莱茵衣藻磷酸果糖激酶RNAi载体构建及其对莱茵衣藻油脂积累的影响

莱茵衣藻磷酸果糖激酶RNAi载体构建及其对莱茵衣藻油脂
积累的影响
李兴涵;费小雯;邓晓东
【摘要】为研究磷酸果糖激酶(PFK2)对微藻油脂积累的影响,克隆了莱茵衣藻磷酸果糖激酶同源基因CrPFK2,构建CrPFK2 RNAi干涉载体并转化莱茵衣藻.通过测定转基因藻在HSM培养下的生物量和油脂含量的结果发现,CrPFK2 RNAi转基因藻株在HSM培养基中生长加快,油脂含量下降了17.03％～21.48％,说明CrPFK2基因表达的降低与藻细胞油脂含量减少成正相关.CrPFK2通过改变光合碳流的多少间接调控藻细胞油脂的合成.该结果为CrPFK2基因应用于微藻油脂的遗传改良将起到重要作用.
【期刊名称】《广东农业科学》
【年(卷),期】2014(041)010
【总页数】5页(P155-159)
【关键词】莱茵衣藻;磷酸果糖激酶;RNAi;油脂含量
【作者】李兴涵;费小雯;邓晓东
【作者单位】海南大学农学院,海南海口571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101;海南医学院理学院,海南海口 571101;中国热带农业科学院热带生物技术研究所,海南海口571101
【正文语种】中文
【中图分类】Q945
随着化石能源的日益减少、环境污染的日益严重，寻找可再生、清洁无污染的绿色替代能源成为了各国学者的关注[1]。

生物柴油是一种优质清洁燃料，可从各种生物质提炼，因此可以说是取之不尽、用之不竭的能源，在资源日益枯竭的今天，有望取代石油成为替代燃料。

微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富，光合利用率高的自养生物。

微藻在生产生物柴油方面具有光合效率高、生产周期短、环境适应能力强和生物产量高等优点，是制备生物柴油的良好材料[2-3]。

莱茵衣藻诱导中性脂合成的逆境形式主要包括缺氮、缺硫、缺磷、缺铁、温度升高及pH值升高等，其中缺氮诱导中性脂积累最为显著[4]。

我们通过研究缺氮条件下莱茵衣藻进行数字基因表达谱（DigitalGene Expression Profiling，DGE）分析[5]，发现磷酸果糖激酶的表达量相对正常培养变化非常明显。

磷酸果糖激酶（PFK2）是糖酵解途径中的限速酶[6]，因此，对此酶的调节是调节酵解作用的关键步骤。

此酶在生物体内的活性，直接影响着生物体内碳的流向。

那么莱茵衣藻磷酸果糖激酶的变化是否与莱茵衣藻油脂积累有关？我们以模式藻类莱茵衣藻为试验材料，通过RNAi干涉技术来研究磷酸果糖激酶对藻类油脂积累的影响，为筛选高产油藻株奠定基础。

1 材料与方法
1.1 试验材料
试材莱茵衣藻CC124，购置于美国Duke大学衣藻中心。

藻株接种到固体TAP平板上继代培养，测定生理指标时接种于50mLHSM液体培养基中。

HSM培养基配方参照文献[7]。

大肠杆菌DH5α均为本实验室保存，RNAi干涉载体
pMaa7/XIR购自于Duke大学。

中间载体T282由本实验室构建。

主要试剂：Trizol、DEPC购于上海生工生物工程有限公司。

酚、氯仿、异戊醇、乙醇等购于广州化学试剂厂。

pMD-18T载体、PCR kit、SYBR R Premix Ex
TaqTM II（Perfect Real Time）试剂盒以及RT-PCR相关试剂均购自大连宝生物公司。

T4DNA连接酶、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购置于上海生工生物工程有限公司。

氨苄青霉素（Ampicillin）、巴龙霉素（Paromomycin）、5-FI（5-fluoroindole）、L-色氨酸均购置于上海生工生物
有限公司。

EcoRI、PstI等内切酶均购置于大连宝生物公司。

1.2 试验方法
1.2.1 总RNA的提取及其cDNA合成莱茵衣藻总RNA提取方法参照文献[5]，以大连宝生物公司的MMLV反转录试剂盒合成cDNA。

1.2.2 CrPRK2干涉片段的扩增根据phytozome数据库公布的磷酸果糖激酶（Cre12.g553250）报道的序列，设计用于扩增干涉片段的引物为F-ACTTCGGTGGCG GCTTCGTG/R-GTCATTGAGGCCGGGGCACA。

通过PCR扩
增用于RNAi的干涉片段，PCR反应体系为cDNA模板1μL，正向引物1μL，反
向引物1μL，I×MIX 12.5μL，DMSO 1μL Taq酶0.5μL，ddH2O补足至25μL。

PCR反应条件为95℃预变性3 min：95℃变性60 s，58℃退火30 s，72℃延伸60 s，35个循环；72℃延伸10 min。

PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

将扩增得到的目的片段用琼脂糖凝胶试剂盒回收纯化，与pMD18-T载体连接，连
接产物转化DH5a感受态细胞，挑取阳性转化子送上海生工生物公司测序、比对，得到载体pMD CrPFK2。

1.2.3 CrPFK2基因RNAi载体的构建用XbaI和SalI分别双酶切pMDCrPFK2和中间载体T282，回收CrPFK2正向片段和线性化的T282载体，连接，转化大肠
杆菌DH5a，挑取单克隆提取质粒，用XbaI和SalI双酶切鉴定重组质粒，得到CrPFK2正向片段-T282质粒。

用Hind III和BamHII双酶切pMDCrPFK2和CrPFK2正向片段-T282重组质粒，回收CrPFK2反向片段和线性化的CrPFK2正
向片段-T282载体，连接，转化转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆提取质粒，用
Hind III和BamHI双酶切鉴定，得到CrPFK2正反方向插入的中间载体。

通过EcoRI酶切CrPFK2正反方向插入的中间载体，将含有CrPFK2正反方向插入片段插入到pMaa7IR /XIR载体，得到pMaa7IR/CrPFK2IR干涉表达载体。

1.2.4 莱茵衣藻的转化及筛选采用Glass Beads法[8-10]转化莱茵衣藻CC124。

转化藻细胞转移至50 mL无菌离心管中，温育过夜。

3 000 r/min，离心5min收集藻细胞，涂布于TAP固体培养基（1.5 mmol/L L-色氨酸、5 μg/mL paromomycin）上培养6～8 d。

挑取单克隆，接种到新的TAP固体培养基（5 mmol/L 5-Fluoroindole）的TAP平板上复筛。

挑取单克隆，进行生物量、油脂
含量和目标基因表达丰度检测。

1.2.5 生物量的检测取6瓶不同时期的莱茵衣藻CC124，用酶标仪（BIO-TEKElx800）测定490 nm波长处各样品的吸光值；同时取各个样品500 mL，离心收集藻液，烘干后称其干重；绘制莱茵衣藻CC124 OD490与细胞干重的线性
关系[10]。

细胞干重=0.5991x-0.0235，R2=0.9973。

3次生物学重复和3次组内重复。

选取3个pMaa7/CrPFK2IR转基因藻株和对照pMaa7/XIR转化藻株。

分别接种
到50mL HSM培养基中，每隔1 d，用酶标仪（BIO-TEKElx800）测定490 nm
波长处各样品的吸光值，绘制出转化子的生长曲线，每个样品做3次重复。

1.2.6 油脂的测定藻株的油脂含量采用尼罗红荧光染色法进行高通量快速检测[11]，设置不同的三酰甘油浓度梯度，使用GloMax R-MultiDetection System （Promega，USA）测定其荧光值，绘制标准曲线y＝0.00004×FD（470 /570）-0.0029，R2＝0.9996。

FD（470/570）＝（A2-A1）。

A2为供试藻株被尼罗红染色后所测的数值，A1为染色前所测数值。

选取3个pMaa7/CrPFK2IR转基因藻株和对照pM aa7/XIR转化藻株。

分别接种到HSM培养基中，每隔2 d，采用尼罗红荧光染色法测定藻株油脂含量。

取培养
至第6 d的藻株制片，用终浓度为10μg/mL的尼罗红染色10 min，置于Nikon 80i荧光显微镜观察并拍照。

1.2.7 转基因藻株磷酸果糖激酶基因转录水平检测选取3个pMaa7/CrPFK2IR转
基因藻株，用TAP培养基培养至对数期，按照Trizol法提取总RNA，按照SYBR R Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）试剂盒说明书操作进行基因mRNA 丰度分析。

反应体系：SYBR 7.5μL，ROXⅡ0.3μL，正向引物0.5μL，反向引物0.5 μL，模板cDNA 1μL，ddH2O补齐至15μL。

反应程序为：95℃1 min；95℃10 s；60℃15 s；72℃20 s 40个循环。

对照为pMaa7 IR/XIR的转基因藻
株和莱茵衣藻CC124。

采用18S rRNA做内参。

数据处理采用2-△△Ct法分析。

显著性分析采用SAS软件包。

2 结果与分析
2.1 CrPFK 2基因干涉片段克隆
本试验涉及的莱茵衣藻磷酸果糖激酶同源基因CrPFK2 phytozome中Chlamydomonas reinhardtii数据库中登录号 Cre12.g553250；GENE BANK序列号：XP_001694148。

与其他物种的PFK聚类分析显示：CrPFK2与微藻PFK
聚为一类，与大豆和番茄关系较近（图1）。

以莱茵衣藻总RNA反转录成的cDNA为模板，扩增CrPFK2 RNAi干涉片段序列，结果与预计大小一致。

经克隆进pMD18-T后，得到pMDCrPFK2。

测序比对结果显示，所克隆的CrPFK2基
因片段与phytozome中Chlamydomonas reinhardtii数据库中公布的CrPFK2
基因序列同源性为100%。

图1 CrPFK2与其他物种同源蛋白聚类分析
通过PCR扩增得到CrPFK2干涉片段，插入克隆载体pMD18-T载体（图2A），通过XbaI、SalI酶切，将CrPFK2正向插入片段切下，插入中间载体T282 XbaI、SalI位点（图2B），同样，通过HindIII和BamHI酶切将CrPFK2反向插入片段
切下，插入中间载体 T282 Hind III和 BamHI位点（图2B），通过 EcoRI酶切
含CrPFK2反向重复序列的片段，插入pMaa7 IR/XIR载体，得到CrPFK2干涉载体 pMaa7 IR/CrPFK2IR（图2C）。

图2 CrPFK2 RNAi干涉载体构建示意图
2.2 CrPFK 2 RNAi干涉载体构建
2.2.1 RNAi正向和反向片段的获得用XbaI和SalI双酶切载体T282并回收载体
片段，用XbaI和SalI双酶切pMDCrPFK2并回收CrPFK2正向片段，将两种回
收产物连接获得重组质粒CrPFK2正向片段-T282，用XbaI和SalI双酶切重组质粒，大小与预期大小一致（图3B-1），用Hind III和BamHI酶切双酶切CrPFK2正向片段-T282并回收大片段，用Hind III和BamHI双酶切pMDCrPFK2并回收CrPFK2反向片段，将两种回收产物连接获得重组质粒CrPFK2反向重复片段-
T282，Hind III和BamHI双酶切重组质粒，大小与预期大小一致（图3B-2）。

利用EcoRI酶切鉴定（图3C）。

结果表明：含有CrPFK2正向和反向片段的中间载体构建完成，命名为T282-CrPFK2。

图3 CrPFK2 RNAi干涉载体构建
2.2.2 CrPFK2 RNAi干涉载体构建用EcoRI酶切干涉载体pMaa7 IR/XIR和中间
载体T282-CrPFK2进行酶切，回收载体和含CrPFK2反向重复序列的片段并连接，连接产物转化大肠杆菌，挑取单克隆，用EcoRI对重组质粒酶切鉴定（图3C）。

构建成功的干涉载体命名为pMaa7 IR/PFK2IR（图3D）。

2.3 莱茵衣藻转化及转基因藻株检测
采用玻璃珠法将CrPFK2 RNAi干涉载体转化莱茵衣藻CC124，以pMaa7 IR/XIR 载体转基因藻株为对照，随机挑起3～5个阳性藻株，检测转基因藻株在
HSM/HSM-N培养下的的生物量，油脂含量和CrPFK2基因mRNA水平。

RNAi 干涉转基因藻株生物量测定结果见图4。

从图4可以看出，藻株生物量在开始培养
的第4 d生物量一直增加，到第4 d开始保持不变，与pMaa7 IR/XIR转基因藻株藻株比较，CrPFK2 RNAi干涉转基因藻株的生物量高于pMaa7 IR/XIR转基因藻株生物量13.16%～20.38%。

这说明CrPFK2基因的沉默有利于莱茵衣藻的生长。

图4 CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株连续培养5d后生物量的变化
CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株油脂含量的检测显示（图5）：相对于对照pMaa7 IR/XIR转基因藻株，CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株油脂含量显著下降，降幅范围为13.16%～20.38%，说明CrPFK2对油脂油脂代谢起到重要的作用。

显微镜检结果也显示（图6）：CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株油脂含量下降。

图5 CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株连续培养10d后生物量的变化
图6 CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株油脂含量
图7 CrFFK2基因的mRNA表达水平
提取培养3 d的藻株总RNA，反转录成cDNA，用SYBR Premix EX Taq （TaKaRa）试剂盒检测CrPFK2基因mRNA相对表达量，如图7。

结果显示，3个CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株的CrPFK2基因mRNA水平量与野生型藻株CC124和转pMaa7 IR/XIR藻株相比，下降了93.57%～96.49%。

3个CrPFK2 RNAi干涉载体转基因藻株的CrPFK2基因mRNA水平极显著的低于野生型藻株CC124。

说明RNAi干涉载体转入CC124藻株后，对PFK2基因的沉默效果较好。

3 结论与讨论
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是1998年由Fire首次发现并命名的转录后水平的基因沉默机制[12]，是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象[13]。

目前，使用RNAi技术已广泛的应
用于下调植物代谢过程中的有些关键酶，RNAi技术已经成为功能基因组研究、基因工程和生物医学的主要研究方法之一。

磷酸果糖激酶（PFK2）是糖酵解代谢途径中的一种关键限速酶，催化6磷酸果糖转变为1，6一二磷酸果糖（FDP）[14]。

该酶基因的突变，造成组织中磷酸激酶活性的丧失或部分失活，糖分解受阻。

从而影响有机体的生物性状，PFK2还通过影响ATP的生成直接影响能量供应。

磷酸果糖激酶在莱茵衣藻中的研究报道还比较少，对莱茵衣藻油脂的积累的影响也鲜见报道。

本研究发现，通过基因沉默莱茵衣藻磷酸果糖激酶基因，导致藻细胞油脂含量的减少，说明磷酸果糖激酶的表达与细胞油脂含量呈正相关。

由于磷酸果糖激酶在糖酵解过程中起到重要的作用，决定光合碳流向糖酵解产物丙酮酸分配的多少[15]，决定流向脂肪酸合成以及油脂合成碳流的多少。

研究结果为通过基因工程的方法提高微藻油脂含量提供了基因资源。

CrPFK2对细胞其他生长活动的影响或调解作用仍有待于进一步研究。

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