学，而且离子束育种是一项具有我国自主知识产权且 被国际所承认的定向遗传改良的集物理诱变和化学诱变 于一身的综合诱变方法，具有损伤小、突变谱广、突变 率高的特点。
4. Results and discussion
1、Purpose and meaning
Low-energyion implantation has been considered as a new kind of mutation breeding and foreign gene delivery technique. By means of implantation low-energy ions into organisms, the biological effects and the function mechanisms of the technique are investigated, so we can apply the technique to breeding and gene engineering.
4.2 不同的碳源对木聚糖酶酶活的影响
Table 2. Effect of various carbon sources on xylanase production in Aspergillus Niger N212
根据图2可以得出，玉米穗、麸皮、麦 秸都可以作为一种易利用碳源，适量的添加 有助于菌体的生长繁殖和产酶量的提高，相 比之下，玉米穗的产酶活较高 木聚糖酶在工业生产中，需要消耗大量 的碳源，成本高，而且还会造成一定程度的 环境污染，因此本试验采用玉米穗作为碳源 以促进该酶的商品化应用。
Table 1. Ralationship between survival fraction and enengy and dose of N+implantation(vacuum control 100%)
如图1所示，经氮离子注入诱变的黑曲霉A3孢子 存活率具有随注入剂量的增加而减少，到达一定 剂量时又增大，然后再减小，再增大的趋势，在 1.56×1015ions/s•cm2剂量下，孢子的存活 率达到最大。
试验流程
收集孢子 制备菌悬液 稀释制膜（自然干燥） 离子注入 洗脱、涂布平皿、28o培养 挑选单菌落 优良菌株
高产菌株
酶活力检测
产孢子斜面
发酵
N 注入参 数
+
不同的碳源
培养工艺 的优化
不同的氮源
培养基优化的正交设计
4、Results and dicussion
4.1 N+ 注射量和不同能量的离子束对黑曲霉A3 存活率的影响
4.3 不同的氮源对木聚糖酶酶活的影响
Table 3. Effect of various nitrogen sources on xylanase production in Aspergillus Niger N212
4.4 最优培养基条件的设计
Table 4. Chart of various nutrition sources and fermenting levels
3、Materials and methods
供试菌种 黑曲霉A3（褐黑色）
培养基 孢子培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、去离子水 菌种培养基：PDA培养基 摇瓶发酵培养基：玉米穗、麸皮、（NH4）2SO4、NaNO3 分离培养基：蛋白胨、琼脂、麸皮
矿质元素、生长因子：KH2PO4、MgSO4、FeSO4、CoCl2
The aim of the present study is to screen high xylanase-producing strains by ion implantation technoligy. Then, based on an orthogonal experiment, anoptimal fermentation condition was designed for this high-yield strain.
2、Introduction
Generally xylan is a major hemicellose component of the cell walls of a higher yield plant.In a pure state it is composed of monomers of D-xylose, linked through β-1,4 glycosidic linkages. The hydrolysis of β-linkages in different polymeric carbohydrates, including β xylans, is carried out by several enzymes produced by a wide range of micro-organisms such as fungi, actinomycettes and eubacteria.
4.6 Analysis 根据表5中的极差值，四个因素对木聚糖酶的影 响强度顺序是A>B>C>D, 根据表2,黑曲霉发酵产木聚 糖酶其碳源玉米芯的浓度对产酶量有着直接的影响. 在合适的玉米芯浓度范围内，随着浓度的升高酶活 也相应升高，与此同时发酵液的黏度升高，溶氧性 能降低，因此产酶能力也降低。
少量的麦麸能够加速黑曲霉产酶，很可 能是因为其提供了黑曲霉生长的必需物，同 时，低浓度的聚山梨醇酯80也有利于黑曲霉 的生长，但浓度过高产酶量也会相应降低。
khmethods精品试验流程试验流程收集孢子收集孢子制备菌悬液制备菌悬液离子注入离子注入稀释制膜稀释制膜自然干燥自然干燥发酵发酵挑选单菌落挑选单菌落洗脱涂布平皿洗脱涂布平皿2828oo培养培养产孢子斜面产孢子斜面酶活力检测酶活力检测高产菌株高产菌株优良菌株优良菌株精品不同的碳源不同的碳源不同的氮源不同的氮源培养基优化的正交设计培养基优化的正交设计nn注入参注入参数数培养工艺培养工艺的优化的优化精品41注射量和不同能量的离子束对黑曲霉a3存活率的影响tableralationshipbetweensurvivalfractionenengytableralationshipbetweensurvivalfractionimplantationvacuumcontrol100implantationvacuumcontrol1004resultsdicussion精品如图1所示经氮离子注入诱变的黑曲霉a3孢子存活率具有随注入剂量的增加而减少到达一定剂量时又增大然后再减小再增大的趋势在1561015ionss?cm剂量下孢子的存活率达到最大
谢谢！ 敬请同学、老师批评指正！
班级：生物工程 学生：马春玲 2013年12月13日
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试验内容
1. Purpose and meaning 2. Introduction 3. Materials and methods
4.5 正交试验结果
Table 5. Results of ortho.1 Trend curve
Fig.2 Relationship between xylanase and time of fermentation in Aspergillus niger N212
通过对出发菌株注入不同剂量的氮离子，低能氮离子 束对菌体细胞均有一定程度的致死和损伤作用，细胞及其 损伤DNA又在其修复系统的作用下得到不同程度的修复， 从而导致黑曲霉孢子的存活率先下降，后上升，然后又下 降，并且菌种的修复出错会使其突变率大大提高，从而提 高了菌株的正突变率，从而确定了氮离子最佳注入参数。 以上试验可以得出最优培养基的组成（即各组分的最 适浓度），而且在以上培养得到了黑曲霉N212（表2），当 它发酵60个小时后酶活达到600IU/ml，比之前未优化的菌 株减少了12个小时，而且相对于原出发菌株酶活增加了100 ％。 试验证明离子注入对微生物进行诱变改良是一种行之 有效的诱变技术。
木聚糖酶是植物细胞壁的主要之一，属 于非淀粉多糖。可作为生物漂白剂用于造纸工 业，也可用于生物转化等等。目前木聚糖酶的 生产主要还依靠真菌。
对于产酶微生物的育种，国外多采用基因工程手段 构建高产菌，而国内多采用传统的诱变方法，如紫外辐 射、化学诱变剂处理等，这些诱变手段获得的突变株一 般稳定性差、容易产生回复突变且负突变较多及诱变选 育的工作量很大，而20世纪80年代末，人们发现离子束 可以引起靶物质原子移位和重排，使细胞表面刻蚀和穿 孔，并能影响和改变细胞电性等现象，提出了离子束可 以用于细胞加工和基因转移的设想，并陆续得到了研究 证实，由此产生了国内外普遍关注的离子束生物技术工 程学，而且离子束育种是一项具有我国自主知识产权且 被国际所承认的定向遗传改良的集物理诱变和化学诱变 于一身的综合诱变方法，具有损伤小、突变谱广、突变 率高的特点。
4. Results and discussion
1、Purpose and meaning
Low-energyion implantation has been considered as a new kind of mutation breeding and foreign gene delivery technique. By means of implantation low-energy ions into organisms, the biological effects and the function mechanisms of the technique are investigated, so we can apply the technique to breeding and gene engineering.
4.2 不同的碳源对木聚糖酶酶活的影响
Table 2. Effect of various carbon sources on xylanase production in Aspergillus Niger N212
根据图2可以得出，玉米穗、麸皮、麦 秸都可以作为一种易利用碳源，适量的添加 有助于菌体的生长繁殖和产酶量的提高，相 比之下，玉米穗的产酶活较高 木聚糖酶在工业生产中，需要消耗大量 的碳源，成本高，而且还会造成一定程度的 环境污染，因此本试验采用玉米穗作为碳源 以促进该酶的商品化应用。
Table 1. Ralationship between survival fraction and enengy and dose of N+implantation(vacuum control 100%)
如图1所示，经氮离子注入诱变的黑曲霉A3孢子 存活率具有随注入剂量的增加而减少，到达一定 剂量时又增大，然后再减小，再增大的趋势，在 1.56×1015ions/s•cm2剂量下，孢子的存活 率达到最大。
试验流程
收集孢子 制备菌悬液 稀释制膜（自然干燥） 离子注入 洗脱、涂布平皿、28o培养 挑选单菌落 优良菌株
高产菌株
酶活力检测
产孢子斜面
发酵
N 注入参 数
+
不同的碳源
培养工艺 的优化
不同的氮源
培养基优化的正交设计
4、Results and dicussion
4.1 N+ 注射量和不同能量的离子束对黑曲霉A3 存活率的影响
4.3 不同的氮源对木聚糖酶酶活的影响
Table 3. Effect of various nitrogen sources on xylanase production in Aspergillus Niger N212
4.4 最优培养基条件的设计
Table 4. Chart of various nutrition sources and fermenting levels
3、Materials and methods
供试菌种 黑曲霉A3（褐黑色）
培养基 孢子培养基：马铃薯、葡萄糖、琼脂、去离子水 菌种培养基：PDA培养基 摇瓶发酵培养基：玉米穗、麸皮、（NH4）2SO4、NaNO3 分离培养基：蛋白胨、琼脂、麸皮
矿质元素、生长因子：KH2PO4、MgSO4、FeSO4、CoCl2
The aim of the present study is to screen high xylanase-producing strains by ion implantation technoligy. Then, based on an orthogonal experiment, anoptimal fermentation condition was designed for this high-yield strain.
2、Introduction
Generally xylan is a major hemicellose component of the cell walls of a higher yield plant.In a pure state it is composed of monomers of D-xylose, linked through β-1,4 glycosidic linkages. The hydrolysis of β-linkages in different polymeric carbohydrates, including β xylans, is carried out by several enzymes produced by a wide range of micro-organisms such as fungi, actinomycettes and eubacteria.
4.6 Analysis 根据表5中的极差值，四个因素对木聚糖酶的影 响强度顺序是A>B>C>D, 根据表2,黑曲霉发酵产木聚 糖酶其碳源玉米芯的浓度对产酶量有着直接的影响. 在合适的玉米芯浓度范围内，随着浓度的升高酶活 也相应升高，与此同时发酵液的黏度升高，溶氧性 能降低，因此产酶能力也降低。
少量的麦麸能够加速黑曲霉产酶，很可 能是因为其提供了黑曲霉生长的必需物，同 时，低浓度的聚山梨醇酯80也有利于黑曲霉 的生长，但浓度过高产酶量也会相应降低。
khmethods精品试验流程试验流程收集孢子收集孢子制备菌悬液制备菌悬液离子注入离子注入稀释制膜稀释制膜自然干燥自然干燥发酵发酵挑选单菌落挑选单菌落洗脱涂布平皿洗脱涂布平皿2828oo培养培养产孢子斜面产孢子斜面酶活力检测酶活力检测高产菌株高产菌株优良菌株优良菌株精品不同的碳源不同的碳源不同的氮源不同的氮源培养基优化的正交设计培养基优化的正交设计nn注入参注入参数数培养工艺培养工艺的优化的优化精品41注射量和不同能量的离子束对黑曲霉a3存活率的影响tableralationshipbetweensurvivalfractionenengytableralationshipbetweensurvivalfractionimplantationvacuumcontrol100implantationvacuumcontrol1004resultsdicussion精品如图1所示经氮离子注入诱变的黑曲霉a3孢子存活率具有随注入剂量的增加而减少到达一定剂量时又增大然后再减小再增大的趋势在1561015ionss?cm剂量下孢子的存活率达到最大
谢谢！ 敬请同学、老师批评指正！