HepG2细胞滚瓶培养工艺优化及硒酸壳聚糖对其抑制作用

HepG2细胞滚瓶培养工艺优化及硒酸壳聚糖对其抑制作用纪海玉;冯莹莹;于娟;彭雪丽;董晓丹;刘安军
【摘要】以HepG2为研究对象,细胞产量为考察指标,在单因素试验的基础上,采用响应面分析法,优化了HepG2细胞滚瓶培养工艺:接种量4×107个/瓶,培养时间48 h,滚瓶转速9 r/min,此条件下每滚瓶HepG2细胞产量预测值10.56×107个/瓶,验证试验得到实际细胞量为10.88×107个/瓶,与理论预测值相比,其相对误差约为3.03％.体外抗肿瘤试验表明,硒酸壳聚糖(Seleno-Chitosan,CS)对96孔板和滚瓶培养HepG2细胞抑制作用IC50值分别为169μg/mL和245μg/mL,表明细胞大量聚集可产生药物拮抗现象.该试验结果为抗肿瘤疫苗研发及肿瘤药物治疗提供理论依据.%Based on single-factor experiments, response surface methodology was employed to optimize the cultivation process of HepG2 cellsin roller bottles. The optimal culture conditions were found that 4×107 HepG2 cells were incubated each bottle cultured for 48 h with rotate speed of 9 r/min.The predicted HepG2 cells yield under these conditions was 10.56 ×107 cells/bottle and experimental value was 10.88 ×107
cells/bottle with the relative error being about 3.03％.The results in vitro antitumor experiments showed that seleno-chitosan could significantly inhibit the proliferation of HepG2 cells in 96-well plate and roller bottles with IC 50 of 169μg/mL and 245μg/mL respectively, suggesting that the HepG2 cells cultured in roller bottles would cause cells aggre-gation and generate drug antagonists. The experimental results provide a theoretical basis for development of cancer vaccine and drug treatment of tumor.
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2018(039)003
【总页数】7页(P189-195)
【关键词】HepG2细胞;滚瓶培养;硒酸壳聚糖;抗肿瘤
【作者】纪海玉;冯莹莹;于娟;彭雪丽;董晓丹;刘安军
【作者单位】天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学
食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天
津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食
品工程与生物技术学院,天津300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300457
【正文语种】中文
肝癌是世界三大恶性肿瘤之一，每年因肝癌死亡的60万病例中至少有30万发生
在中国，目前尚未有有效治疗肝癌的办法[1-4]。

人肝癌细胞系HepG2细胞最初
从人肝母细胞癌中分离出来，能够保留人肝细胞特征，展现出健康肝细胞的形态[5]。

目前研究药物对贴壁肿瘤细胞抑制作用普遍用方瓶，但方瓶细胞培养量，细
胞分布稀疏，与肿瘤细胞实际生长环境差异较大，因此我们通过滚瓶对其进行培养，不仅可提高细胞培养效率，更可使细胞生长密集，更接近其体内生长状态。

硒是人和动物体内都必不可缺少的微量元素在免疫反应中起着重要作用[6-7]。

复
方硒多糖在预防和治疗多种肿瘤、心脑血管疾病以及自身免疫性疾病方面具有较为显著的成效，孙国栋等[8]研制的香菇硒多糖胶囊，在治疗急性病毒性肝炎过程中
可作为辅助药物，彰显出良好的临床效果。

壳聚糖是自然界中发现的丰富且可再生、可降解的生物聚合物，通常被认为具有生物相容性和无毒性[9-10]，硒酸壳聚糖是利用天然壳聚糖与无机硒制备而成的有机硒化产物，可通过正负电荷间的作用、保持机体微环境呈弱碱性、抑制肿瘤细胞生长和转移等方式达到抗肿瘤功效。

邓守恒等[11]发现硒酸壳聚糖能够有效地抑制K562细胞的生长，Hector Estevez等[12]研究发现纳米级的硒化壳聚糖可将HepG2细胞阻滞在S-G2/M期从而诱导其发
生凋亡。

响应面分析法（response surface methodology，RSM）能够精确地表述因素
和响应值之间的关系，是一种优化反应条件的有效方法[13-14]。

鉴于目前对硒酸
壳聚糖的研究集中在其诱导肿瘤细胞凋亡的机制，而关于肿瘤细胞大规模培养以及同一浓度药物对不同数量的细胞的影响研究鲜有报道。

本试验通过响应面法优化得到HepG2细胞滚瓶培养最佳条件，并通过MTT实验探索硒酸壳聚糖对不同培养
条件的HepG2细胞生长的抑制作用。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
人肝癌HepG2细胞株：中国医学科学院基础医学研究所。

DMEM干粉培养基：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；二甲基亚砜（DMSO）：北京索莱宝生物科技有限公司；噻唑蓝（MTT）：Sigma
公司。

1.2 仪器与设备
超净工作台：Thermo Scientific有限公司；PYC-30 CO2培养箱、CGIII-30-F细胞转瓶培养器、滚瓶（410mm，Ф 110）：美国精骐有限公司；立式高压灭菌锅：上海申安医疗器械有限公司；生物显微镜：上海中恒仪器有限公司；滚瓶观察台：上海山富科学仪器有限公司；酶标仪：美国Bio-Rad。

1.3 方法
1.3.1 HepG2细胞株的日常维系
将人肝癌细胞HepG2培养在含10%胎牛血清、青霉素链霉素各为100 U/mL的DMEM培养基中，在CO2浓度为5%的37℃培养箱中培养[15]。

每隔1天～2天或在培养基变为浅黄色时换一次液。

当细胞生长至占瓶底面积的80%时，进行细胞传代。

在超净台内操作，先弃去旧培养基，用生理盐水轻轻洗2次后，加入适量胰蛋白酶-EDTA消化，在显微镜下观察到细胞变圆后，迅速加入新的培养基，终止消化。

用移液枪将细胞吹下，转于离心管中，在1 000 r/min转速下离心5 min，弃去上清，新培养基重悬后，用血球计数板进行细胞计数，最后按合适比例传代。

1.3.2 单因素试验
本试验中选用直径11 cm、长41 cm、表面积为1 416 cm2规格的滚瓶。

固定初始细胞培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度5%，培养基用量100 mL，接种量3×107个/瓶，培养时间 48 h，滚瓶转速 15 r/min。

然后分别考察接种量、培养时间和滚瓶转速3个因素对HepG2细胞培养的影响。

1.3.
2.1 接种量的探索
分别以接种量为每滚瓶1×107、2×107、3×107、4×107、5×107个/瓶的细胞进行传代，每滚瓶中加入 100 mL培养基。

1.3.
2.2 培养时间的确定
在HepG2细胞传于滚瓶后，分别将其培养24、36、48、60、72 h 后，进行细胞计数。

1.3.
2.3 滚瓶转速的研究
HepG2 细胞传于滚瓶后，分别以 5、10、15、20、25 r/min的速度培养，然后进行细胞计数。

1.3.3 HepG2细胞滚瓶培养条件的优化实验
根据单因素试验结果及Box-Behnken试验设计原理，以接种量、培养时间、滚瓶转速为自变量，以HepG2细胞培养量为响应值，利用Design-Expert8.0软件进
行三因素三水平响应试验设计（见表1）。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology水平因素A接种量/（×107个/瓶）B培养时间/hC滚瓶
转速/（r/min）133****4810-156015
1.3.4 MTT法测硒酸壳聚糖对细胞的增殖抑制作用
96孔板培养：取对数生长期HepG2细胞加入96孔板中，每孔约4 000～5 000
个细胞共100 μL，待细胞生长至70%～80%并具有多于90%的细胞存活率时，
向96孔板中加入硒酸壳聚糖溶液，使终浓度分别为25、50、100、200、400、800 μg/mL，阳性对照组为 5-氟尿嘧啶，培养24 h，于培养结束之前4 h加入
20 μL MTT，再培养4 h后离心，终止后弃去孔内的上清液，每孔加入150 μL DMSO，然后将其置于震荡器上震摇10 min。

待孔内的结晶物溶解之后，立即用酶标仪在波长490 nm处对吸光度进行测定。

滚瓶培养：取4×107个HepG2细胞传入到1个滚瓶中，加入100 mL培养基。

48 h后将细胞用含EDTA的胰蛋白酶消化下来，用DMEM培养基终止消化，1 000 r/min的转速下离心5 min弃去上清液，用DMEM培养基对细胞进行重悬，然后将重悬的细胞均匀分成7份分别传到7个滚瓶中，补充培养基至终体积为
100 mL，培养48 h后对7个滚瓶的细胞中加入硒酸壳聚糖溶液，使其终浓度分
别为 25、50、100、200、400、800 μg/mL 以及 5-氟尿嘧啶（5-Fu），培养
24 h，于培养结束之前4 h进行收细胞的操作。

根据96孔板培养经验，取约
5×104个细胞加入到96孔板的一个孔中，用DMEM培养基补足体积至200 μL，再加入20 μL MTT工作液（终浓度为0.5 mg/mL），在温度为37℃、CO2含量
为5%的CO2培养箱内孵育4 h，后将96孔板在1 500 r/min转速下离心10 min，每孔弃150 μL上清，加150 μL DMSO。

96孔板经振荡器震荡10 min后，用酶标仪在490 nm下进行检测。

计算抑制率及用SPSS软件计算IC50值。

抑制率计算如下：
抑制率/%=（OD1-OD2）/OD1×100
式中：OD1为空白组细胞吸光值；OD2为加药组细胞吸光值。

1.4 数据处理
所有实验数据为3次重复实验的平均值，采用O-rigin 9.0作图，SPSS Statistics 18.0、Design-Expert 8.0进行数据处理与分析。

2 结果与分析
2.1 单因素实验结果
2.1.1 起始接种量对HepG2细胞滚瓶培养产量的影响
接种量对HepG2细胞产量的影响见图1。

如图1所示，HepG2细胞随着接种量的变化呈先增加后下降的趋势。

当接种量为
1×107个/瓶及2×107个/瓶时，HepG2细胞的形态完好且培养基透亮，细胞状
态好，但产量低，生长较稀疏，当接种量为5×107个/瓶时，接种量过多使得培
养基中的营养物质消耗速度加快，代谢产物增加，甚至发生细胞脱落，因而产量降低。

最佳接种量应该在4×107个/瓶左右。

图1 接种量对HepG2细胞产量的影响Fig.1 Effects of inoculation amounts on the HepG2 cells yield
2.1.2 培养时间对HepG2细胞滚瓶培养产量的影响
培养时间对HepG2细胞产量的影响如图2所示。

图2 培养时间对HepG2细胞产量的影响Fig.2 Effects of incubation time on
the HepG2 cells yield
如图2所示，随着培养时间的增加，滚瓶培养HepG2细胞的产量是先升高后下降的，细胞培养时间为24 h时，细胞未铺满滚瓶壁；培养时间为36 h时，细胞单层生长，基本铺满滚瓶壁，细胞状态也完好；培养时间为48 h后，部分细胞堆积生长，细胞状态良好；当培养72 h后，细胞代谢产物增加，多层细胞堆积，营养物质缺乏，细胞开始脱落、死亡。

因此最佳培养时间在48 h左右。

2.1.3 滚瓶转速对HepG2细胞滚瓶培养产量的影响
滚瓶转速对HepG2细胞培养产量的影响结果如图3所示。

如图3所示，随着滚瓶转速的提高，HepG2细胞培养量是先增加后下降的。

当滚瓶转速为5 r/min时，由于转速过低，部分细胞未能及时接触培养基，从而缺乏营养物质死亡。

当转速为20 r/min～25 r/min时，转速太快，部分细胞未能成功贴壁，因而不能生长增殖，使细胞产量低。

较为合适的转速在10 r/min左右。

图3 滚瓶转速对HepG2细胞产量的影响Fig.3 Effects of rotate speed on the HepG2 cells yield
2.2 响应面实验结果
2.2.1 数学模型的建立
响应面试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis试验号 A接种量 B培养时间 C滚瓶转速 Y HepG2细胞产量/（×107个/瓶）1 -1 0 1 7.86 2 -1 -1 0 9.15 3 0 0 0 10.84 4 0 -1 1 7.98 5 0 0 0 7.89 6 0 1 -1 10.56 7 0 1 1 5.98 8 0 0 0 10.24 9 1 0 -1 9.21 10 1 1 0 9.43 11 1 -1 0 8.65 12 -1 0 -1 9.81 13 -1 1 0 6.28 14 0 0 0 6.39 15 0 0 0 10.68 16 0 -1 -1 7.94 17 1 0 1 8.26
单因素试验结果表明，培养的条件为：接种量4×107个/瓶，培养时间48 h，滚瓶转速为10 r/min时，滚瓶培养HepG2细胞的产量最高。

因此如表2所示，将
接种量、培养时间、滚瓶转速作为研究对象条件，以HepG2细胞培养量为响应值，得到17组实验点。

13组为析因点，4组为中心点。

采用Design-Expert8.0软件进行分析，得到HepG2细胞培养量对以上因素的二次多项回归模型为：
Y=10.43-0.04A-0.96B+0.15C-0.66AB-0.61AC-0.12BC-0.54A2-1.91B2-1.32C2。

二次回归模型方差分析结果见表3。

表3 二次回归模型方差分析Table 3 Analysis of variancef the quadratic regression model来源平方和自由度均方 F值 p值模型 36.89 9 4.1 32.56 ＜0.000 1 A接种量 0.013 1 0.013 0.1 0.759 1 B培养时间 7.45 1 7.45 59.18
0.000 1 C滚瓶转速 0.17 1 0.17 1.34 0.285 6 AB 1.74 1 1.74 13.84 0.007 5 AC
1.49 1 1.49 11.82 0.010 9 BC 0.053 1 0.053 0.42 0.537 5 A2 1.21 1 1.21 9.59 0.017 4 B2 15.29 1 15.29 121.46 ＜0.000 1 C2 7.34 1 7.34 58.33 0.000 1残差0.88 7 0.13失拟向 0.21 3 0.071 0.43 0.745 6纯误差 0.67 4 0.17总误差 37.77 16
由表3方差分析可知，模型的p值显著，失拟项P为0.745 6，差异不显著，说
明该模型能够明显优化滚瓶培养HepG2细胞。

R2为0.976 7，调整后R2为
0.946 7，说明证明该模型能解释97.7%的结果值的变化规律，基本可用于
HepG2细胞滚瓶培养，试验误差小，能够反映响应值的变化。

由表3，我们还可
看出，在本实验设计中 B、AB、B2、C2项均为极显著（p＜0.01），AC、A2项
为显著（p＜0.05），A、C、BC 项为不显著。

2.2.2 响应面分析结果
各因素之间的交互作用的三维立体响应曲面和等高线图见图4。

响应面法能够根据二次方程模型分别做出试验因素间交互作用的三维立体响应曲面和等高线图[15]。

响应面曲面可以较直观地反映各因素及两两因素交互作用对响应值的影响。

因素对响应值影响越大，曲面越陡峭，等高线的稀疏程度显示响应面曲
面图的平陡[16-18]。

等高线的形状能够反映两因素之间影响，椭圆形表示因素的
交互作用显著，圆形则表示交互作用不显著[19]。

由图4可知通过响应面的陡峭程度分析发现，滚瓶转速对HepG2细胞的生长量影响最大，其次是接种量和培养时间，这与方差分析结果一致。

滚瓶转速和接种的交互影响最大。

根据响应面软件分析，可从回归模型中得到最HepG2滚瓶培养的优培养条件：接种量4.11×107个/瓶，培养时间48.51 h，滚瓶转速8.64 r/min，此条件下HepG2细胞产量预测值10.56×107个/瓶，在此条件下进行验证实验（3个平行
实验），得到实际细胞量为10.88×107个/瓶。

与理论预测值相比，其相对误差
约为3.03%，说明模型该可以较好地优化HepG2细胞滚瓶培养的条件。

图4 各因素交互作用的响应面与等高线图Fig.4 Response surface and contour plots showing the effect of various incubation conditions on the yield of HepG2 cell
2.3 硒酸壳聚糖对细胞的增殖抑制作用分析
硒酸壳聚糖对HepG2细胞的抑制作用结果见图5。

由图5我们可知，无论是孔板培养和滚瓶培养，硒酸壳聚糖的浓度在25 μg/mL～200 μg/mL 范围内时，随着硒酸壳聚糖浓度的增加，其对HepG2细胞的增殖抑
制率呈明显增强的趋势；在硒酸壳聚糖作用的浓度为200 μg/mL～800 μg/mL时，随着硒酸壳聚糖作用浓度的增加其对HepG2的增殖抑制率也呈上升的态势，但明显趋向于平缓，原因可能是当硒酸壳聚糖药物浓度达到200 μg/mL时，HepG2
细胞几乎全被抑制，也只是稍低于用于癌症治疗的药物5-Fu的效果。

但这说明硒酸壳聚糖对HepG2细胞有着促凋亡作用。

经计算可得出硒酸壳聚糖对96孔板和
滚瓶培养HepG2细胞IC50值分别为169 μg/mL 和245 μg/mL，滚瓶培养的细胞的IC50值明显高于孔板培养组，这是因为孔板培养HepG2细胞，细胞只能按
层平铺生长，而滚瓶培养的细胞发生聚集，能够叠着长成小肉瘤形态，更接近宿主
体内肿瘤细胞的生长状态，表明大量细胞聚集可产生药物拮抗作用。

由于硒酸壳聚糖的天然性和良好的抑癌效果，所以极具研究价值。

图5 硒酸壳聚糖在不同作用浓度不同作用时间下对HepG2细胞的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of seleno-chitosan on HepG2 cells in different concentrations at different time
3 结论
本研究以HepG2细胞培养量为评价指标，通过单因素试验和Box-Behnken响应面优化试验得出HepG2细胞滚瓶培养的最佳条件为接种量4.11×107个/瓶，培养时间48.51 h，滚瓶转速8.64 r/min时，HepG2细胞培养量最高，为
10.56×107个/瓶，验证实验得到实际细胞量为10.88×107个/瓶，与理论预测值相近。

说明响应面法对滚瓶培养HepG2细胞的培养条件的优化是可行的。

多糖具有良好的抗肿瘤或抗氧化活性，副作用小，是治疗一些常见疾病甚至肿瘤的替代药物之一[20]。

很多学者也证实了硒多糖具有抗肿瘤活性，Mao Guanghua 等[21]发现Se-GP11多糖可以通过改善荷瘤小鼠的免疫功能来提高抗肿瘤作用；Wang Junlong等[22]的研究中发现SeASPMW多糖对人H1650肺癌细胞的生长产生抑制作用；Yang Shengli等[23]从蝉分离得到的富硒胞外多糖Se-CEPS能够抑制结肠癌CT26细胞的生长。

通过MTT实验我们发现硒酸壳聚糖对HepG2肝癌细胞生长具有明显抑制作用，对96孔板和滚瓶培养HepG2细胞IC50值分别为169 μg/mL和245 μg/mL，说明细胞在滚瓶培养条件下可发生聚集现象，从而产生对药物的拮抗作用。

该实验结果为抗肿瘤疫苗研发及肿瘤药物治疗提供理论依据。

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