一种适用于PCR扩增的真菌DNA提取方法[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102559656 A
(43)申请公布日 2012.07.11C N 102559656 A
*CN102559656A*
(21)申请号 201110345992.8
(22)申请日 2011.10.29
C12N 15/10(2006.01)
(71)申请人山东好当家海洋发展股份有限公司
地址264305 山东省荣成市虎山镇好当家工
业园区
申请人山东省科学院生物研究所
(72)发明人贾爱荣 刘昌衡 孙永军 张永刚
孟秀梅 张绵松 胡炜 刘新
袁文鹏
夏雪奎
(54)发明名称
一种适用于PCR 扩增的真菌DNA 提取方法
(57)摘要
本发明涉及了一种适用于PCR 扩增的真菌
DNA 提取方法，该方法是：将菌体经过液体培养，
离心，收集菌丝体后；在研磨设备中加入TRIS 饱
和酚提取液研磨至糊状；将糊状物转入离心管
中，加氯仿-异戊醇抽提液混匀抽提蛋白，离心，
取上清液；上清液加无水乙醇沉淀，离心，收集沉
淀物；沉淀物乙醇洗涤，干燥，溶解，即得真菌基
因组DNA 。

本发明避免了使用液氮，减少了试剂的
使用，具有简便、高效、快速和廉价的特点，能在短
时间内完成对大量样品的提取。

用此方法提取的
DNA 浓度和纯度理想，能满足后续的PCR 扩增等常
规分子生物学研究。

(51)Int.Cl.
权利要求书1页 说明书4页 附图1页
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页
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1.一种适合PCR 扩增的真菌DNA 提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
a 、培养真菌，离心，收集菌丝体；
b 、将所得到的菌丝体置于研磨设备中，加入TRIS 饱和酚提取液，研磨至糊状；
c 、将所得到的糊状物转入离心管中，加氯仿-异戊醇抽提液混匀抽提蛋白，离心，取上清液；
d 、将所得到的上清液加无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀物；
e 、将所得到的沉淀物采用乙醇洗涤，干燥，溶解，即得。

2.根据权利要求1所述的一种适合PCR 扩增的真菌DNA 提取方法，其特征在于：其具体步骤如下：
a 、采用液体培养法培养真菌约36～72小时，控制转速为12000～15000r/min ，离心5～10min ，收集菌丝体；
b 、将步骤a 所得到湿重为0.2～0.5g 的菌丝体置于研钵，加入1ml 的TRIS 饱和酚提取液，研磨至糊状；其中，所述的TRIS 饱和酚提取液的pH 值为8.0；
c 、将步骤b 所得到的糊状物转入微量离心管中，加0.5ml 的氯仿-异戊醇抽提液振荡混匀，抽提蛋白，其中氯仿-异戊醇抽提液的体积比：25∶1；控制转速为12000～15000r/min ，离心5～10min ，取上清液；
d 、将步骤c 所得到的上清液转入新离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置1～2小时，控制转速为12000～15000r/min ，离心5～10min ，收集沉淀物；
e 、将步骤d 所得到的沉淀物采用浓度为70～75％的乙醇漂洗2次后，控制转速为7500～12000r/min ，离心处理3～5min ，然后在超净工作台中鼓风干燥，加50μl 的无菌去离子水溶解，即得。

3.根据权利要求2所述的一种适合PCR 扩增的真菌DNA 提取方法，其特征在于：所述的步骤c 中将所得到的糊状物转入微量离心管是采用尖端剪除0.5cm 的吸头转入。

权 利 要 求 书CN 102559656 A
一种适用于PCR扩增的真菌DNA提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种分离、提取、纯化DNA的方法，尤其涉及一种适用于PCR扩增的真菌DNA提取方法。

背景技术
[0002] 随着分子生物学学科的发展，在真菌的分子生物学研究中，快速高效地提取质量优良的DNA有着重要意义。

真菌具有特殊的细胞壁结构，与其他微生物相比，其细胞壁厚，多糖含量高，所以真菌DNA的提取较为困难。

目前，常用的真菌DNA提取方法是CTAB法、SDS法及试剂盒法。

前两种方法的主要技术路线是：利用液体或固体培养基培养真菌，收集菌丝，用液氮研磨破碎细胞壁，再利用各提取液提取DNA，经过纯化得DNA。

通过这些方法一次可提取大量DNA而且质量较好，但以上这些方法有一定的缺点：一是液氮容易冻伤皮肤，一些地方液氮和干冰不容易获得而受到限制；二是费时，效率不高；三是所用设备和药品相对较多。

试剂盒法提取DNA效率高、质量好、操作简单，但是成本较高，不适合大规模使用，而且多数只适合小量制备。

[0003] 另外，现有的真菌DNA提取方法步骤大体相似，主要差别关键在于采用何种方法来打破细胞壁。

常用的破壁方法主要有冷冻干燥研磨法、玻璃珠机械破壁法、微波法、酶解法和氯化苄法等。

通常冷冻干燥研磨法多用液氮来处理，一般是直接在液氮中研磨；玻璃珠机械破壁法则加入硅胶、石英砂、玻璃珠等来帮助破壁；酶解法和氯化苄法是利用酶、氯化苄、尿素来溶解细胞壁。

上述的破壁方法或存在着提取速度慢、或存在着步骤繁琐、或存在着技术要求高的不足。

因而，急需探索一种简便快速、且费用和技术要求均较低的方法，以大量提取真菌DNA用于满足后续的PCR扩增等常规分子生物学研究的需求。

发明内容
[0004] 为了克服现有技术中的不足，本发明提供一种快速、简便、经济、易行的适合PCR 扩增的真菌DNA提取方法。

[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种适合PCR扩增的真菌DNA提取方法，包括以下步骤：
[0006] a、培养真菌，离心，收集菌丝体；
[0007] b、将所得到的菌丝体置于研磨设备中，加入TRIS饱和酚提取液，研磨至糊状；[0008] c、将所得到的糊状物转入离心管中，加氯仿-异戊醇抽提液混匀抽提蛋白，离心，取上清液；
[0009] d、将所得到的上清液加无水乙醇沉淀，离心，收集沉淀物；
[0010] e、将所得到的沉淀物采用乙醇洗涤，干燥，溶解，即得。

[0011] 一种适合PCR扩增的真菌DNA提取方法，其具体步骤如下：
[0012] a、采用液体培养法培养真菌约36～72小时，控制转速为12000～15000r/min，离心5～10min，收集菌丝体；
[0013] b、将步骤a所得到湿重为0.2～0.5g的菌丝体置于研钵，加入1ml的TRIS饱和酚提取液，研磨至糊状；其中，所述的TRIS饱和酚提取液的pH值为8.0；
[0014] c、将步骤b所得到的糊状物转入微量离心管中，加0.5ml的氯仿-异戊醇抽提液振荡混匀，抽提蛋白，其中氯仿-异戊醇抽提液的体积比：25∶1；控制转速为12000～15000r/min，离心5～10min，取上清液；
[0015] d、将步骤c所得到的上清液转入新离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置1～2小时，控制转速为12000～15000r/min，离心5～10min，收集沉淀物；[0016] e、将步骤d所得到的沉淀物采用浓度为70～75％的乙醇漂洗2次后，控制转速为7500～12000r/min，离心处理3～5min，然后在超净工作台中鼓风干燥，加50μl的无菌去离子水溶解，即得。

[0017] 上述的步骤c中将所得到的糊状物转入微量离心管是采用尖端剪除0.5cm的吸头转入。

[0018] 本发明的提取真菌DNA的方法，具有以下优点：
[0019] (1)避免了使用液氮，解决了易冻伤皮肤的问题。

并便于不易获得液氮的地方使用；
[0020] (2)减少了试剂的使用，无需加入其他帮助破壁的裂解液，无需昂贵的仪器和试剂，经济高效；
[0021] (3)快速简便，整个提取过程中在1.5-2个小时内即可完成。

[0022] (4)该方法提取的DNA质量较好，适合作为PCR扩增的模板。

[0023] 因此，与其他常用的真菌DNA提取方法相比，本发明的提取真菌DNA的方法具有简便、高效、快速和廉价的特点，能在短时间内完成对大量样品的提取。

用此方法提取的DNA 浓度和纯度理想，能满足后续的PCR扩增等常规分子生物学研究的要求，特别适合于基础条件一般的实验室使用。

附图说明
[0024] 图1为采用本发明方法提取的3株真菌基因组DNA的琼脂糖凝胶(1％)电泳图。

其中泳道1为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)；泳道2为附球孢菌(Epicoccum spp.)；泳道3为链格孢菌(Alternaria sp.)。

[0025] 图2为采用本发明方法提取的3株真菌DNA为模板，PCR扩增rDNA-ITS序列片段的1％琼脂糖凝胶电泳图。

其中泳道M为Marker，分子量标准从上到下依次为2000、1600、1000、750、500、250；其中泳道1为聚多曲霉(Aspergillus sydowii)；泳道2为附球孢菌(Epicoccum spp.)；泳道3为链格孢菌(Alternaria sp.)。

具体实施方式
[0026] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。

[0027] 实施例1
[0028] 1、DNA提取
[0029] a、接种聚多曲霉(Aspergillus sydowii)于液体培养基，37℃培养36小时，然后在1.5ml的离心管中，控制转速为12000r/min，离心10min，收集菌丝体；
[0030] b、称取湿重为0.2g菌丝体，置于洁净的研钵中，向研钵中加入1ml的TRIS饱和酚提取液，充分研磨至糊状；其中，所述的TRIS饱和酚提取液的pH值为8.0；
[0031] c、用尖端剪除0.5cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到1.5ml的离心管中，充分振荡约1min，随即加入0.5ml的氯仿-异戊醇抽提液，其中氯仿-异戊醇抽提液的体积比：25∶1，轻轻振荡混匀，抽提蛋白；控制转速为12000r/min，离心5min，取上清液；[0032] d、将上清液转入新离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置1小时，控制转速为12000r/min，离心10min，收集沉淀物；
[0033] e、将沉淀物采用70％乙醇漂洗2次后，控制转速为7500r/min，离心处理5min，然后在超净工作台中鼓风干燥，加50μl的无菌去离子水溶解，即得。

其琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示。

[0034] 2.PCR扩增
[0035] 用所提取的DNA作为模板，设计真菌ITS区基因引物ITS-5(5‘-FGGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3’)和ITS-4R(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，进行PCR扩增，成功扩增得到长度约为600bp的rDNA-ITS序列片段，如图2所示。

[0036] 实施例2
[0037] 1.DNA提取
[0038] a、接种附球孢菌(Epicoccum spp.)于液体培养基，28℃培养72小时，然后在1.5ml的离心管中，控制转速为15000r/min，离心5min，收集菌丝体；
[0039] b、称取湿重为0.3g菌丝体，置于洁净的研钵中，向研钵中加入1ml的TRIS饱和酚提取液，充分研磨至糊状；其中，所述的TRIS饱和酚提取液的pH值为8.0；
[0040] c、用尖端剪除0.5cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到1.5ml的离心管中，充分振荡约1min，随即加入0.5ml的氯仿-异戊醇抽提液，其中氯仿-异戊醇抽提液的体积比：25∶1，轻轻振荡混匀，抽提蛋白；控制转速为15000r/min，离心8min，取上清液；[0041] d、将上清液转入新离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置2小时，控制转速为15000r/min，离心5min，收集沉淀物；
[0042] e、将沉淀物采用75％乙醇漂洗2次后，控制转速为10000r/min，离心处理3min，然后在超净工作台中鼓风干燥，加50μl的无菌去离子水溶解，即得。

其琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示。

[0043] 2.PCR扩增
[0044] 用所提取的DNA作为模板，设计真菌ITS区基因引物ITS-5(5‘-FGGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3’)和ITS-4R(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，进行PCR扩增，成功扩增得到长度约为600bp的rDNA-ITS序列片段，如图2所示。

[0045] 实施例3
[0046] 1.DNA提取
[0047] a、接种链格孢菌(Alternaria sp.)于液体培养基，28℃培养60小时，然后在1.5ml的离心管中，控制转速为13000r/min，离心8min，收集菌丝体；
[0048] b、称取湿重为0.5g菌丝体，置于洁净的研钵中，向研钵中加入1ml的TRIS饱和酚提取液，充分研磨至糊状；其中，所述的TRIS饱和酚提取液的pH值为8.0；
[0049] c、用尖端剪除0.5cm的蓝色吸头将糊状物全部转移到1.5ml的离心管中，充分振
荡约1min，随即加入0.5ml的氯仿-异戊醇抽提液，其中氯仿-异戊醇抽提液的体积比：25∶1，轻轻振荡混匀，抽提蛋白；控制转速为18000r/min，离心8min，取上清液；[0050] d、将上清液转入新离心管中，加入2倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置1.5小时，控制转速为13000r/min，离心8min，收集沉淀物；
[0051] e、将沉淀物采用70％乙醇漂洗2次后，控制转速为12000r/min，离心处理4min，然后在超净工作台中鼓风干燥，加50μl的无菌去离子水溶解，即得。

其琼脂糖凝胶电泳检测如图1所示。

[0052] 2.PCR扩增
[0053] 用所提取的DNA作为模板，设计真菌ITS区基因引物ITS-5(5‘-FGGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3’)和ITS-4R(5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，进行PCR扩增，成功扩增得到长度约为600bp的rDNA-ITS序列片段，如图2所示。

图
1
图2。