发酵工程制药实验-链霉菌发酵

实验2灰色链霉菌的活化
一、实验目的
学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。

二、实验原理
高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。

三、实验试剂与仪器
1. 菌种：灰色链霉菌；
2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；
3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。

四、实验步骤
1. 高氏一号培养基的制备
（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。

趁热分装于
18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。

（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。

高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。

2. 斜面接种
接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。

为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。

一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。

（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。

（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。

在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。

划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。

注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。

（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。

接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。

（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。

实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备
一、实验目的
学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。

二、实验原理
种子扩大培养简称种子扩培，是发酵工程的一个组成部分，其指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。

其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化，同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。

种子扩培的一般过程是：
斜面菌种→ 一级种子培养（摇瓶）→ 二级种子培养(种子罐) → 发酵
对于种子制备过程，其大致可区分为实验室阶段和生产车间阶段，前期不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此将这一培养过程称为实验室阶段的种子培养。

而后期种子培养在种子罐里面进行，一般在工程上归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。

并非所有的种子扩大培养都采用从摇瓶到种子罐的二级发酵模式，其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。

摇瓶培养技术问世于本世纪30年代，由于其简便、实用，广泛用于微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。

摇瓶培养设备主要有旋转式摇床和往复式摇床两种类型，其中以旋转式最为常用。

振荡培养中所使用的发酵容器通常为三角烧瓶，也有使用特殊类型的烧瓶或试管。

振荡培养技术通常用于微生物菌种的筛选或生产工艺的改良和工艺参数的优化。

在摇瓶培养过程中振荡的目的在于改善活细胞的氧气和营养物的供给。

摇瓶培养通常以特定生长条件下的培养物接种，也可用孢子接种。

振荡培养是建立深层发酵的开始，就一特定微生物而言，振荡培养时存在一最佳培养基配方和最佳培养基容量。

细胞或孢子接种浓度对试验的成功极为重要，不同的微生物细胞或孢子以及不同的振荡培养过程的接种浓度差异可能是十分显著的，且各自存在一最适浓度。

三、实验试剂与仪器
1. 菌种：灰色链霉菌（由实验二活化得到）；
2. 培养基：豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g，硫酸铵3g，硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾0.2g，碳酸钙4g，自来水1000mL、pH7.2-7.4。

3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、250mL三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。

四、实验步骤
1. 摇瓶种子培养基的制备
取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30-50ml，用棉塞包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在0.1MPa下灭菌45-60min。

2. 接种
将活化的菌种斜面，在无菌的条件下，注入10mL无菌水，震荡成孢子悬浮液（孢子浓度约为8×104个/mL）。

待发酵培养基灭菌后冷却到28℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2mL，标好记号。

3. 培养与观察
28℃、200r/min旋转式摇床培养24h，观察菌丝体形态及浓度。

实验4 灰色链霉菌摇瓶发酵
一、实验目的
学习和掌握摇瓶发酵培养的原理和方法。

二、实验原理
链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素，属于氨基糖甙碱性化合物，它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合，起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用，从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。

链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族中的主要成员，由链霉胍、链霉糖和N－甲基-L-葡萄糖胺构成的糖苷，其结构式如下。

链霉素中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后，就成为双氢链霉素，它的抗菌效能和链霉素大致相同，目前临床上使用的是链霉素或双氢链霉素的硫酸盐。

生产过程分为两大步骤：①发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接种到斜面培养基上，于27℃下培养7天。

待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。

②提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱，收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。

洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到精制液。

精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产品，或者将浓缩液直接做成水针剂。

三、实验试剂与仪器
1. 菌种：灰色链霉菌摇瓶种子（由实验三获得）
2. 摇瓶发酵生产培养基：水解糖160g、尿素5g（单独灭菌）、MgSO40.5g、Na2HPO41.6g、
玉米浆25~35g、FeSO4和MnSO4各20mg/L，消泡剂0.3g，，水1000mL，pH7.2。

3. 仪器：500m1三角烧瓶、旋转式摇床等。

四、实验步骤
1. 摇瓶发酵培养基的制备
取干净三角烧瓶，250ml三角瓶分装培养基30ml，用8层纱布包扎瓶口，再加牛皮纸包扎，在115℃下灭菌20min。

2. 接种
待发酵培养基灭菌后冷却到30℃时，按接种量8%~10%进行接种。

3. 培养与观察
32℃、100r/min旋转式摇床培养36h~40h，发酵过程中，补加灭菌尿素以增加氮源，维持pH值。

五、思考题
1. 观察菌丝形态，用试纸测发酵液的pH值，并补加灭菌尿素。

2. 试举例说明摇瓶培养技术的应用。

实验5 灰色链霉菌发酵产物活性测定
一、实验目的
学习和掌握抗生素抑菌性能的测定方法。

二、实验原理
抗生素是一种生理活性物质，它对生命现象很敏感，可以用抗生素的生物效能表示它的效价，其最小效价单元就叫做“单位”(U)。

经由国际协商规定出来的标准单位，称为“国际单位”(IU)。

通常各种抗生素的单位，是根据国家抗生素标准品测定出来的，是衡量药物有效成份的一种尺度。

抗生素的剂量常用重量和效价来表示。

化学合成和半合成的抗菌药物都以重量表示，生物合成的抗生素以效价表示，并同时注明与效价相对应的重量。

效价是以抗菌效能(活性部分)作为衡量的标准，因此，效价的高低是衡量抗生素质量的相对标准。

理论效价是指抗生素纯品的重量与效价单位的折算比率。

一些合成、半合成的抗生素多以其有效部分的一定重量（多为1μg）作为一个单位，如链霉素、土霉素、红霉素等均以纯游离碱1μg作为一个单位。

少数抗生素则以其某一特定的盐的1μg或一定重量作为一个单位。

如链霉素碱为1000单位/mg，链霉素硫酸盐为798单位/mg，金霉素和四环素均以其盐酸盐纯品1μg为1单位，青霉素则以国际标准品青霉素G钠盐0.6μg为1单位。

抗生素的效价常采用微生物学方法测定，它是利用抗生素对特定的微生物具有抗菌活性的原理来测定抗生素效价的方法，如管碟法（cylinder plate method）。

管碟法是根据抗生素在琼脂平板培养基中的扩散渗透作用，比较标准品和检品两者对试验菌的抑菌圈大小来测定供试品的效价。

管碟法的基本原理是在含有高度敏感性试验菌的琼脂平板上放置小钢管（内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm），管内放人标准品和检品的溶液，经16~18小时恒温培养，抗生素扩散的有效范围内则产生透明的无菌生长的区域，常呈圆形，称为抑菌圈。

抑菌圈直径大小与抗生素浓度相关，比较抗生素标准品与检品的抑菌圈大小，可计算出抗生素的效价。

抗生素效价常采用二剂量法。

将抗生素标准品和供试品各稀释成一定浓度比例（2:1或4:1）的两种溶液，在同一平板上比较其抗药活性，再根据抗生素浓度对数和抑菌圈直径成直线关系的原理来计算供试品效价。

取含菌层的双层平板培养基，每个平板表面放置4个小钢管，管内分别放入检品高、低剂量和标准品高、低剂量溶液。

本法的优点是灵敏度高，需用量小，测定结果较直观，测定原理与临床应用的要求一致，更能确定抗生素的医疗价值；而且使用范围广，较纯的精制品、纯度较差的制品、已知的或新发现的抗生素均能应用；对同一类型的抗生素不需分离，可一次测定其总效价，是抗生素药物效价测定的最基本方法。

三、实验试剂与仪器
1. 测定用指示菌：枯草芽孢杆菌[CCMCC(B) 63 501]
2. 仪器：分光光度计、离心机、培养箱、水浴锅、高压蒸汽灭菌锅、牛津小杯（不锈钢小管，内径6.0±0.lmm，外径8.0±0.lmm，高10±0.lmm）、培养皿等。

3. 培养基
（1）传代用培养基（用于枯草芽孢杆菌菌传代和保藏）：蛋白胨10g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0 g，琼脂18g，蒸馏水1000mL，pH7.2-7.5。

（2）生物测定用培养基（培养基I）
蛋白胨5g，牛肉浸出粉3g，琼脂15~20g，磷酸氢二钾3g ，蒸馏水1000mL，除琼脂外，混合上述成分，调节PH值使比最终的pH值略高0. 2-0.4，加人琼脂，加热溶化后滤过，调节pH值使灭菌后为7. 8〜8. 0，在115℃，灭菌30分钟。

4. 试剂
（1）标准链霉素（标准品理论计算值为798.3u/mg）：0.6~1.6单位/mL
（2）0.85%NaCl溶液（生理盐水）100mL。

（3）1%pH7.8磷酸缓冲液：取磷酸氢二钾5.59g与磷酸二氢钾0.41g，加水使溶解成1000ml，即得。

四、实验步骤
1枯草芽孢杆菌菌悬液的制备
将枯草芽孢杆菌接种于营养琼脂培养基斜面，在35~37℃培养7天，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上。

用无菌水将芽孢洗下，在65℃加热30分钟，备用。

2 上层培养基的准备
将已灭菌的生物测定用培养基100mL，融化后放入50℃恒温水浴中，待温度平衡后，加入枯草芽孢杆菌菌悬液5mL，充分摇匀，备用。

3 平板的制作
取灭菌培养皿，每皿用大口移液管吸入50℃左右的测定培养基20mL，水平放置，待凝固后用大口移液管吸入上层培养基5mL，将培养皿来回倾侧（要迅速），使含菌上层培养基均匀分布，凝固后备用，双碟不得少于4个。

4 放置小钢管
放置小钢管时，注意管与管之间不能太靠近，否则会引起相邻的两个抑菌圈之间的抗生素扩散区中的浓度增大，相互影响形成卵圆形或椭圆形抑菌圈。

管与双碟边缘同样也不能太靠近，因为液面浸润作用，边缘的琼脂培养基菌层为非平面，会影响抑菌圈的形状。

可在试验前在双碟的底上用尺测量，作好标记，试验中可以按照双碟底面标记放置小钢管，避免放置位置不恰当产生的问题。

小钢管放置时，要小心地从同一高度垂直放在菌层培养基上，不得下陷，不得倾斜，不能用悬空往下掉的方法。

放置之后，不能随意移动，要静置5min，使之在琼脂内稍下沉降稳定后，再开始滴加抗生素溶液。

5 滴加抗生素溶液
滴加抗生素要按照SH→TH→SL→TL（二剂量法，S代表标准品，T代表供试品，H代表高浓度，L代表低浓度）的顺序滴加，在一双碟对角的2个不锈钢小管中分别滴装高浓度及低浓度的标准品溶液，其余2个小管中滴装相应的高低两种浓度的供试品溶液；高低浓度的剂距为2:1或4:1。

液面应该与小钢管管口齐平，液面反光呈黑色。

（抗生素液体加入量不能按滴计算，即使同一滴管，每滴的量也有差异。

）如果抗生素溶液滴加过满，可以用无菌滤纸片小心吸去多余部分。

6 双碟中菌株的培养
滴加了抗生素溶液后的双碟忌震动，要轻拿轻放。

在搬运到培养箱的过程中，可以预先在培养箱中垫上报纸铺平，再把双碟连同垫于桌上的玻璃板小心运至培养箱，缓慢推入箱内。

双碟在35℃~37℃下培养约14~16h。

时间太短会造成抑菌圈模糊，太长则会使菌株对抗生素的敏感性下降，在抑菌圈边缘的菌继续生长，使得抑菌圈变小。

在培养过程中，如果温度不均匀（过于接近热源），会造成同一双碟上细菌生长速率不等，使抑菌圈变小或者不圆。

所以把双碟放入培养箱时，要与箱壁保持一定的距离，双碟叠放也不能超过3个。

培养中，箱门不得随意开启，以免影响温度。

应经常注意温度，防止意外过冷过热。

7 抑菌圈测量
7.1 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。

批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。

如若菌株不纯，也会造成这样的结果。

因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。

7.2 用游标卡尺测量抑菌圈直径，可以在双碟底部垫一张黑纸，在灯光下测量。

不宜取去小钢管再测量，因为小钢管中残余的抗生素溶液会流出扩散，使抑菌圈变得模糊。

不能把双碟翻转过来测量抑菌圈直径，因为底面玻璃折射会影响抑菌圈测量的准确度。

记录测量结果后进行效价计算。

五、思考题
1．为什么抗生素发酵常产用孢子接种？
2. 抗生素发酵与酒精发酵相比，在细胞生长和发酵动力学、发酵技术以及发酵过程等方面有何异同？。