Nectin-1在锂-匹罗卡品癫痫大鼠海马中的表达

Nectin-1在锂-匹罗卡品癫痫大鼠海马中的表达
李小平;冯占辉;于云莉
【摘要】目的为探讨Nectin-1在癫痫形成中的作用,我们采用经典的氯化锂-匹罗卡品大鼠癫痫模型,在点燃持续状态后不同时间点观察Nectin-1蛋白在大鼠脑海马的表达变化规律.方法①选用正常成年雄性SD大鼠,随机分为正常对照组(n=10)与模型组(n=50),模型组采用氯化锂-匹罗卡品腹腔注射法,对照组用等量生理盐水腹腔注射.成功点燃后存活的大鼠以(3d、1周、2周、4周、6周)为研究时间点随机分为5个亚组,每组10只.②用Western-blot、免疫组化等经典方法观察Nectin-1蛋白在癫痫大鼠模型中的表达变化及规律.结果实验组大鼠腹腔注射匹罗卡品后,经过急性发作期及潜伏期、慢性期,出现癫痫反复的自发性发作,对照组未见急性及慢性发作.免疫组化染色对照组Nectin-1蛋白主要在胞膜及胞浆表达,在海马CA3区深染区域集中于透明层(SL).癫痫组2周、4周时Nectin-1在齿状回有较多的阳性细胞,主要表现为胞浆和核膜棕色,并向内分子层分布.Western-blot与对照组相比,在匹罗卡品诱导的SE之后2周表达升高,一直持续到慢性期4周、6周.结论Nectin-1蛋白在癫痫大鼠模型SE后慢性期海马组织中表达较正常增高,可能与癫痫的形成机制有关.
【期刊名称】《中国神经精神疾病杂志》
【年(卷),期】2018(044)007
【总页数】4页(P393-396)
【关键词】癫痫;匹罗卡品;Nectin-1;癫痫形成
【作者】李小平;冯占辉;于云莉
【作者单位】贵州医科大学贵阳550004;贵州医科大学附属医院神经内科;贵州医科大学附属医院神经内科
【正文语种】中文
【中图分类】R742.1
癫痫形成的病因因多而复杂，而难治性癫痫的形成机制目前尚不明确[1]。

国内外学者围绕“癫痫形成”展开了多方面的研究，其中大脑海马神经细胞丢失与再生、胶质增生、轴突出芽、神经网络重组、神经递质改变等，可能是癫痫形成的重要机制[2-3]。

为此，我们采用免疫组化及免疫印迹等方法，分别检测了氯化锂-匹罗卡品点燃后不同时间点大鼠海马组织中粘附链接 (puncta adherentia junctions,PAJs)结构的重要组成蛋白Nectin-1的表达，以初步探讨其在癫痫形成中的作用。

1 材料与方法
1.1 动物分组及模型建立清洁级Sprague-Dawley（SD）成年雄性大鼠 60 只，体重约 250～300 g，均来自贵州医科大学实验动物中心 [SCXK（黔）2015-001]并通过伦理委员会审核。

随机分为对照组（10只）与实验组（50只），实验组进一步造模处理。

癫痫模型建立后进一步分为5个亚组：3 d，1周，2周，4周和6周（n=10），并在相应时间点处理标本检测所需指标。

实验组：清醒状态下，大鼠经腹腔注射LiCl 125 mg/kg（美国 Sigma），经过间隔约 18～24 h 后腹腔注射硫酸阿托品1 mg/kg，30 min后腹腔注射新鲜配制PILO 50 mg/kg（美国 Sigma），按照Racine癫痫分级标准[4]对大鼠发作行为进行评估，每次观察时间间隔5 min。

观察1 h，发作行为仍未达到IV级以上的大鼠，再次注射匹罗卡品 10 mg/kg。

大鼠持续IV级以上发作60 min后，腹腔
注射10%水合氯醛3.5 mL/kg，注射30 min后若发作不能控制，再次腹腔注射1/2剂量水合氯醛，并间隔20 min重复注射直至痫性发作终止。

对照组：除用腹腔注射等体积（按照单位体重计算）生理盐水替代PILO，其余用药及间隔时间等处理条件与实验组相同。

注射后立即开始观察大鼠发作行为学变化。

充足食水饲养至癫痫持续状态（status epilepticus，SE）后 3 d，仍然存活的大鼠随机分为 3 d、1周、2周、4周、6周等 5个亚组，于SE后10 d开始每日8:00-20:00观察大鼠是否有癫痫发作，并记录发作时间及持续时间，发作分级等信息。

对SE后各时间点组以及对照组中，每组取6只大鼠，腹腔注射 10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，冰上分离双侧海马组织，冻存管标记后迅速放入液氮中保存，用于Western blot实验。

每组各另取4只大鼠同样方法麻醉后，用4℃预冷的生理盐水和4%多聚甲醛经心脏灌注后断头取脑，置于4%的多聚甲醛中浸泡过夜，脱水后常规石蜡包埋后保存，用于免疫组化检测。

1.2 免疫组织化学染色海马蜡块连续冠状切片若干，随机选取3张，常规脱蜡，热修复。

依次滴加兔抗 Nectin-1多克隆抗体（ab66985,1:700)，生物素标记的山羊抗兔Ig G（1:1000），辣根过氧化物酶标记的链球菌卵白素生物素工作液（SABC试剂），显色剂显色（DAB）；用 Leica DM6000 B 自动生物显微镜采集系统进行图像采集，各组在相同背景和对应的亚区进行进行采图。

采图部位选取海马CA3区及齿状回。

1.3 Western blot实验剪碎重量约为0.1 g的海马组织，反复进行匀浆，将匀浆后的混合液置入低温离心机中以12000转/min的速度离心20 min。

取上清液分装，-80℃冰箱保存备用。

按照试剂盒（索莱宝）说明书，进行蛋白含量测定（BCA法）后加样，电泳约 1.5 h，转膜（300 mA）75 min，室温封闭 1 h，滴加一抗（ab66985,1:1000）4℃冰箱过夜孵育，滴加二抗（武汉三鹰，1:5000）室温孵育 90 min。

显色液处理，曝光显影，用GeneSnap及凝胶图象处理系统分
析目的条带，用GeneTools标记并读取目的条带的灰度值（OD）。

1.4 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计学分析处理，计量资料用±s表示，各组与对照组组间比较使用t检验，检验水准α=0.05。

2 结果
2.1 癫痫动物模型对照组大鼠腹腔注射生理盐水后,无抽搐表现,行为正常，Racine 分级均为0级。

实验组腹腔注射匹罗卡品后,经约5～10 min出现外周胆碱能反应,如流血泪、流涎、立毛、腹泻等。

逐渐出现：触须颤动，面部阵挛，咀嚼运动，节律性点头，直至出现RacineⅣ级以上发作，持续或者反复发作至60 min以上。

点燃后1～2周静止期无明显痫性发作。

约14～20 d进入慢性期，此期大鼠开始
出现癫痫反复的自发性发作，以Ⅳ级以上的大发作为主。

2.2 免疫组化染色结果对照图组Nectin-1蛋白主要在齿状回区颗粒细胞胞膜表达，癫痫组2周、4周时Nectin-1在齿状回有较多的阳性细胞,主要表现为胞膜棕色,
并有逐渐从多形层（stratum oriens，SO）向颗粒细胞层（stratum granulosum，SG）、内分子层（inner molecular layer，IML）蔓延趋势（如图b、c）。

图1 Nectin-1在癫痫大鼠海马组织免疫组化染色左一，上图对照组大鼠齿状回区中倍视野，下图高倍视野。

SE后2 w、4 w齿状回（上图中、右）中倍视野和高
倍视野（下图中、右），黑色箭头表示阳性表达颗粒
2.3 Western-blot结果用Western-blot方法检测Nectin-1在大鼠海马组织中
的表达，以验证免疫组织化学染色观察到的蛋白的表达趋势。

与对照组相比，在匹罗卡品诱导SE后急性期（3 d）、潜伏期（1 周）表达无明显变化（P＞0.05）。

在慢性期（2周、4周、6周）表达增高，与对照组相比具有显著地统计学意义
（P＜0.05）。

图2 免疫印迹检测各组海马组织Nectin-1的表达注：“*”表示与对照组相比，
差异具有统计学意义，P＜0.05
3 讨论
连接蛋白Nectin-1最早被发现作为脊髓灰质炎病毒受体相关蛋白家族，包括PRR1和2，后来被发现还是单纯疱症病毒受体，Takahashi等根据拉丁文“necto”将PRR命名为 Nectin，意为“连接”蛋白[5]。

Nectin-1存在于很多组织，例如内皮组织的粘附连接、神经系统化学性突触的粘附连接PAJs等结构中[6-7]。

在脑海马组织突触连接结构中，Nectin-1主要分布于轴突端，与树突端的Nectin-3形成杂合连接体，与“N-Cadherin/NCadherin”连接一道，参与形成粘附连接（PAJs）结构[8]。

HORVATH等[9]研究发现在神经元发育迁移中，Nectin-1具有在引导轴突生长、促进树突分支作用；Nectin-1与多发性硬化斑块中损伤轴突修复等有关[10]。

Nectin-1与Nectin-3的不对称连接决定了轴突方向、特异性轴-棘突触的形成[11]。

我们的研究结果提示Nectin-1在氯化锂-匹罗卡品癫痫动物模型海马表达增高，以“慢性期”阶段海马齿状回变化明显，提示可能与慢性期反复发作的结构变化比如轴突出芽等有关。

另外，Nectin-1可以作用于GTP酶Rho家族，参与对神经轴突、树突发育，突触形成的过程[6]，而GTP酶Rho家族多个成员被证明与癫痫形成中的轴突、树突形态改变有关[12]。

因此，我们可以推测Nectin-1在癫痫模型中的表达可能与GTP酶Rho家族成员的改变有关，这尚需进一步实验研究。

Nectin-1/Nectin-3的连接对于轴-棘型突触的形成特异性（即避免树突-树突突触连接形成）具有重要作用，并且这个过程依赖N-Cadherin[13]。

N-Cadherin 是PAJs中另一至关重要的粘附分子，是钙依赖的细胞粘附分子家族成员之一。

多项研究表明N-Cadherin在癫痫动物模型中表达并与MFS、突触重构等神经网络重构机制相关[14-16]。

本研究发现Nectin-1的表达在时间（慢性期）、部位
（齿状回）上与N-Cadherin的表达以及新生突触形成基本吻合。

因此，Nectin-1可能通过PAJs如与N-Cadherin的对称连接相互作用，参与癫痫形成中的轴突出芽、突触重构，需要进一步研究证实。

综上所述，我们研究发现Nectin-1蛋白在氯化锂-匹罗卡品癫痫大鼠癫痫模型慢性期海马组织中表达增高，提示Nectin-1可能在癫痫形成机制中起重要作用。

Nectin-1及相关的通路蛋白，有可能成为干预癫痫的靶点，为癫痫的诊治提供新的思路，有待进一步研究。

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