辣椒碱载药纳米微球抗脑胶质瘤作用的实验研究

辣椒碱载药纳米微球抗脑胶质瘤作用的实验研究
张岩松;王新法;罗正祥;姜志峰;赵鹏来;李军;丁一
【摘要】Objective To explore the physiochemical characteristics of the capsaicin-loaded nanoparticles prepared by methoxy polyethylene glycol-poly ( caprolactone ) ( mPEG-PCL ) amphilic block copolymer, and to evaluate the ability of the capsaicin-loaded nanoparticles to inhibits the human glioblastoma U251 cells growth.Methods mPEG-PCL amphilic block copolymer was synthesized using the ring-opening polymerization method, and the capsaicin-loaded nanoparticles were prepared with the solvent diffusion method.The uptake of nanoparticles in the glioma cells and its ability to inhibit cell proliferation were tested in human glioblastoma U251 cells.Results In vitro drug release assay revealed that the capsaicin-loaded nanoparticles presented slow-release characteristics.The NIR-797 isothiocyanate-loaded nanoparticles was found to cross the blood-brain barrier.In addition, the capsaicin-loaded nanoparticle showed a remarkable inhibition on the growth of U251 cells.Conclusions The capsaicin-loaded nanoparticles can provide an extremely promising approach for chemotherapy of gliomas.%目的：探讨聚己内脂－聚乙二醇二嵌段共聚物
（ mPEG-PCL）制备的辣椒碱纳米微球的理化性质，通过实验评价其抗胶质瘤效果。

方法通过开环聚合法和溶剂分散法制备负载辣椒碱的纳米微球，应用负载荧光素纳米粒子的肿瘤细胞摄取实验以及辣椒碱纳米微球的细胞毒性实验。

结果实验显示载药微球具有缓释特性，细胞可通过胞吞作用将纳米微球摄入，负载NIR-797纳米微球可以很好地透过血-脑屏障，辣椒碱纳米微球对U251细胞的生长有明显
的抑制作用。

结论 mPEG-PCL为载体的辣椒碱纳米微球能够有效抑制胶质瘤细胞增殖，为脑胶质瘤药物治疗提供了一条极有前途的治疗途径。

【期刊名称】《临床神经外科杂志》
【年(卷),期】2014(000)006
【总页数】6页(P430-434,439)
【关键词】辣椒碱;纳米微球;血-脑屏障;胶质瘤
【作者】张岩松;王新法;罗正祥;姜志峰;赵鹏来;李军;丁一
【作者单位】210029 南京医科大学附属脑科医院神经外科;南京医科大学附属儿童医院神经外科;210029 南京医科大学附属脑科医院神经外科;东南大学附属江阴医院神经外科;210029 南京医科大学附属脑科医院神经外科;210029 南京医科大学附属脑科医院神经外科;南京医科大学附属儿童医院神经外科
【正文语种】中文
【中图分类】R739.41
恶性脑胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，具有浸润性生长和顽固性复发的特点，外科手术难以做到真正的全切除，手术后化疗对于延长患者生存时间具有重要作用［1］。

由于肿瘤产生的抗药性以及血-脑和血-肿瘤屏障的存在，恶性脑胶质瘤的化疗疗效仍不理想［2-3］。

研究发现辣椒碱（Capsaicin）作为天然的肿瘤化学预防剂，对脑胶质瘤也具有较强的抑制作用，但是其生物利用度较低，需要寻找更加适合的给药途径，增加药物的溶解度和稳定性，提高药效并降低毒副作用［4-6］。

本研究探讨聚己内脂-聚乙二醇二嵌段共聚物（mPEG-PCL）制备的辣椒碱纳米微球的理化性质，通过实验评价其抗肿瘤效果，为开发新型抗胶质瘤纳米给药
系统提供实验依据。

1.1 材料ε-已内酯（ε-CL）（Fluka公司，美国）；单甲氧基聚乙二醇（mPEG，分子量4 000）（威尔化工，南京）；辣椒碱、香豆素-6、NIR-797异硫氰酸酯、辛酸亚锡（Sigma公司，美国）；冰醋酸、甲醇（色谱纯，Merck公司，德国）；二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司，美国）；DMEM培养液、胎牛血清、MTT （Hyclone公司，美国）；C57BL小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司；GL261、U251细胞株，购自中国科学院上海细胞生物所。

激光共聚焦显微镜（LSM-710，德国）；动态光散射测定仪（Brookheaven公司，美国）；高效液相色谱仪（Shimadzu公司，日本）；冷冻干燥机（Freezone6型，Labconcon公司，美国）；透射电子显微镜（TEM，JEM-100 S，JEOL公司，日本）；近红外小动物分子成像仪（Cambridge Research＆Instrumentation CRI，美国）；ELX800自动酶标读数仪（BioTek公司，美国）；低温超速离心机（上海）。

1.2 方法
1.2.1 mPEG-PCL二嵌段聚合物的合成通过开环聚合法制备mPEG-PCL二嵌段共聚物，其中PCL分子量20 000，PEG分子量4 000。

在装有适量聚乙二醇的聚合管中加入计算量的ε-CL以及0.1%（wt／wt）的辛酸亚锡。

在真空下封管并将其
放入130℃油浴反应48 h。

反应得到的粗产物用氯仿溶解后沉淀于大量冷甲醇中
以除去未反应的单体和其他低分子量的物质，然后将沉淀物收集用水洗涤数次后减压干燥，得到mPEG-PCL二嵌段共聚物。

1.2.2 辣椒碱纳米微球的制备采用改进的纳米沉淀法制备载药纳米粒子［7］。

将20 mg mPEG-PCL以及4 mg辣椒碱溶于3 ml丙酮，然后将得到的溶液在缓慢
搅拌下分散于20 ml蒸馏水中，同时加入适量的泊洛萨姆-188，再将该溶液转入
分子量限制为12 kd的透析袋中透析至完全除去丙酮和未包裹的药物晶体。

得到
的淡蓝色分散液用220 nm的滤膜过滤以除去高分子聚集物后将其冻干，存于4℃备用。

空白纳米粒子及荧光素（香豆素-6）纳米微球的制备过程同上。

1.2.3 纳米粒子的粒径、zeta电位以及形貌分析
制得的纳米粒子的粒径通过动态光散射（DLS）法测定，Zeta电位通过Zeta仪测定。

将样品用0.01 M PBS稀释到0.05%（wt／v），所有测试均进行3次取平均值。

粒子的形貌通过透射电子显微镜（TEM）及扫描电子显微镜（SEM）进行评价，将一滴纳米粒子分散液滴加在覆盖有硝酸纤维素膜的铜网上，在空气中干燥后用1%（wt／v）的磷钨酸钠进行染色，然后观察。

将冻干的纳米粒子溶于纯水，
滴加到洁净的硅片上，置于室温下干燥，通过透射电子显微镜和扫描电子显微镜下观察其表面结构。

1.2.4 辣椒碱纳米微球的载药量以及包封率的测定称取5 mg辣椒碱纳米微球的冻干粉溶于5 ml蒸馏水，然后将溶液低温超速离心（12 000 xg、4℃）二十分钟，取上层清液20μl进色谱柱测定。

另称取等量的辣椒碱纳米粒子溶于5 ml甲醇，
微热蒸发溶剂至干流动相溶解经0.45 um膜过滤后转入到10 ml容量瓶中并用流动相定溶震荡均匀即得样品溶液，进样20μl进行色谱分析。

色谱柱为安捷伦（angilent）C-18，5μ，200 mm×4.6 mm，流动相为48／52／0.05（v／v／v）（甲醇／双蒸水／冰醋酸），流速为1.0 ml／min，温度30℃，测定波长为303 nm。

根据标准曲线求出药物含量，进而根据以下公式得出载药量和包封率。

1.2.5 辣椒碱纳米微球的体外释放准确称取10 mg辣椒碱载药纳米微球溶于5 ml 0.01 M磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4），然后将该溶液转入透析袋中（截留分子
量为12000），将透析袋完全浸入于PBS液中，整个释放实验过程在37℃恒温摇床中进行。

每隔一定时间取出外液，同时加入新的等量PBS。

所得到的不同时间
点的外液，释放介质中的辣椒碱含量，根据上述方法进行高效液相色谱测定，由标准曲线求出溶液中辣椒碱的含量。

体外释放试验共重复3次。

1.2.6 负载荧光素纳米粒子的肿瘤细胞摄取实验将5×105／孔的U251细胞接种在放有无菌盖玻片的六孔培养板中。

具体操作过程如下：将无菌盖玻片放入六孔培养板，将5×105U251细胞接种在玻片上，接种24 h后加入负载荧光素（香豆素-6）100μg／ml纳米微球溶液继续培养4 h。

然后将玻片取出PBS冲洗，4%多聚甲
醛固定15 min，DAPI染色10 min，PBS及去离子水冲洗封片，激光共聚焦显微镜下观察。

1.2.7 Coumarin-6纳米粒及负载荧光素NIR-797异硫氰酸酯纳米微球透过血-脑
屏障将负载荧光素NIR-797异硫氰酸酯纳米微球的荧光探针，通过尾静脉注入小
鼠体内分别在0.5 h、1 h、3h、6 h、12 h、24 h观察肿瘤部位荧光素的强度。

首先，将荧光素NIR-797异硫氰酸酯标记的纳米微球上。

NIR-797-异硫氰酸酯（2 mg，0.0023 mmol）在N-N二甲基甲酰胺（DMF）催化下，异硫氰酸酯的
酯键与mPEG-PCL中PCL的羟基端反应12 h后将其转入透析袋（MOCW 3500）中透析48 h以除去未反应的NIR-797-异硫氰酸酯。

然后，将反应产物用乙醚沉
淀3次蒸干后得到负载荧光素NIR-797异硫氰酸酯纳米微球的荧光探针。

采用Chertok［8］的方法构建C57BL小鼠脑胶质瘤模型：取对数生长期的
GL261胶质瘤细胞，0.25%胰蛋白酶消化，离心取上清液，将细胞数调至为1× 107／μl置于4℃备用。

C57BL小鼠称重后给予3.5 %水合氯醛（200 mg／kg）腹腔内注射，麻醉后将其固定于立体定向仪中，于小鼠头顶部正中切开皮肤，暴露颅骨，用3%双氧水涂擦颅骨将骨膜氧化，于前囟前1 mm，右侧旁开2.5 mm处，用直径1 mm的牙科钻钻颅骨至硬脑膜。

微量注射器抽取细胞悬液5 μL，垂直固定于立体定向架上，经原骨孔进针于硬脑膜下3.5 mm，在3 min内将细胞悬液
注射完，骨蜡封闭针孔，1号线缝合头皮切口。

然后将12只小鼠肿瘤接种后观察
小鼠的体重变化和生存率。

将负载荧光素NIR-797异硫氰酸酯纳米微球的荧光探
针分散于生理盐水，经尾静脉注入脑胶质瘤模型的小鼠体内，并且在不同时间点在
704 nm波长下扫描小鼠观察负载荧光素纳米微球在脑内的分布情况。

1.2.8 辣椒碱纳米微球的细胞毒性实验 U251胶质瘤细胞株在含10%胎牛血清、100μg／ml青霉素，100μg／ml链霉素、0.2%NaHCO3的DMEM培养液中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。

采用MTT法测定细胞增殖，具体操作如下：取对数生长期U251细胞，以0.25%胰蛋白酶消化并计数，将细胞悬液分别接种于96孔培养板中，使每孔的细胞数为1×105／100μl。

设实验组和对照组，每组3个复孔，对照组包括DMSO对照、空白对照；实验组将辣椒碱和辣椒碱载药纳米微球设6个不同浓度梯度，浓度分别为：10、20、30、40、50、60μmol／l。

细胞培养24 h后，将培养液换成含不同浓度辣椒碱的培养液，继续培养24 h和48 h后每孔加入20μl MTT（5 mg／ml，PBS，PH 7.4），继续培养2 h后吸去上清，每孔加入150μl DMSO，振荡15 min，采用酶标仪测试各孔吸光度，按下式计算肿瘤细胞活力［9］。

细胞抑制率（%）＝（1-细胞生存率）×100%
1.3 统计学方法所有结果均采用SPSS for windows 16.0对数据进行分析。

实验结果以均数±标准差±s）表示。

正态分布的资料应用t检验或方差分析比较差异。

P＜0.05为有统计学意义。

2.1 辣椒碱载药纳米微球的粒径及表面电位的测定图1可见所制得辣椒碱纳米微粒成球形，内部为空心结构，表面光滑，其粒径较为均一。

由表1可知，以
PCL20k-mPEG4k为载体所制备的辣椒碱载药微球，载药前后的粒径分别为（118.8±1.7）nm、（121.3 ±2.5）nm，表明微球的粒径在载药前后变化不大，比较稳定。

Zeta电势检测发现粒子表面带负电荷。

2.2 辣椒碱纳米微球的载药量以及包封率的测定
由表1中可见，通过调整辣椒碱与载体材料PCL 20k-PEG4k之间的投料比，所测的最高载药量在9.4%±2.3%，包封率能达到76%±5.1%，结果表明mPEG-PCL 对于辣椒碱来说具有较高的载药量和包封率，可能是由于辣椒碱的疏水性与微球的
疏水核PCL有关。

2.3 辣椒碱纳米微球的体外释放通过图2可知，辣椒碱微球具有良好的体外缓释
特性，在最初的48 h内，有超过60%的辣椒碱释放，而在随后的1周时间内，维持一个较为平稳的释放速率，共释放出了80%的辣椒碱。

由此可见辣椒碱被载入
纳米微球后，可以达到一个长时释放的效果。

2.4 负载荧光素（香豆素-6）载药纳米微球的细胞摄取为了观察纳米微球能否被
肿瘤细胞摄取，将负载荧光素（香豆素-6）的微球（香豆素-6，12.5μg／ml）与
U251肿瘤细胞共培养4 h后，通过激光共聚焦显微镜观察发现细胞内出现了绿色荧光的光点（图3 b），同时为进一步观察粒子在细胞内的分布我们用DAPI将细胞核染为蓝色（图3 a），由图3 c可知香豆素-6纳米微球可进入细胞且主要分布于细胞质内。

2.5 小负载荧光素NIR-797异硫氰酸酯纳米微球透过血-脑屏障为进一步验证纳米微球是否能透过血-脑屏障，本实验通过尾静脉将负载荧光素NIR-797异硫氰酸酯纳米微球注入脑胶质瘤模型小鼠体内，12只鼠全部存活，分别在1 h、3 h、6 h、12 h、 24 h扫描发现从第3 h开始小鼠的右侧脑肿瘤部位的近红外荧光强度逐渐的增强，24 h小鼠颅内荧光强度仍然很强，进一步验证了纳米微球的脑靶向性。

2.6 辣椒碱纳米微球的体外抑瘤作用由图4可知，对于U251细胞辣椒碱纳米微
球与裸药辣椒碱对于肿瘤细胞的杀伤作用都具有浓度依赖性和时间依赖性，辣椒碱纳米微球显示出与辣椒碱裸药相异的细胞毒性。

在辣椒碱等效浓度＞40μM时，
辣椒碱微球与辣椒碱裸药对于U251细胞的抑制效果基本相当。

而在培养48 h后，辣椒碱等效浓度＜30μM时，辣椒碱纳米微球显示出更为明显的细胞杀伤效果。

当辣椒碱等效浓度同为20μM时，辣椒碱裸药的细胞抑制率为32%±2.6%，而辣椒碱纳米微球的细胞抑制率为48%±3.1%，两者之间有显著性差异（P＜0.05）。

等效浓度为30μM的辣椒碱裸药的细胞抑制率为43%±3.8%，同样浓度的辣椒碱
微球的细胞抑制率是68%±2.9%，两者之间也存在显著性的差异（P＜0.05）。

表明辣椒碱纳米微球对U251细胞的生长呈现明显的抑制作用，特别是在低浓度下
辣椒碱纳米微球对于肿瘤细胞的杀伤作用明显优于游离辣椒碱。

随着纳米技术的迅速发展，纳米技术在生物医学中的应用也越来越受人们关注，特别在恶性肿瘤的诊断、靶向治疗等方面都有良好的应用前景［10］。

纳米材料作
为抗肿瘤药物载体的研究备受人们青睐，利用纳米材料作为药物载体，从而实现肿瘤的靶向给药，为恶性肿瘤的治疗提供了一种新的策略［11-12］。

本实验中，选用被FDA批准的聚己内酯与聚乙二醇合成的二嵌段共聚物（mPEG-PCL）作为药物载体制备了辣椒碱载药微球。

mPEG-PCL具有无毒性、可生物降解性及生物相
容性的特点，该载体一端为亲水性，另一端为疏水性。

聚己内酯作为疏水端，聚乙二醇作为亲水端在水中自组装成较小粒径的纳米粒子。

疏水性的聚己内酯使脂溶性的药物更容易被载入微球，而聚乙二醇的亲水性则使微球在体内循环时间大大延长。

有研究表明聚乙二醇修饰的纳米微球降解速度很慢，能够保持药物活性达一年以上，从而使载药微球在体内长时间存留，发挥持久的抗肿瘤药效［13-14］。

大量研究表明，辣椒碱具有良好的抗肿瘤特性，对多种人体恶性肿瘤均有明显的抑制作用［15-17］。

近年有文献报道，辣椒碱对脑胶质瘤也具有较强的抑制作用［4-6］。

由于，辣椒碱具有水溶性差、易被氧化、半衰期短等理化性质，使其生物利用度较低。

将疏水性药物负载于纳米材料中如脂质体、聚合物纳米粒可以增加药物的水溶性，有利于静脉给药。

因此，我们将辣椒碱负载于纳米材料制备成聚合物纳米微球，改变了其疏水的性质，并通过微球的缓释特性，使药物发挥更好的抗肿瘤作用［13-14］。

mPEG-PCL作为水溶性低的药物的载体，负载工艺简单，
实用性强，具有良好的应用前景。

本实验中所制备的辣椒碱微球的载药量达到了（9.4±2.3）%、包封率达到
（76±5.1）%，载药量和包封率都较高，同时体外药物释放实验表明微球还具有
缓释性的特点，这样使得该微球在体内发挥疗效时可以通过最初的突释来达到一个较高的血药浓度，而随后的长时释放则为保持一定的有效血药浓度提供了保证，从而达到了长效缓释的抗肿瘤效果。

另外，如果进一步在粒子的表面连接一些靶向基因如配体、受体和抗体，从而实现肿瘤的靶向性，将抗肿瘤药物靶向输送到肿瘤部位，可以更好的发挥抗肿瘤作用并降低药物的毒性［11-12］。

在体外细胞实验中，将100μg／ml香豆素-6纳米微球与U251胶质瘤细胞共培养4 h后，发现肿瘤细胞中可以清晰地看到绿色荧光，其可能原因是细胞通过胞吞作用将载有香豆素-6纳米微球摄入细胞内，微球进入细胞后将香豆素-6缓慢释放出来，为载药纳米微球进入细胞发挥抗肿瘤作用提供了依据。

将负载NIR-797纳米微球经尾静脉注入荷瘤小鼠体内由近红外实时成像，结果发现随着时间的流逝右侧小鼠荷瘤部位出现明显的荧光，这一结果和文献报道一致［18］。

因此，我们推测在血-脑屏障受破坏时，高分子纳米微球可以很好地透过血-脑屏障，该实验结果为脑肿瘤的靶向治疗提供了依据。

辣椒碱纳米微球的细胞毒性实验发现，载药微球对U251细胞的生长呈现明显的抑制作用，特别是在低浓度条件下辣椒碱微球对于肿瘤细胞的杀伤作用明显优于游离辣椒碱（P＜0.05），但是随着药物浓度的增加辣椒碱微球与游离辣椒碱对于肿瘤细胞的杀伤作用相差不大，这可能是因为在低浓度条件下细胞通过胞吞作用将辣椒碱纳米微球摄入细胞后，辣椒碱在包浆内缓慢释放，更好地发挥药效。

因此，本研究推测将药物负载于纳米微球可增加脂溶性药物的生物利用度，并且具有显著的缓释特性，同时利用载药纳米微球这一特性，可以控制药物使用剂量，以减轻药物本身的毒副作用。

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患者尤其注意，使用敏感抗生素多可治愈；对形成垂体脓肿者需再次经蝶窦手术。

本组病例显示，病理免疫组化诊断与临床内分泌血清学诊断不能完全符合，有些病例无内分泌症状但免疫组化却显示瘤细胞对某一或某些激素呈阳性反应，可能的原因是这些病例中的瘤细胞产生的激素无生物活性，或者产生的激素在细胞内或进入血循环后降解失活，从而导致临床上不出现相应症状［9］。

至于内分泌血清学检查显示高分泌型激素却出现病理免疫组化该激素阴性的原因不是很明确，可能的解释是高分泌的瘤细胞释放的激素绝大部分被吸收至血液中，致使瘤组织内残留很少，以至于免疫组化很难检测到而使结果阴性。

总之，单鼻孔经蝶窦入路切除垂体瘤是一种比较安全有效的方法，由于操作空间狭小，要求我们熟悉相关的解剖结构，有丰富的显微外科手术经验，正确掌握手术适应证和禁忌证，及时正确处理并发症，以及术后合理的综合治疗，可以确保疗效。

同时，应用神经内镜明显提高了手术的安全性和手术效果，神经内镜技术在单鼻孔经蝶手术中具有广阔的发展前景。