沉淀分离技术.

蛋白质聚集沉淀
（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集，将大量盐 加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化 力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失， 使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。
（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域,由于憎水区域间作用使蛋 白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。
（3）中和电荷，减少静电斥力，中性盐加入蛋白质溶液后，蛋 白质表面电荷大量被中和，静电斥力降导致蛋白溶解度降低， 使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
亲水胶体在水中的 稳定因素
水化膜
水化膜
+ + + + + + ++ +
带正电荷蛋白质 （亲水胶体） 脱水
碱 酸 等点电时的蛋白质 （亲水胶体） 脱水
碱 酸 带负电荷蛋白质 （亲水胶体） 脱水
+ + + + + + ++ +
带正电荷蛋白质 （疏水胶体）
阴离子 不稳定蛋白颗粒
阳离子
带负电荷蛋白质 （疏水胶体）
7.65 6.85
（1）忽略溶液体积的变化，若回收90%的BSA，需要加 入多少固体硫酸铵？（37.27Kg） （2）沉淀中BSA的纯度是多少？（95.34%）
KS分段盐析法
在一定pH、温度条件下，改变离子强度。 适用于早期粗提阶段的分步分离。
虽然这个理论所假定的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该 理论对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮助，同时还 有助于针对具体蛋白质选择最合适的沉淀剂及技术。
DLVO理论
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度。 在低离子强度时，颗粒距离处在中间状态，双 电层斥力占优势，可看为一个凝聚的势垒；在 高离子强度时，吸引力超过排斥力，相互间的 总位能表现为吸引位能。 虽然这个理论所假定 的条件并不完全适合于蛋白质分子，但该理论 对于理解破坏蛋白质溶液的稳定性仍有很大帮 助，同时还有助于针对具体蛋白质选择最合适 的沉淀剂及技术。
5、盐析曲线的制作
方法一：取料液分成等体积几份，冷却至0℃
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度（或测定离心上清液）
以饱和度为横坐标，沉淀（或上清液）中总蛋白和目标蛋白浓 度为纵坐标，得到蛋白质溶解度曲线
蛋白质量(mg)或酶 活力
10
总蛋白 目标蛋白
20
用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色
谱分离使用的限制因素降低到最少。
§3.2 蛋白质的溶解特性

蛋白质的溶解行为是一个独特的性质，由其组成、 构象以及分子周围的环境所决定。 蛋白质在自然环境中通常是可溶的，所以其大部 分是亲水的，但其内部大部分是疏水的。 一般而言，小分子蛋白质比起在化学上类似的大 分子蛋白质更易溶解。
血浆
乙醇法沉淀 沉淀物Ⅰ＋Ⅱ＋ Ⅲ
废弃上清液 乙醇法沉淀沉 淀物Ⅳ 废弃沉淀 乙醇法沉淀沉 淀物Ⅴ 重新溶解 的沉淀 白蛋白(纯度96～99％)
上清液
图1 利用蛋白质沉淀大规模提纯白蛋白与免疫球蛋白的工艺流程图

沉淀法分离蛋白质的特点：
生产前期可使原料液体体积很快减小 10~50倍，从而
简化生产工艺、降低生产费用； 使中间产物保持在一个中性温和的环境； 可及早将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合液中分离出 来，避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
5.68×10-3 g/L
例3.2 有100L蛋白质溶液，其中含牛血清蛋白BSA和另 一种杂蛋白X，质量浓度分别为10g/L和5g/L。拟用硫酸铵沉 淀法处理该溶液以回收沉淀中的BSA。20℃下BSA和X的 Cohn方程参数列于下表（假设其他蛋白质的存在不影响方 程参数），其中离子强度用硫酸铵浓度（mol/L）表示。 蛋白质 BSA X β 21.6 20.0 Ks
S：离子强度为I时蛋白质的溶解度； S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度； KS：盐析常数。
当溶剂的温度一定时，对 于某一溶质，S0是一常数， β（溶解度常数）
Cohn方程
KS越大，有效成分溶解度随盐浓度增加而减小的程度越大。 KS越大，分级范围越小，盐析效果越好。
离子价数 KS主要取决于盐的性质： 离子半径
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加入沉淀剂
沉淀剂的陈化 促进粒子生长
离心或过滤 收集沉淀物
加沉淀剂的方式和陈化条件 对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响
沉淀能否发生
沉 淀 过 程 应 考 虑 的 问 题
沉淀剂或沉淀条件下对活性结构是否有破坏作用
沉淀剂是否容易除去
沉淀剂是否对人体有害

沉淀技术分离生化产物的典型例子是蛋白质的分离提取
荷电区
蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、 亲水区和疏水区构成
表1 影响蛋白质溶解度的参数
蛋白质性质
分子大小
氨基酸组成 氨基酸序列 可离子化的残基数 极性/非极性残基比率 极性/非极性残基分布 氨基酸残基的化学性质
溶液性质
溶剂可利用度（如：水）
pH值 离子强度 温度
蛋白质结构
蛋白质电性 化学键性质
§3.4 蛋白质沉淀方法
中性盐盐析法
等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 金属沉淀法
其他沉淀法
一、中性盐沉淀法（盐析法） 1、盐析的概念及过程 概念
盐析：在高浓度的中性盐存在下，蛋白 质（酶）等生物大分子物质在水溶液中 的溶解度降低，产生沉淀的过程。
优点
①成本低，不需要 特别昂贵的设备 ②操作简单、安全 ③对许多生物活性 物质具有稳定作用
常用于蛋白质沉淀的盐为硫酸铵和硫酸钠。硫酸钠虽无腐 蚀性但低于400C就不易溶解，因此只适用于热稳定性较好的蛋 白质的沉淀过程。
0℃
20℃
80℃
100 ℃
（NH4)2SO4
Na2SO4 NaH2PO4
70.6
4.9 1.6
75.4
18.9 7.8
95.3
43.3 93.8
103
42.2 101
最常用的盐：硫酸铵
第三章
沉淀分离技术
Precipitation Technology
§3.1 沉淀法概述
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
通过沉淀达到浓缩的目的 通过沉淀，固液分相后，除去留在 液相或沉积在固体中的非必要成分 沉淀可以将已纯化的产品由液态变 成固态，加以保存或进一步处理
沉淀的目的
沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀 杂质或有选择地沉淀所需成分。
3、中性盐的选择 选用盐析用盐的几点考虑：

盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济
Hofmeister对一系列离子沉淀蛋白质的能力
进行排序，称Hofmeister序列，或感胶离子序。
阴离子：
柠檬酸根-3>酒石酸根-3 >F->I03->H2P04->S04->CH3C00>Cl->Cl03->Br->N03->Cl04->I->CNS阳离子： Th4+>Al3+>H+>Ba2+>Sr2+>Ca2+>Cs+> Rb+>NH4+>K+>Na+>Li+
？？？
2、中性盐沉淀蛋白质的基本原理
蛋白质和酶均易溶于水，分子中的－COOH、－NH2
和－OH等亲水基团，与极性水分子相互作用形成水化层， 包围于蛋白质分子周围形成亲水胶体，削弱了蛋白质分子 之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越 厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解
度也越大。 电荷


疏水区（憎水区）
在水溶液中，多肽 链中的疏水性氨基 酸残基具有向内部 折叠的趋势，即便 如此，一般仍有部 分疏水性氨基酸残 基暴露在外表面， 形成疏水区。疏水 性氨基酸含量高的 蛋白质的疏水区大， 疏水性强。
水分子
亲水性氨基酸残基 基本分布在蛋白质 立体结构的外表面。
亲水区
蛋白质是两性高分 子电解质，主要由 疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成。
30
40
50
60
70
80
90 100
总蛋白 目标蛋白
硫酸铵饱和度％ 蛋白质量(mg)或酶 活力
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
方法二
各级均离心分离沉淀物，将沉淀溶于2倍体积的缓冲液中，测 定其中总蛋白和目标蛋白浓度 以饱和度为横坐标，总蛋白和目标蛋白浓度为纵坐标，得到蛋 白质溶解度曲线
颗粒间的相互作用
颗粒间的相互作用的位能取决于离子强度
静电斥力 蛋白质 分子 范德华引力 蛋白质 分子
偶极力 色散力
诱导力
DLVO理论
在低离子强度时，颗粒距 离处在中间状态，双电层 斥力占优势，可看为一个 凝聚的势垒 在高离子强度时，吸引力 超过排斥力，相互间的总 位能表现为吸引位能
低离子强度
高离子强度
早在1859年，中性 盐盐析法就被用于从 血液中分离蛋白质， 随后又在尿蛋白、血 浆蛋白等的分离和分 级中使用，得到了比 较满意的结果。
缺点
得到的样品欲继 续纯化，需花一 定时间脱盐
过程 盐溶 盐析
蛋白质在等电点时，容易互相吸引聚合沉淀。 加入盐离子后，破坏了吸引力，增加静电斥 力，使分子散开，溶解度增大
V：所需加入的饱和硫酸铵溶液的体积； －60℃，趁热滤去沉淀， V0：原溶液体积； 再在0℃或室温平衡1－2 S2：所需达到的硫酸铵饱和度； S1：原溶液的硫酸铵饱和度。 天，有固体析出时达100
过量的硫酸铵，加热至50
％饱和度。
（3）透析平衡法 优点 硫酸铵浓度变化连 续，盐析效果较好。 缺点
硫酸铵饱和度的测 定、计算工作手续繁 琐，而且透析袋容积 有限、盐析速度慢、 硫酸铵耗费大。
（1）溶解度大 优 点
（2）分离效果好
（3）不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。 （4）价格便宜，废液不污染环境。
缺点
缓冲能力弱，具腐蚀性，含N
4、 盐析的操作方法
（1）加入固体盐法 适用：饱和度高，不增大溶液体积
饱和度： 在给定条件下以可能达到的最大浓度的百分数表示的盐
浓度。
以硫酸铵为例： 25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，ห้องสมุดไป่ตู้义为100%饱和度
蛋白质量(mg)或酶 活力
10
总蛋白 目标蛋白
20
30
硫酸铵饱和度％
40
50
60
70
80
90
100
蛋白质量(mg)或酶 活力
总蛋白 目标蛋白
0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
硫酸铵饱和度％
6、盐析的影响因素
盐析时，蛋白质溶解度与中性盐的离子强度的关系： （1） 离 子 强 度 与 离 子 类 型

优点：设备简单、成本低、原材料易得、 便于小批量生产；

缺点：所得沉淀物可能聚集有多种物质， 或含有大量的盐类，或包裹着溶剂， 产品纯度常比结晶法低， 过滤也较困难。
eg. 从血浆中通过5步沉淀生产纯度高达99%的免疫球蛋白 和96%~99%的白蛋白。
废弃上清液 重新溶解的沉淀 乙醇法沉淀 沉淀物Ⅰ＋Ⅲ 废弃沉淀 乙醇法沉淀沉 淀物Ⅱ 重新溶解 的沉淀 IgG(纯度99%)

生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些就是溶 液的各种理化参数。 任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。

沉淀法就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，
控制溶液的各种成分的溶解度，从而将溶液中的
欲提取的成分和其它成分分开的技术。
沉淀法操作步骤 ：
.
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加入硫酸铵固体的量：查表、计算
查表法
查表时 注意温 度
不同量的硫酸铵溶解 时会引起溶液体积的 变化
计算法
20℃
25℃
g ：每升溶液加入固体硫酸铵的质量 S2：所需达到的硫酸铵饱和度 S1：原溶液的硫酸铵饱和度
（2）加入饱和溶液法
适用：蛋白质溶液体 积不大，所需调整的 硫酸铵浓度不高。
饱和硫酸铵的配制方法 在一定量的水中加入
介电常数 多价阴离子具有很高的KS，但高价阳离子的存在反而降低KS ； 大而不规则的蛋白分子KS越大。 几种盐的盐析能力的排列次序： 磷酸钾>硫酸钠>磷酸铵>柠檬酸钠>硫酸镁 KS
几种蛋白盐析时离子强度与溶解度的关系图
1——纤维蛋白 2——血红蛋白 3——拟球蛋白 4——血清蛋白 5——肌红蛋白
例3.1 溶菌酶在2.8 mol/L和 3.0 mol/L 硫酸铵溶 液中的溶解度分别为1.2g/L和0.26g/L，试计算在3.5 mol/L 硫酸铵溶液中的溶解度。
§3.3 蛋白质胶体溶液的稳定性
防止蛋白质凝聚沉淀的屏障：
水化层 电荷
蛋白质周围的 水化层可以使 蛋白质形成稳 定的胶体溶液
蛋白质分子间 静电排斥作用
蛋白质粒子在水溶液中是 带电的，带电的原因主要是吸 附溶液中的离子或自身基团的 电离。
因溶液是电中性的，水 中应有等当量的反离子存在。 蛋白质表面的电荷与溶液中反 离子的电荷构成双电层。