利用PCR反应进行人类性别鉴定

（二）、加样及PCR扩增
1.PCR反应体系：总体积20 ul PCR反应液 15 ul DNA模板 5ul
2.设置对照：
空白对照 阴性对照 阳性对变性：94℃ 30s, 退火：55℃ 30s, 聚合：72℃ 60s 72℃ 5min 重复35 cycles
延伸温度与时间
一般为72℃。这个温度即考虑了Taq DNA聚合酶的 活性，又考虑到引物和靶基因的结合。
循环数
循环数决定着扩增的产量。在其它参数都已优化条 件下，最适循环数取决于靶序列初始浓度。
三、利用PCR反应进行性别鉴定 原理
DYZ1位于Y染色体长臂的Ⅲ号卫星 区域内，具有3.4kb的重复序列，拷贝数 约5000，其特异序列的PCR扩增可用于
二、PCR反应的原理
聚合酶链反应（polymerase chain reaction， 简称PCR）是一种在体外特异扩增位于两段已知 序列之间DNA区段的核酸合成技术，是分子生物 学研究领域的一项创举。该技术是由美国Cetus公 司和加利福利亚大学1985年联合发明的，主要贡 献者为Mullis和Henery、Erlich。 利用PCR可将极微量的靶DNA特异地扩增上百 万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能 力。由于PCR具有敏感性高、特异性强、快速、 简便等优点，因此在分子生物学、微生物学、医 学及遗传学、法医判定和考古研究等领域得到广 泛应用。
（四）、电泳与结果判断
缓冲液
提供Taq DNA聚合酶最适酶促反应条件。 常用的缓冲体系为50 Mm KCl，10 mM TrisHCl (pH8.3,RT) 。 另外还需要一定浓度的Mg2+，一般浓度为 1.5mM。这是Taq DNA聚合酶活性所必需。另外 它还影响着引物的退火、模板与PCR产物的解 链温度、产物的特异性、引物二聚体的形成等。 Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时， 通常会导致非特异性扩增产物的累积。
二pcr反应的原理聚合酶链反应polymerasechainreaction简称pcr是一种在体外特异扩增位于两段已知序列之间dna区段的核酸合成技术是分子生物学研究领域的一项创举
实验八
PCR反应鉴定人类性别
一、 实验目的
•了解有关PCR反应的原理及技术
要点。 •学习应用PCR反应进行性别鉴定的 原理及方法。
的天然酶和大肠杆菌合成的基因工程酶。在
PCR反应中，每100μ l反应液中含1-2.5U Taq DNA聚合酶为佳，酶的浓度太低会使扩增产物 产量降低，如果酶的浓度太高则会出现非特异 性扩增。
温度循环参数
变性温度与时间
通常选用95℃ 30s。
复性温度与时间
复性温度决定着PCR的特异性。温度越低复性越好， 但是容易出现错配，温度太高不利于复性，通常为 55℃左右。
PCR主要由反复循环的变性、退火和延伸三个步
骤构成：即在高温（95℃）下，使靶DNA双链受
热变性成为两条单链；而后在低温（37～55℃）
下，两条寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结
合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）
下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为
原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新
链。这样，经过一次循环目的DNA产物增加1倍。 如此反复进行，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩 增。
PCR基本原理示意图
PCR反应体系的组成
模板
PCR可以DNA或RNA为模板进行核酸的体外 扩增。不过RNA的扩增首先需逆转录成cDNA 后才能进行PCR循环。模板DNA浓度对扩增有 一定影响。
引物
脱氧核苷三磷酸（dNTP） 作为DNA合成的基本原料。dNTP含量太
低，PCR扩增产量太少、易出现假阴性。过
高的dNTP浓度会导致聚合时的错误掺入，
因此应当避免。一般在200μ mol/L浓度下
使用。
耐热DNA聚合酶
目前有两种Taq DNA聚合酶供应：从噬热
水生菌Thermus Aquaticus（Taq）中分离提纯
PCR反应的特异性取决于引物的特异性，扩 增产物的大小也是由引物限定的。 引物长度至少应含有16个核苷酸，最好长达 20-24个核苷酸。这种长度的引物在聚合反应温 度下不会形成稳定二聚体。 PCR反应中引物的终浓度通常为1μ mol/L.当 PCR引物量太低，则产物量降低，会出现假阴性。 引物浓度过高会促进非特异产物合成，还会增加 引物二聚体的形成。
性别鉴定。扩增产物为154bp.
四、实验材料
DNA释放液：含有蛋白酶K PCR反应液：含有特异引物、dNTP混合 液和缓冲液。 Taq酶 液体石蜡 无菌水
五、实验步骤
（一）、模板的制备
1 .冷开水漱口后，用牙签刮取口腔黏膜细 胞。取80ul DNA释放液，牙签插入后， 涡旋片刻。 2. 50℃水浴20分钟。 3. 弃牙签，石蜡油覆盖后离心片刻。94 ℃ 处理10分钟。