ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型构建

ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化模型构建
梁璐;洪瑞云;周敏;张毅;邹海林;钟一鸣;王烈峰
【摘要】目的:采用载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)雄鼠,给予高脂饲料喂养,构建动脉粥样硬化模型,观察血脂变化及主动脉全长动脉粥样硬化斑块形成.方法:选取饲养于SPF屏障环境内8周龄的载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)雄鼠18只,随机分成对照组(9只)和实验组(9只).实验前对两组雄鼠进行鼠尾基因型鉴定,并随机抽取6只,测得8周龄对照组小鼠血脂.实验组给予高脂饲料(脂肪15%、胆固醇1.25%、0.5%胆酸盐);对照组予普通饲料,饮水不限.分别在喂养0周、8周时眼眶采血,测血脂.两组小鼠均在饲养8周处死,处死前12 h禁食不禁水,取主动脉全长,油红O染色,观察主动脉病理变化.成功建立AS模型后,将小鼠分为AS+生理盐水(NS)组及AS+辛伐他汀(ST)组(各9只),分别在给药4周及8周时眼眶取血,测血清中血脂浓度变化.结果:对小鼠鼠尾基因型鉴定确定ApoE基因敲除雄鼠均为阳性纯合子小鼠,且Neo cassette已被去除.通过对ApoE基因敲除雄鼠实验组及对照组血脂比较,表现为TG、TC和LDL-C显著升高(P<0.05),HDI-C(P<0.05)显著降低;实验组高脂饲料喂养8周后,ApoE基因敲除雄鼠主动脉形成明显的AS斑块,对照组则未见明显AS斑块.AS小鼠给予NS和ST后,检测表明ST给药时间增长,TC、TG、LDL-C均有降
低趋势.其中,TC及LDL-C给药ST 8周后有显著性差异(P<0.05),小鼠主动脉油红
O染色显示斑块脂质沉积较NS组有所减少,面积减小,凸向管腔程度也明显降低(即狭窄程度降低).结论:ApoE基因敲除雄鼠高脂饲料喂养8周后,血脂明显异常,且形
成明显的AS斑块,AS模型成功构建;AS小鼠给予ST(8周)则血脂浓度明显降低,且主动脉油红染色显示斑块明显少于对照组,表明该模型可用于抗动脉粥样硬化药物
药效检测.
【期刊名称】《赣南医学院学报》
【年(卷),期】2017(037)003
【总页数】7页(P337-342,364)
【关键词】动脉粥样硬化;载脂蛋白E基因敲除小鼠;疾病模型;动物
【作者】梁璐;洪瑞云;周敏;张毅;邹海林;钟一鸣;王烈峰
【作者单位】赣南医学院,江西赣州 341000;赣南医学院,江西赣州 341000;赣南医学院,江西赣州 341000;赣南医学院,江西赣州 341000;赣南医学院,江西赣州341000;赣南医学院第一附属医院,江西赣州 341000;赣南医学院基础医学院生物技术教研室,江西赣州 341000
【正文语种】中文
【中图分类】R-332
动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)是一组称为动脉硬化的血管病中常见且最重要的一种，AS主要累及体循环系统的大动脉和中动脉。

这种病变是由多种危险因素引起，其中血脂异常是其主要危险因素，ApoE是血浆脂蛋白的重要成分，对脂质的运输和代谢发挥主要作用。

从1992年起，已有研究通过敲除小鼠ApoE基因(ApoE-/-)且给予高脂饲料饲养后，成功诱发AS模型[1]；目前实验室常用美国杰克逊实验室(The Jackson Laboratory)ApoE基因敲除小鼠(品系名称：B6.129P2-Apoetm1Unc/J，Stock No: 002052)。

本实验使用的ApoE-/-小鼠购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司(品系名称：C57BL/6-Apoetm1Bcgen)，目前尚未见其动脉粥样硬化建模报道。

本实验通过提取鼠尾DNA、PCR扩增鉴别实验小鼠基因型；进而通过给予高脂饲养(小鼠标准饲料+1.25%胆固醇+15%脂肪+0.5%胆酸
盐)建立ApoE-/-小鼠AS 的疾病模型；通过给予辛伐他汀及生理盐水灌胃治疗，
通过检测血脂及主动脉油红O染色观察已建立AS模型的小鼠病情变化，有利于
更深入的研究动脉粥样硬化疾病的发生及发展相关机制，为寻找新的药物干预疾病发生发展提供帮助。

1.1 主要试剂 Tris、EDTA、油红O购自Sloarbio公司；HCL购自江西洪都生物
化学有限公司；NaCl购自辰欣药业股份有限公司；SDS、蛋白酶K购自Amresco公司；总胆固醇(TC)测定试剂盒、甘油三酯(TG)测定试剂盒、高密度脂
蛋白(HDL-C)测定试剂盒、低密度脂蛋白(LDL-C)测定试剂盒均购自南京建成生物
工程研究所；4%多聚甲醛购自ALDRICH公司；高脂饲料(小鼠标准饲料+1.25%
胆固醇+15%脂肪+0.5%胆酸盐)购自北京科澳协力饲料有限公司。

1.2 实验动物 ApoE基因敲除小鼠是目前公认的构建动脉粥样硬化模型的小鼠，本实验使用的ApoE-/-小鼠均购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司(品系名称：
C57BL/6-Apoetm1Bcgen；品系编码：BCG-DIS-0002)，由赣南医学院科研中
心实验动物中心繁殖。

1.3 实验方法
1.3.1 实验分组及给药方法选取饲养于SPF屏障环境内8周龄的载脂蛋白E基因
敲除(ApoE-/-)雄鼠18只，随机抽取6只，测初始血脂浓度；随机分对照组(9只)和实验组(9只)。

实验组给予高脂饲料(脂肪15%、胆固醇1.25%、0.5%胆酸盐)，饮水不限，分别在喂养0周、8周时眼眶采血，测血脂；对照组予普通饲料，饮水不限，分别于0周、8周时眼眶采血。

成功建立AS模型后，将小鼠分为AS+NS
组及AS+ST组，分别在给药4周及8周时眼眶取血，测血清中血脂浓度变化。

1.3.2 ApoE-/-雄鼠基因鉴定
1.3.
2.1 裂解液配方 1 M Tris-HCL pH 8.0稀释10倍；0.5 M EDTA pH 8.0稀释100倍；3 M NaCl稀释15倍；10%SDS稀释50倍；蛋白酶K(PK)：储存浓度：
10 mg·mL-1；终浓度：100 μg·mL-1。

1.3.
2.2 提取鼠尾DNA步骤每个鼠尾剪在一个1.5 mL的EP管中；每管加入
500 μL 配制好的裂解液(含蛋白酶5 μL)，封口膜封好；55 ℃杂交炉转过夜；从杂交炉中拿出，放置10～15 min，降至室温，将EP管颠倒混匀；13 000 rpm，室温离心15 min；吸取400 μL上清液至另一个新的EP管中，加入等体积的异丙醇；看到有DNA析出后，12 000 rpm 离心10 min，弃上清液；冰冷的75%乙醇
700 μL轻混，漂洗一次，12 000 rpm 离心5 min，将上清液全部吸除；在超净
台中风干约3～5 min；用50～100 μL GIBCO纯水(根据DNA量确定用水量)，
在55 ℃溶解2 h即可用做PCR模板。

1.3.
2.3 PCR反应程序95 ℃预变性5 min；35个循环(95 ℃变性30 sec，62 ℃
退火30 sec，72 ℃延伸30 sec)；72 ℃延伸10 min；4 ℃ 10 min。

PCR引物序列，ApoE-loxp-F: TGAGGCGGTTCTGAGACCTC；ApoE-loxp-
R:GTCTCAAGAAGCCAAAAGCCAATC。

1.3.3 检测ApoE基因敲除雄鼠血脂四项60 mg·kg-1体重戊巴比妥钠腹腔麻醉后，取小鼠眼眶血。

血浆装入不抗凝试管中，在4 ℃下4 000 g，离心10 min，取南
京建成生物工程研究所血清试剂盒测定胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)的含量。

酶标仪比色法分别测得510 nm及546 nm
析光度值，根据公式计算TC、TG及HDL、LDL含量。

1.3.4 动物标本制备与取材 ApoE-/-雄鼠在饲养8周处死，处死前一天晚上禁食
不禁水。

分离小鼠全主动脉。

腹正中切开，钝性分离胸骨、膈肌，游离心脏、双肾，暴露胸腹主动脉全程。

取主动脉全程，将整个主动脉外周脂肪组织清除，并沿着主动脉弓内侧方向将主动脉纵向剪开；置于装有4%多聚甲醛溶液的EP管中固定过夜；取出主动脉，置于PBS中，于摇床漂洗4 ℃过夜。

1.3.5 主动脉全长油红O染色室温下将主动脉取出，置于装有异丙醇的器皿中脱
水2～3 min；室温下将主动脉放入装有油红O染液的EP管中[油红O染液配制：称取0.1 g油红O粉剂溶于10 mL异丙醇中，摇匀，置于60 ℃温箱40 min；取出后，加入等体积(10 mL)ddH2O，过滤即为油红O染液]，避光染色2～4 h(注
意染色时间不宜过长)；将主动脉取出，置于85%异丙醇中漂洗3～5次，3 min·次-1(视主动脉背景色调整漂洗次数及时间)；将异丙醇漂洗后的主动脉置于PBS中漂洗数次；将完成染色的主动脉展开、固定，观察并拍照。

1.3.6 统计学处理用 SPSS 统计软件建立数据库，计量资料以±s表示，多组定量
资料比较用方差分析，两组之间比较用t检验，P﹤0.05为差异有统计学意义。

2.1 ApoE基因敲除小鼠制备方式及基因型引物检测设计方案利用基因打靶技术产生转基因动物技术成熟，应用广泛。

将基因打靶载体通过显微镜下注射，导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源
重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达，得到阳性克隆。

用正、负选择法筛选细胞，通过PCR和southern blot杂交技术(基因敲除小鼠检测金标准)对上一步得到的阳性克隆进行筛选，得到稳定整合外源基因的胚胎干细
胞阳性克隆；筛选所有能表达neo基因的细胞，然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK正常表达的细胞，剩下的细胞为命中的细胞。

由于用于TK筛选的Gancyclovir对小鼠的种系传递有影响，一般采用DTA(白喉毒素A亚基)进行阴性筛选。

将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚中，再将此囊胚植入假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠，并获得F1阳性杂合子小鼠。

见图1。

2.2 小鼠鼠尾基因型鉴定剪小鼠鼠尾，提取鼠尾DNA、PCR、琼脂糖电泳，结果
如图2所示: 1，2,3,4,5,6,7,8,9,10是阳性纯合子小鼠,且Neo cassette已被去除。

2.3 ApoE-/-雄鼠实验组及对照组血脂比较由表1及图3可观察到，TC、TG、LDL-C中，HD 8周组>DN 8周组>正常对照组，HDL-C则表现为HD 8周组
<DN 8周组<正常对照组。

具体表现为：TC组中，HD 8周组、DN 8周组分别
与正常对照组比较，结果均增高，具有显著差异性(P<0.01);HD 8周组与DN 8周组相比增高，结果差异显著(P<0.05)；TG组中，DN 8周组明显高于正常对照组(P<0.01)，HD 8周组较之DN 8周组及正常对照组均升高(P<0.05)；LDL-C组，HD 8周组比正常对照组明显增高(P<0.001),DN 8周组与HD 8周组及正常对照
组比，分别表现为明显降低及增高，结果有差异性(P<0.05)；HDL-C组中，正常
对照组、DN 8周组、HD 8周组依次降低，其中HD8周组分别与正常对照组、DN 8周组比下降程度明显(P<0.05)。

2.4 主动脉全长动脉粥样硬化斑块主动脉全长油红O染色显示，动脉粥样硬化模
型建立初期的8周龄ApoE基因敲除雄鼠，其主动脉全长中未见AS斑块形成；高脂饲料喂养8周后，ApoE基因敲除雄鼠主动脉(尤其是升主动脉及肾动脉分叉处)油红O染色后，斑块脂质沉积明显，可看到较明显的点状或斑片状斑块突向管腔，边界较清；大部分斑块位于主动脉窦至主动脉弓血管分支处，病变处的血管管壁质脆，弹性差。

而对照组则未见明显AS斑块，内膜光滑，油红O染色未见红染(图
4 A,B)。

2.5 建立AS模型的ApoE-/-雄鼠给予辛伐他汀组及生理盐水组血脂比较由图5可观察到，成功建立AS模型的ApoE-/-雄鼠中，AS+NS组表现为随着时间增长，TC、TG、LDL-C明显上升且分别高于AS+ST组。

其中，TC及LDL-C组中，
AS+ST(8周)组明显低于AS+NS组，结果具有显著性差异(P<0.05)；HDL-C随
着时间增长，变化不具有明显的趋势，无明显统计学意义。

2.6 建立AS模型的ApoE-/-雄鼠给予辛伐他汀组及生理盐水组主动脉油红O染色比较由图6(A、B)可观察到，成功建立AS模型的ApoE-/-雄鼠中，AS给予辛伐他汀8周组的小鼠主动脉油红O染色显示斑块脂质沉积较生理盐水8周组斑块较
NS组有所减少，面积减小，凸向管腔程度也明显降低(即狭窄程度降低)(图6 A、B)。

AS是系统性、进展性疾病。

随着发病率及死亡率逐年上升，AS常可有诱发急性
心血管事件，如急性心肌梗塞、主动脉夹层等，严重危及生命，因而对AS发生及发展的研究极其重要。

对于AS的研究，一般多采用动物模型，如通过手术、或辅以高胆固醇饲料配合维生素D喂食小鼠等方式构建AS模型。

或采用ApoE基因
敲除小鼠辅助高脂饲料喂食，构建AS模型[1-2]。

一般的ApoE-/-小鼠动脉粥样
硬化病变的个体差异较大，因而实验时所需要的动物数量相对较大。

与Jackson
实验室构建的ApoE基因敲除小鼠(混合129、BALB/c和C57BL/6背景)不同的是，本实验采用的ApoE基因敲除小鼠为C57BL/6背景， C57BL/6背景是近交系，
遗传背景单一。

以C57BL/6为背景构建基因敲除鼠具有实验重复性高，个体差异小，实验结果可靠等优点。

实验中，采用脂肪15%、胆固醇1.25%、0.5%胆酸盐的高脂饲料配方建立动脉粥样硬化模型，血脂及脂蛋白检测显示发病小鼠个体差异小，各批次小鼠建模重复性高。

低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)进入内皮是
AS启动的开端，低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)在AS的各个阶段
均起重要作用[3-5]；载脂蛋白E(ApoE)是低密度脂蛋白受体的配体，是乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、高密度脂蛋白(HDL)的重要组分。

因而低密度脂
蛋白通过ApoE与LdlR的相互识别从而进入血管内皮细胞，诱发AS，并促进其
发展。

而将ApoE敲除，则可阻止LDL识别其受体，阻断胆固醇的逆向转运,使其不能通过肝脏代谢，进而使血脂升高，促进AS的发生及发展。

此外，ApoE还与机体总胆固醇 (TC)的代谢密切相关[6]。

因而，ApoE与高脂血症、AS及CHD等
发生及发展密切相关[7-8]。

基因敲除可以利用DNA同源重组原理，使用把外源基因片段替代特定的靶基因片
段，使机体特定的基因失活或缺失，并可以使其稳定的复制[9]。

其中，基于胚胎
干细胞的基因打靶技术目前比较成熟，应用广泛[10-12]。

该技术制备基因敲除小
鼠是目前为止唯一一个可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术。

本次实验采用的ApoE基因敲除小鼠，便是插入新霉素(neomycin)的抗药基因neo，使细胞
表达该基因，克隆到表达载体,作为筛选基因。

ApoE基因敲除小鼠通过同源重组技术制备的具有3号外显子纯合缺失的小鼠模型，非常容易诱发异常高脂血症，出现代谢综合征等异常表现，而血脂异常是动脉粥样硬化众多发病危险因素中的重要因素，极易诱发动脉粥样硬化形成；已有研究发现，自然饲养情况下，在3月龄时即出现动脉脂肪堆积；而且随着月龄增加将出现大
量类似动脉粥样硬化前期的血管脂质沉积等损伤，通过对ApoE基因敲除小鼠AS 模型的构建及相关研究，有利于更方便及更深入的研究疾病的发生机制，进而进行干预。

雌激素对动脉粥样硬化有抑制作用，有保护血管的特性[13]，因而年轻雌鼠不易形成动脉粥样硬化；但随着年龄增加，雌鼠体内雌激素分泌减少，进而易诱发动脉粥样硬化的形成[14-15]，故为排除性别因素形成的干扰，特选取ApoE基因
敲除雄鼠作为实验对象。

本实验通过对ApoE基因敲除雄鼠高脂饲料喂养组及普通饲料喂养组血脂比较，
对比两组雄鼠主动脉全长油红染色结果，表明实验组血脂异常，且与AS的形成及进展相一致。

表现为TG和LDL-C显著升高，HDI-C显著降低，高脂饲料喂养8
周后，ApoE基因敲除雄鼠主动脉(尤其是升主动脉及肾动脉分叉处)形成明显的AS 斑块，而对照组则未见明显AS斑块。

成功建立AS模型后，将小鼠分为AS+NS
组及AS+ST组，分别在给药4周及8周时眼眶取血，测血清中血脂浓度变化，表现为AS+NS组随着时间增长，TC、TG、LDL-C明显上升且分别高于AS+ST组。

其中，TC及LDL-C组中，AS+ST(8周)组明显低于AS+NS组，结果具有显著性
差异(P<0.05)，且主动脉油红染色显示斑块明显少于AS+NS组，且较发病起始阶
段无明显增长，表明ST治疗AS调脂及抗AS效果良好；但HDL-C随着时间增长，变化不具有明显的趋势，无明显统计学意义。

已有研究表明HDL-C的心脏保护作用来自临床观察，即HDL-C高的人群比正常人心脏病发病率低。

但HDL-C受多
种因素作用，比如如生活方式等。

另外人体基因变异导致的低HDL-C并没有增加心脏病风险；因而HDL-C的增高与其心血管保护作用相关性仍需进一步验证，一些升HDL-C的药物，如默沙东的Tredaptive等已经因安全问题撤市。

早期的研
究表示降低HDL(非HDL-C)可能有减慢血管壁胆固醇转移的功能；而通过提高HDL或HDL-C来保护心血管并无明显证据。

研究发现HDL包括不同大小的颗粒，这些颗粒的形状、脂质和蛋白质等的组成有一定差异，因而在功能上也具有两面性：具有心血管保护作用的HDL有正常的抗炎、抗氧化及促进胆固醇转运的作用，而具有损伤作用的则相反。

本实验观察到高脂饲料喂养时长对ApoE基因敲除雄鼠血脂变化影响明显，且高
脂饲料喂养8周龄ApoE基因敲除雄鼠8周后，即可成功构建AS模型。

实验结果显示，随着高脂饲料喂养时间的增加，ApoE基因敲除雄鼠TG和LDL-C显著升高，HDI-C则明显降低(随着时间增长，变化趋势不典型，无明显统计学意义)；主动脉全长油红O染色显示已形成明显且数量较多的AS斑块。

综上所述，本研究观察了ApoE基因敲除雄鼠在高脂饲料与普通饲料饲养下以及
随饲养时长的血脂水平变化及AS斑块形成情况。

结果表明，ApoE基因敲除雄鼠高脂饲料喂养状态下，血脂明显异常，且形成明显的AS斑块，而对照组则未见明显AS斑块；随着高脂饲料喂养时间的增加，ApoE基因敲除雄鼠出现明显的高脂血症且形成明显且数量较多的AS斑块；因而高脂饲料喂养8周龄ApoE基因敲除雄鼠8周后，即可成功构建AS模型。

建立AS模型的ApoE基因敲除雄鼠小鼠给予ST(8周)则血脂浓度明显降低，且主动脉油红染色显示斑块明显少于AS+NS组，且较发病起始阶段无明显增长，表明ST治疗AS调脂及抗AS效果良好。

该动脉
粥样硬化模型的构建及对比ST治疗效果的研究，有利于进一步探讨AS的发病机制，为预防及治疗AS提供新的思路和科学依据。

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