豆豉纤溶酶_一种潜在的新型溶栓药物
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Ｆｕｌｌｅｒｅｎｅｓ １０ （ａｎｄ ５） Ｙｅａｒｓ Ｌａｔｅｒ， Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ， １９９６， ２９５—３２８ ［ ７ ］ Ｂｏｓｉ Ｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔｔ， ２０００， １０： １０４３—１０４５ ［ ８ ］ Ｔｓａｏ Ｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ２００２， ４９： ６４１—６４９ ［ ９ ］ Ｔｓａｏ Ｎ ｅｔ ａｌ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ， ２００１， ４５： １７８８— １７９３ ［１０］ Ｈｕａｎｇ ＹＬ ｅｔ ａｌ． Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９９８， ２５４： ３８—４３ ［１１］ Ｈｉｇａｓｈｉ Ｎ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ， １９９７， １５０７—１５０８ ［１２］ Ｑｉｎｇｎｕａｎ Ｌ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ， ２００２， ２９： ７０７—７１０
李 江 伟 等 ［８］ 首 次 通 过 一 系 列 分 离 纯 化 过 程 ， 得到豆豉纤溶酶纯酶并对其体外溶栓作用作了初 步研究。该酶相对分子量为 ３６０００， 可直接溶解纤 维蛋白， 对发色底物 Ｓ－ ２２５１ 的水解活性与牛纤溶 酶相当， 并能溶解天然人血凝块。河南绿十字生 物 工 程 研 究 所 的 阎 家 麟 等 ［９］ 从 豆 豉 中 筛 选 出 一 株 产纤溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌； 经过分离纯 化得到该酶相对分子量为 ３１０００， 等电点 ８．６±０．２， 且在 ４０ ℃下， ｐＨ ７～１１ 范围内稳定性良好， 通过 使用各剂量组给小鼠灌胃均无明显毒性表现。中 国科学院韩润林等［１０］ 从一种豆豉中分离得到一株 枯草杆菌 （ ＨＬ－ ９８６） ， 有较高的纤溶酶活性， 对其 发酵上清液进行分离纯化， 该 酶 在 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 上 为单一谱带， 其相对分子量约为 ２７ ｋＤ。四川大学 彭 勇 等 ［１１］ 从 豆 豉 中 筛 选 出 一 株 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） ＤＣ－ ４， 所 产 生 的 纤 溶 酶能高效地溶解体外血栓， 并且不水解血细胞； 通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、疏水层析 和 凝 胶 过 滤 等 方 法 ， 得 到 电 泳 纯 的 纤 溶 酶 （ ＢＡ－ ＤＦＥ） ； 对其性质研究结果表明， ＢＡ－ ＤＦＥ 是 单 链 蛋白质， 相对分子量 ２８ ｋＤ， 等电点 ８．０， 最 适 反 应温度 ４８ ℃， 最适反应 ｐＨ ９．０， 具有较好的热稳 定性和 ｐＨ 稳定性。ＢＡ－ ＤＦＥ 属 于 丝 氨 酸 蛋 白 酶 ， 其 最 适 底 物 是 Ｓｕｃ－ Ａｌａ－ Ａｌａ－ Ｐｒｏ－ Ｐｈｅ－ ｐＮＡ。 ＢＡ－ ＤＦＥ 能直接降解纤维蛋白， 不 能 激 活 纤 溶 酶 原 形
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２．４ 其 他 生 物 学 活 性 富 勒 烯 的 衍 生 物 可 以 抑 制 细 胞 凋 亡 。Ｈｕａｎｇ 等［１０］ 实 验 证 明 ， 羧 酸 富 勒 烯 的两种同分异构体通过中和 ＴＧＦ－ β诱导的氧自由 基抑制肝肿瘤细胞 Ｈｅｐ３Ｂ 凋亡。羧酸富勒烯可以 抑制对表皮细胞生长底物剥夺所致的失巢凋亡。
成纤溶酶； 蛋白质测序结果显示， 该酶 Ｎ 端 ２４ 个 氨 基 酸 序 列 为 ＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＦＴＧＳ。 进一步研究表明， 该纤溶酶的理化性质和生物学 功能与纳豆激酶相似， 但是同源性分析表明， 其 基因和蛋白质序列与日本纳豆激酶相应序列分别 仅有 ８０．０％和 ８６．５％的同源性， 表明该酶可能是一 种新型的溶栓酶。 ３． 豆豉纤溶酶的分子生物学研究
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《生命的化学》２００５ 年 ２５ 卷 ５ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００５， ２５（５）
●Ｃｕｒｒｅ ｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ
南 京 农 业 大 学 的 董 明 盛 等［２］ 从 豆 豉 中 分 离 到 产纤溶酶的枯草芽孢杆菌， 测得其发酵液的纤溶 酶活性达到 ６８３．３ ＩＵ／ｍＬ。江南大学齐海萍等［３］ 从 １２ 个 不 同 产 地 的 豆 豉 中 筛 选 出 产 纤 溶 酶 活 为 １２３０～１２５６ ＩＵ／ｍＬ 的 菌 株 ， 经 鉴 定 初 步 推 断 属 芽 孢 杆 菌 属 。湖 北 工 学 院 向 梅 等［４］ 从 豆 豉 中 筛 选 到 一 株 枯 草 芽 孢 杆 菌 ＨＧＤ１０７， 吴 思 方 等 ［５］ 对 该 菌 种 进 行 发 酵 条 件 优 化 ， 其 纤 溶 酶 活 可 达 到 ３６４３ ＩＵ／ｍＬ。 本 文 作 者 所 在 实 验 室 ， 从 广 泛 收 集 的 豆 豉成品及半成品中分离到一株产纤溶酶的枯草芽 孢杆菌， 经发酵条件优化后其纤溶酶活性可达到 ２３００ ＩＵ／ｍＬ。四 川 大 学 彭 勇 等［６］ 从 豆 豉 首 次 筛 选 出 一 株 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ－ ｃｉｅｎｓ） ＤＣ－ ４， 经过发酵条件的优化该菌产生的纤 溶 活 性 可 达 到 ８２０ ＩＵ／ｍＬ。 张 勇 等 ［７］ 对 已 经 过 紫 外线诱变和亚硝基胍复合诱变的产纤溶酶菌株采 用离子注入诱变， 最高产量可提高 ５１．１３％， 并且 诱变菌株对温度的耐受性有所增强。 ２． 豆豉纤溶酶的分离纯化及酶学性质
— — — — — — — — — — — 收稿日期 ： ２００５－ ０６－ １４ 作 者 简 介 ： 范 晓 丹 （１９８０—）， 女 ， 博 士 ， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｘｉａｏｄａｎｆ
＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ； 郭 勇 （１９４２—）， 男 ， 教 授 ， 博 士 生 导 师 ， 联 系 作 者， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｆｅｙｇｕｏ＠ｓｃｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
彭勇等［１２］ 在以上研究的基础上， 首 先 对 豆 豉 纤溶酶进行分子生物学方面的研究。他 们 将 ＢＡ－ ＤＦＥ 成熟肽编码区序列克隆于 原 核 生 物 表 达 载 体 ｐＥＴ－ １５ｂ 的 ＮｄｅＩ 和 ＢａｍＨＩ 切 点 中 ， 构 建 了 表 达 载 体 质 粒 ｐＥＴ－ ＢＡＤＦＥ１ 进 行 融 合 表 达 。 将 ＢＡ－ ＤＦＥ 成 熟 肽 编 码 区 序 列 克 隆 于 ｐＥＴ－ １５ｂ 的 ＮｃｏＩ 和 ＢａｍＨＩ 切点中， 构建了表达质粒 ｐＥＴ－ ＢＡＤＦＥ２ 进 行 非 融 合 表 达 。 当 ＩＰＴＧ 诱 导 时 均 能 大 量 表 达 ＢＡ－ ＤＦＥ 蛋 白 ， 且 两 者 的 表 达 量 都 高 达 菌 体 可 溶 性 蛋 白 质 的 ４０％ 左 右 ， 主 要 以 包 含 体 的 形 式 存 在， 但是没有检测到纤溶活性。根据上述研究结 果， 他们设计了一对新的引物， 通过 ＰＣＲ 方法从 该菌总 ＤＮＡ 中扩增出编码成熟肽基因， 将其克隆 到 大 肠 杆 菌— ——枯 草 杆 菌 穿 梭 载 体 ｐＳＵＧＶ４ 中 ， 构 建 了 重 组 质 粒 ｐＳＵＧＶ－ ＢＡＤＦＥ， 然 后 转 化 枯 草 杆菌 ＷＢ６００ 中进行了分泌表达研究， 获得了一株 高 效 分 泌 表 达 豆 豉 溶 栓 酶 的 基 因 工 程 菌 株 ＷＢ－ ＤＦＥ５。 此 外 ， 彭 勇 等 ［１３］ 还 从 豆 豉 中 分 离 的 具 有 较 强 纤 溶 活 性 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 ＤＣ－ ２ 中 提 取 纤 溶 酶基因， 并转入大肠杆菌 ＪＭ１０９ 中表 达 ， 表 达 产 物 主 要 形 成 包 含 体 。 肖 璐 等 ［１４］ 对 工 程 菌 株 ＷＢ－ ＤＦＥ５ 产酶的发酵条件及 ｒＤＦＥ 的分离纯化进行 了 研究。确定了该菌发酵的优化条件为： ２％可溶性 淀 粉 、２％酪 蛋 白 、０．５％大 豆 蛋 白 胨 、０．１５％酵 母 粉 、 ０．２５％ Ｋ２ＨＰＯ４、 ０．０５％ ＫＨ２ＰＯ４、 ０．０２％ ＣａＣｌ２、 ０．０５％ＭｇＳＯ４， ｐＨ ７．０。 通 过 硫 酸 铵 分 段 盐 析 、 离 子交换和凝胶过滤， 从 １Ｌ 工程菌株 ＷＢ－ ＤＦＥ５ 的 发 酵 液 中 分 离 纯 化 出 １２．５ ｍｇ 重 组 豆 豉 溶 栓 酶 ， 酶比活为 ５９１７．７ ＩＵ／ｍｇ。 ４． 纤溶活性的测定方法
●知识介绍
文章编号： １０００－ １３３６（２００５）０５－ ０４２７－ ０３
《生命的化学》２００５ 年 ２５ 卷 ５ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００５， ２５（５）
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豆豉纤溶酶— ——一种潜在的新型溶栓药物
范晓丹 郭 勇
（ 华 南 理 工 大 学 生 物 科 学 与 工 程 学 院 ， 广 州 ５１０６４０ ）
血栓栓塞疾病是当前危害人类健康， 导致死 亡率最高的疾病之一， 如心肌梗塞、脑栓塞、肺 栓塞等。目前治疗血栓栓塞疾病的最为有效并且 可靠的手段是溶栓疗法。因此， 世界各国都力 于溶栓药物的研究开发。
从传统大豆发酵食品中分离提取纤溶酶， 是 近 年 来 溶 血 栓 药 物 研 究 的 新 方 向 之 一 。 自 １９８７ 年 ， 日 本 的 须 见 洋 行 等［１］ 首 先 从 日 本 纳 豆 食 品 中 分离到一种具有强烈纤溶活性的酶， 即纳豆激
摘要： 豆豉纤溶酶是一种潜在的新型溶栓药物。该文介绍豆豉纤溶酶产生菌的筛选、诱变； 纤溶酶的分离纯化、 酶学性质及其分子生物学的研究等； 并简述了纤溶酶活性的测定方法； 提出了豆豉纤溶酶的研究方向及前景。 关键词： 豆豉纤溶酶； 诱变； 酶学性质； 分子生物学； 纤溶活性 中 图 分 类 号 ： Ｑ８１４
酶。随后人们从不同国家和地区的传统食品中又 陆续发现了微生物的纤溶酶， 如韩国传统食品 Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋ－ Ｊａｎｇ 中的纤溶酶 ＣＫ 和 Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＤＪ－ ４。 我国研究人员从纳豆激酶研究得到启发， 也开始 把目光投向传统的大豆发酵食品。除了从台湾大 豆发酵食品中发现的纤溶酶外， 经研究发现， 在 豆豉、酱油等传统大豆发酵食品和调味品中， 同 样也可以分离出高纤溶活性的酶， 其中分离自豆 豉的纤溶酶具有很高的活性。豆豉纤溶酶不仅血 栓溶解能力强， 而且无毒副作用， 不引起内出 血， 在体内半寿期长， 是从传统食品中发现的新 型纤溶酶， 具有十分重要的开发价值。 １． 菌种的筛选及诱变
的开发提供了崭新的思路。另外富勒稀衍生物还 可以用于造影剂的研究， 金属富勒烯的合成使富 勒烯作为一种新的放射示踪剂成为可能。
参考文献
研究表明， 富勒烯衍生物抑制凋亡与其清除自由 显著相关。在紫外光或者可见光照射下， 富勒烯 衍生物产生切割 ＤＮＡ 的活性也是一个重要生物学 效应。通过合成特异性富勒烯寡核苷酸衍生物， 从而序列特异性地切割 ＤＮＡ， 给基因组研究提供 了 广 阔 的 应 用 前 景［１１］。 富 勒 烯 衍 生 物 还 具 有 抑 制 半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的活性。富勒烯 的这种活性可能与其特殊的疏水性、亲电性以及 高还原电位有关， 但是其机制尚未研究清楚。由 于富勒烯复合物具有组织选择性， 而且其毒性较 小， 当其注入血流中， 可以迅速分布到各种组 织 ， 而 且 一 周 内 几 乎 检 测 不 到 毒 性 的 存 在［１２］。 利 用富勒烯衍生物作为药物载体为器官靶向性药物
［ １ ］ Ｋｒｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， １９８５， ３１８： １６２—１６３ ［ ２ ］ Ｈｉｒｓｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ， １９９８， ３９： ２７３１—２７３４ ［ ３ ］ Ｊｉｎ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ， ２０００， ６２： ６００—６０７ ［ ４ ］ Ｃｈｉａｎｇ ＹＹ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２０００， ３６： ４２３—４２７ ［ ５ ］ Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＳＨ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １９９３， １１５： ６５０６—６５０９ ［ ６ ］ Ｒｕｂｉｎ Ｙ Ｉｎ： Ａｎｄｒｅｏｎｉ Ｗ （ｅｄ）． Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ
李 江 伟 等 ［８］ 首 次 通 过 一 系 列 分 离 纯 化 过 程 ， 得到豆豉纤溶酶纯酶并对其体外溶栓作用作了初 步研究。该酶相对分子量为 ３６０００， 可直接溶解纤 维蛋白， 对发色底物 Ｓ－ ２２５１ 的水解活性与牛纤溶 酶相当， 并能溶解天然人血凝块。河南绿十字生 物 工 程 研 究 所 的 阎 家 麟 等 ［９］ 从 豆 豉 中 筛 选 出 一 株 产纤溶活性蛋白酶的枯草芽孢杆菌； 经过分离纯 化得到该酶相对分子量为 ３１０００， 等电点 ８．６±０．２， 且在 ４０ ℃下， ｐＨ ７～１１ 范围内稳定性良好， 通过 使用各剂量组给小鼠灌胃均无明显毒性表现。中 国科学院韩润林等［１０］ 从一种豆豉中分离得到一株 枯草杆菌 （ ＨＬ－ ９８６） ， 有较高的纤溶酶活性， 对其 发酵上清液进行分离纯化， 该 酶 在 ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ 上 为单一谱带， 其相对分子量约为 ２７ ｋＤ。四川大学 彭 勇 等 ［１１］ 从 豆 豉 中 筛 选 出 一 株 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ） ＤＣ－ ４， 所 产 生 的 纤 溶 酶能高效地溶解体外血栓， 并且不水解血细胞； 通过硫酸铵分级沉淀、离子交换层析、疏水层析 和 凝 胶 过 滤 等 方 法 ， 得 到 电 泳 纯 的 纤 溶 酶 （ ＢＡ－ ＤＦＥ） ； 对其性质研究结果表明， ＢＡ－ ＤＦＥ 是 单 链 蛋白质， 相对分子量 ２８ ｋＤ， 等电点 ８．０， 最 适 反 应温度 ４８ ℃， 最适反应 ｐＨ ９．０， 具有较好的热稳 定性和 ｐＨ 稳定性。ＢＡ－ ＤＦＥ 属 于 丝 氨 酸 蛋 白 酶 ， 其 最 适 底 物 是 Ｓｕｃ－ Ａｌａ－ Ａｌａ－ Ｐｒｏ－ Ｐｈｅ－ ｐＮＡ。 ＢＡ－ ＤＦＥ 能直接降解纤维蛋白， 不 能 激 活 纤 溶 酶 原 形
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２．４ 其 他 生 物 学 活 性 富 勒 烯 的 衍 生 物 可 以 抑 制 细 胞 凋 亡 。Ｈｕａｎｇ 等［１０］ 实 验 证 明 ， 羧 酸 富 勒 烯 的两种同分异构体通过中和 ＴＧＦ－ β诱导的氧自由 基抑制肝肿瘤细胞 Ｈｅｐ３Ｂ 凋亡。羧酸富勒烯可以 抑制对表皮细胞生长底物剥夺所致的失巢凋亡。
成纤溶酶； 蛋白质测序结果显示， 该酶 Ｎ 端 ２４ 个 氨 基 酸 序 列 为 ＡＱＳＶＰＹＧＶＳＱＩＫＡＰＡＬＨＳＱＧＦＴＧＳ。 进一步研究表明， 该纤溶酶的理化性质和生物学 功能与纳豆激酶相似， 但是同源性分析表明， 其 基因和蛋白质序列与日本纳豆激酶相应序列分别 仅有 ８０．０％和 ８６．５％的同源性， 表明该酶可能是一 种新型的溶栓酶。 ３． 豆豉纤溶酶的分子生物学研究
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《生命的化学》２００５ 年 ２５ 卷 ５ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００５， ２５（５）
●Ｃｕｒｒｅ ｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ
南 京 农 业 大 学 的 董 明 盛 等［２］ 从 豆 豉 中 分 离 到 产纤溶酶的枯草芽孢杆菌， 测得其发酵液的纤溶 酶活性达到 ６８３．３ ＩＵ／ｍＬ。江南大学齐海萍等［３］ 从 １２ 个 不 同 产 地 的 豆 豉 中 筛 选 出 产 纤 溶 酶 活 为 １２３０～１２５６ ＩＵ／ｍＬ 的 菌 株 ， 经 鉴 定 初 步 推 断 属 芽 孢 杆 菌 属 。湖 北 工 学 院 向 梅 等［４］ 从 豆 豉 中 筛 选 到 一 株 枯 草 芽 孢 杆 菌 ＨＧＤ１０７， 吴 思 方 等 ［５］ 对 该 菌 种 进 行 发 酵 条 件 优 化 ， 其 纤 溶 酶 活 可 达 到 ３６４３ ＩＵ／ｍＬ。 本 文 作 者 所 在 实 验 室 ， 从 广 泛 收 集 的 豆 豉成品及半成品中分离到一株产纤溶酶的枯草芽 孢杆菌， 经发酵条件优化后其纤溶酶活性可达到 ２３００ ＩＵ／ｍＬ。四 川 大 学 彭 勇 等［６］ 从 豆 豉 首 次 筛 选 出 一 株 解 淀 粉 芽 孢 杆 菌 （ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａ－ ｃｉｅｎｓ） ＤＣ－ ４， 经过发酵条件的优化该菌产生的纤 溶 活 性 可 达 到 ８２０ ＩＵ／ｍＬ。 张 勇 等 ［７］ 对 已 经 过 紫 外线诱变和亚硝基胍复合诱变的产纤溶酶菌株采 用离子注入诱变， 最高产量可提高 ５１．１３％， 并且 诱变菌株对温度的耐受性有所增强。 ２． 豆豉纤溶酶的分离纯化及酶学性质
— — — — — — — — — — — 收稿日期 ： ２００５－ ０６－ １４ 作 者 简 介 ： 范 晓 丹 （１９８０—）， 女 ， 博 士 ， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｘｉａｏｄａｎｆ
＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ； 郭 勇 （１９４２—）， 男 ， 教 授 ， 博 士 生 导 师 ， 联 系 作 者， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｆｅｙｇｕｏ＠ｓｃｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
彭勇等［１２］ 在以上研究的基础上， 首 先 对 豆 豉 纤溶酶进行分子生物学方面的研究。他 们 将 ＢＡ－ ＤＦＥ 成熟肽编码区序列克隆于 原 核 生 物 表 达 载 体 ｐＥＴ－ １５ｂ 的 ＮｄｅＩ 和 ＢａｍＨＩ 切 点 中 ， 构 建 了 表 达 载 体 质 粒 ｐＥＴ－ ＢＡＤＦＥ１ 进 行 融 合 表 达 。 将 ＢＡ－ ＤＦＥ 成 熟 肽 编 码 区 序 列 克 隆 于 ｐＥＴ－ １５ｂ 的 ＮｃｏＩ 和 ＢａｍＨＩ 切点中， 构建了表达质粒 ｐＥＴ－ ＢＡＤＦＥ２ 进 行 非 融 合 表 达 。 当 ＩＰＴＧ 诱 导 时 均 能 大 量 表 达 ＢＡ－ ＤＦＥ 蛋 白 ， 且 两 者 的 表 达 量 都 高 达 菌 体 可 溶 性 蛋 白 质 的 ４０％ 左 右 ， 主 要 以 包 含 体 的 形 式 存 在， 但是没有检测到纤溶活性。根据上述研究结 果， 他们设计了一对新的引物， 通过 ＰＣＲ 方法从 该菌总 ＤＮＡ 中扩增出编码成熟肽基因， 将其克隆 到 大 肠 杆 菌— ——枯 草 杆 菌 穿 梭 载 体 ｐＳＵＧＶ４ 中 ， 构 建 了 重 组 质 粒 ｐＳＵＧＶ－ ＢＡＤＦＥ， 然 后 转 化 枯 草 杆菌 ＷＢ６００ 中进行了分泌表达研究， 获得了一株 高 效 分 泌 表 达 豆 豉 溶 栓 酶 的 基 因 工 程 菌 株 ＷＢ－ ＤＦＥ５。 此 外 ， 彭 勇 等 ［１３］ 还 从 豆 豉 中 分 离 的 具 有 较 强 纤 溶 活 性 的 枯 草 芽 孢 杆 菌 ＤＣ－ ２ 中 提 取 纤 溶 酶基因， 并转入大肠杆菌 ＪＭ１０９ 中表 达 ， 表 达 产 物 主 要 形 成 包 含 体 。 肖 璐 等 ［１４］ 对 工 程 菌 株 ＷＢ－ ＤＦＥ５ 产酶的发酵条件及 ｒＤＦＥ 的分离纯化进行 了 研究。确定了该菌发酵的优化条件为： ２％可溶性 淀 粉 、２％酪 蛋 白 、０．５％大 豆 蛋 白 胨 、０．１５％酵 母 粉 、 ０．２５％ Ｋ２ＨＰＯ４、 ０．０５％ ＫＨ２ＰＯ４、 ０．０２％ ＣａＣｌ２、 ０．０５％ＭｇＳＯ４， ｐＨ ７．０。 通 过 硫 酸 铵 分 段 盐 析 、 离 子交换和凝胶过滤， 从 １Ｌ 工程菌株 ＷＢ－ ＤＦＥ５ 的 发 酵 液 中 分 离 纯 化 出 １２．５ ｍｇ 重 组 豆 豉 溶 栓 酶 ， 酶比活为 ５９１７．７ ＩＵ／ｍｇ。 ４． 纤溶活性的测定方法
●知识介绍
文章编号： １０００－ １３３６（２００５）０５－ ０４２７－ ０３
《生命的化学》２００５ 年 ２５ 卷 ５ 期 ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ ＯＦ ＬＩＦＥ ２００５， ２５（５）
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豆豉纤溶酶— ——一种潜在的新型溶栓药物
范晓丹 郭 勇
（ 华 南 理 工 大 学 生 物 科 学 与 工 程 学 院 ， 广 州 ５１０６４０ ）
血栓栓塞疾病是当前危害人类健康， 导致死 亡率最高的疾病之一， 如心肌梗塞、脑栓塞、肺 栓塞等。目前治疗血栓栓塞疾病的最为有效并且 可靠的手段是溶栓疗法。因此， 世界各国都力 于溶栓药物的研究开发。
从传统大豆发酵食品中分离提取纤溶酶， 是 近 年 来 溶 血 栓 药 物 研 究 的 新 方 向 之 一 。 自 １９８７ 年 ， 日 本 的 须 见 洋 行 等［１］ 首 先 从 日 本 纳 豆 食 品 中 分离到一种具有强烈纤溶活性的酶， 即纳豆激
摘要： 豆豉纤溶酶是一种潜在的新型溶栓药物。该文介绍豆豉纤溶酶产生菌的筛选、诱变； 纤溶酶的分离纯化、 酶学性质及其分子生物学的研究等； 并简述了纤溶酶活性的测定方法； 提出了豆豉纤溶酶的研究方向及前景。 关键词： 豆豉纤溶酶； 诱变； 酶学性质； 分子生物学； 纤溶活性 中 图 分 类 号 ： Ｑ８１４
酶。随后人们从不同国家和地区的传统食品中又 陆续发现了微生物的纤溶酶， 如韩国传统食品 Ｃｈｕｎｇｋｏｏｋ－ Ｊａｎｇ 中的纤溶酶 ＣＫ 和 Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＤＪ－ ４。 我国研究人员从纳豆激酶研究得到启发， 也开始 把目光投向传统的大豆发酵食品。除了从台湾大 豆发酵食品中发现的纤溶酶外， 经研究发现， 在 豆豉、酱油等传统大豆发酵食品和调味品中， 同 样也可以分离出高纤溶活性的酶， 其中分离自豆 豉的纤溶酶具有很高的活性。豆豉纤溶酶不仅血 栓溶解能力强， 而且无毒副作用， 不引起内出 血， 在体内半寿期长， 是从传统食品中发现的新 型纤溶酶， 具有十分重要的开发价值。 １． 菌种的筛选及诱变
的开发提供了崭新的思路。另外富勒稀衍生物还 可以用于造影剂的研究， 金属富勒烯的合成使富 勒烯作为一种新的放射示踪剂成为可能。
参考文献
研究表明， 富勒烯衍生物抑制凋亡与其清除自由 显著相关。在紫外光或者可见光照射下， 富勒烯 衍生物产生切割 ＤＮＡ 的活性也是一个重要生物学 效应。通过合成特异性富勒烯寡核苷酸衍生物， 从而序列特异性地切割 ＤＮＡ， 给基因组研究提供 了 广 阔 的 应 用 前 景［１１］。 富 勒 烯 衍 生 物 还 具 有 抑 制 半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶的活性。富勒烯 的这种活性可能与其特殊的疏水性、亲电性以及 高还原电位有关， 但是其机制尚未研究清楚。由 于富勒烯复合物具有组织选择性， 而且其毒性较 小， 当其注入血流中， 可以迅速分布到各种组 织 ， 而 且 一 周 内 几 乎 检 测 不 到 毒 性 的 存 在［１２］。 利 用富勒烯衍生物作为药物载体为器官靶向性药物
［ １ ］ Ｋｒｏｔｏ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ， １９８５， ３１８： １６２—１６３ ［ ２ ］ Ｈｉｒｓｃｈ Ａ ｅｔ ａｌ． Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ， １９９８， ３９： ２７３１—２７３４ ［ ３ ］ Ｊｉｎ Ｈ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ， ２０００， ６２： ６００—６０７ ［ ４ ］ Ｃｈｉａｎｇ ＹＹ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ， ２０００， ３６： ４２３—４２７ ［ ５ ］ Ｆｒｉｅｄｍａｎ ＳＨ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， １９９３， １１５： ６５０６—６５０９ ［ ６ ］ Ｒｕｂｉｎ Ｙ Ｉｎ： Ａｎｄｒｅｏｎｉ Ｗ （ｅｄ）． Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ