轮状病毒非结构蛋白NSP4研究进展

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轮状病毒NSP4基因变异特征

轮状病毒NSP4基因变异特征发表时间：2016-07-18T13:49:03.030Z 来源：《中华临床医师杂志》(电子版)2016年4月第7期作者：木国法郭正红[导读] A组轮状病毒是引起全世界婴幼儿严重腹泻的主要病原体[1]。

木国法郭正红【摘要】目的研究轮状病毒流行株NSP4基因变异特征。

方法对2015年7-11月从云南省昭通市获得的6株人轮状病毒流行株的NSP4基因用RT-PCR进行扩增,并进行测序，测序结果应用DNAassist和Clustal-mp以及MEG4.0软件进行序列分析,通过昭通毒株RV NSP4基因与来自GenBank Database的4株人RV (Wa、Hochi、 KUN、AU-1)和3株动物RV(OSU、SAll、 EW)及我国不同地区的45株A组轮状病毒NSP4基因进行比较。

结果昭通地区6株轮状病毒株的NSP4基因都为Wa型,与来自Genbank Database的4株人RV (Wa、Hochi、 KUN、AU-1)和3株动物RV(OSU、SAll、 EW)氨基酸同源性分别为95.7%、、94.2%、86.4%、84.8%和91.2%、82.3%、48.3%,与中国各地区流行株同源性均在86.4%以上, 据此可将51株RV NSP4分为2组,分别以Wa株和KUN株为代表,其中以Wa组为主,组内同源分别为92.6%-100%和96.5%-100%。

氨基酸进化树提示在Wa组内包括3个亚组。

结论 6个昭通地区轮状病毒株的NSP4基因都为Wa型。

我国流行株NSP4基因主要可分为Wa组及KUN组,NSP4的变异与年份有关而与地域关系不密切。

【关键词】轮状病毒；非结构蛋白4；腹泻；患儿Genetic characterization of the Zhaotong, Yunnan rotavirus NSP4 compared with other 45 epidemic strains from China. Guofa Mu Zhenghong Guo. Department of pediatrics, The first People’s Hospital of Zhaotong City, Yunnan ,China 657000【Abstract】 Objective To clarify the features of NSP4 gene variation among epidemic strains of human rotavirus in China. Methods NSP4 genes from 6 epidemic strains of human rotavirus isolated in ZhaoTong City,Yunnan from July to November in 2015 were amplified with RT-PCR. Then NSP4 specimens’ cDNAs were sequenced and analyzed by DNAassist 、Clustal-mp and MEG4.0 software. The 6 specimens’ NSP4 cDNAs sequences were compared with other 45 RV NSP4 cDNAs sequences available from China in the Genebank Datebase to clarify the features of NSP4 gene variation among epidemic strains of human rotavirus in China. Results The NSP4 Genotype of the 6 ZhaoTong RV strains were Wa strains .The amino acid homologies to the 4 HRV standard strains ( Wa、Hochi、 KUN、AU-1) and 3 animal RV( OSU、SAll、 EW)were 95.7%、94.2%、86.4%、84.8% and 91.2%、82.3%、48.3% respectively. Compared with the epidemic strains of other different areas of China, the amino acid homology of the NSP4 gene were over 86.4%. Based on the variation of amino acid sequence the 52 virus strains can be divided into two groups represented by Wa and KUN with the homology of 92.6%-100% and 96.5%-100% within each group respectively. The Wa group could further be separated into three subgroups, according to the diversity between those strains and the characterization in the highly variable domain. Conclusion TheNSP4 genotype of the 6 ZhaoTong RV strains were Wa strains. The NSP4 gene of human rotavirus epidemic strain in China can be divided into Wa and KUN two groups. Samples isolated in the same year but not in the same area shared higher homology.【Key words】 Rotavirus NSP4 Diarrhea InfantileA组轮状病毒是引起全世界婴幼儿严重腹泻的主要病原体[1]。

人轮状病毒NSP4蛋白131和133位氨基酸变异对毒力影响的研究

达两株病毒的ＮＰＳ４蛋白Ｃ端８．６～１０位氨基酸（Ｓ－Ｓ４７ＧＴＮＰ）并酶切融合头纯化得到两种ＮＰ蛋白，ＩＲ乳鼠中；Ｓ４在Ｃ
比较这两种蛋白致小鼠腹泻的差异。结果：两种ＮＰ蛋白毒性无差异。结论：Ｓ４两株轮状病毒１１和１３位氨基酸位点３位３的变异不影响毒力的改变，致腹泻活性没有明显差异（００）其Ｐ＞．５。［关键词］轮状病毒；Ｓ４蛋白；泻；ＮＰ腹变异
中国图书分类号１１３文献标识码Ａ文章编号１０－０Ｘ（０７）４０１－４００４４２００－００３
［摘
要］目的：研究两株Ａ组人轮状病毒ＮＰＳ４蛋白１１和１３位氨基酸位点的变异对毒力的影响。方法：昆明３位３从
维普资讯
中国免疫学杂志２ｏ０７年第２３卷
人轮状病毒ＮＳ４蛋白１１和１３位氨基酸变异对毒力影响的研究Ｐ３３
拳晓琳蒋立虹① 孟明耀① 庞伟王萍① 李亚雄① 陈智豫① 刘建生侯宗柳① ②
（中国医学科学院中国协和医科大学医学生物学研究所，昆明６０１）５１８
Ｌ／ＸｉｏＬｎ，Ｉａ —ｉＪＡＮＧＬ— ｎＭＥｎ — ａＰＮＧＷｅ，ＷＡｉｇ，ｕａＸｉｎ，ＨＥＺｈ－ｕ，ＵＪａ — ｉＨｏｇ，ＮＧＭｉｇＹｏ，ＡｉＮＧＰｎＹ－ｏｇＣＮｉＹｕｉｎ
Ｓｅｇ，ＯｏｇＬｕｎｔｕｅｏｄａｉｏｙＣｉｓＡａｅｙｏＭｅｉｌｃｎｅＰｋｇＵｉｎＭｅｉｌｈｎＨＵＺｎ－ｉ．ＩｓｔｔｆＭｅｉｌｏｇ，ｈｎｅｃｄｍｉｃＢｌｅｆｄａｉｃ＆ｅｉｎｄｃｃＳｅｎｏａ

轮状病毒感染发病机制的研究进展

轮状病毒感染发病机制的研究进展摘要】轮状病毒（RV）为双链RNA病毒，是小儿腹泻最常见的病原体。

RV感染不但能引起胃肠道症状，还能引起肠道外系统的病变。

RV腹泻及RV血症的发病机制与多种因素有关，但尚不完全明确。

RV腹泻可能与肠道神经系统紊乱、肠道吸收功能失调、非结构蛋白NSP4、热休克蛋白hsc70、细胞胞间结构损害等有关，RV毒血症可能与RV通过血液或（和）淋巴播散或免疫因素有关。

【关键词】轮状病毒；婴幼儿感染性腹泻；病毒血症；发病机制【中图分类号】R373 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）18-0001-02轮状病毒（RV）是婴幼儿腹泻最常见的病毒，在全球，每年有近1.2亿患儿感染RV，其中93%发生在5岁以下的小儿（尤其是6～24月婴幼儿），每年有近60万的患儿死于重症RV感染性胃肠炎，80%死亡患儿发生在发展中国家[ 1 ] 。

RV腹泻已经成为发展中国家婴幼儿死亡率仅次于肺炎的疾病，排在患儿死亡原因第二位[ 2 ] 。

RV不仅引起呕吐、腹泻等肠道反应，还能引起发热、脑炎、上感及癫痫等肠道外症状，国外有研究表明在腹泻患儿小肠粘膜上端存在RV[ 3 ]，此研究在RV感染患儿血液标本中发现RV抗原和RNA，表明RV发病机制累及肠外及抗原血症在RV发病机制中的重要作用。

目前国内外对RV感染发病机制和预防的研究不断深入，并取得相应进展。

本文就RV腹泻和RV血症机制及预防进展作一综述。

1.RV引起肠道内症状的发病机制RV引起肠炎的机制尚未明确，过去观点认为RV感染破坏致小肠粘膜上皮细胞、小肠绒毛成熟上皮细胞脱落、乳糖酶缺乏、乳糖吸收障碍、细菌对乳糖的分解及肠腔内渗透压升高，最后引起水、电解质分泌及渗透性腹泻和功能失调性腹泻。

有研究认为破坏细胞间连接引起细胞旁渗漏是RV腹泻的重要机制[ 4 ] 。

另有实验显示RV感染引起紧密连接相关蛋白分解是造成细胞旁渗漏的原因[ 5 ] ，然而在RV感染幼鼠实验的电镜下未观察到有明显细胞间结构连接的损害，因此RV腹泻与这种机制关系不大。

轮状病毒分子生物学研究进展

轮状病毒分子生物学研究进展摘要：轮状病毒是导致儿童及许多幼畜感染的重要原因，近年来，轮状病毒在全球范围内造成了大量的人类和动物死亡。

而且还带来了很大的经济损失。

所以WHO要求开发轮状病毒疫苗作为首要任务。

本文综述了轮状病毒分子生物学方面的最新进展，为进一步深入开展轮状病毒相关基因的实验室工作奠定了基础。

关键词：前言：轮状病毒是呼肠病毒科的一种，是婴幼儿及幼畜腹泻的重要病原。

每年全球有超过800,000人死于这种病毒。

在发展中国家，每年死于轮状病毒感染的儿童约为500,000。

猪轮状病毒主要是在0~60天龄的仔猪身上传播，对其生产和经济产生了重大的影响。

另外，轮状病毒也可以传染给大熊猫、羊、狗和马。

本文对轮状病毒的分子生物学特性、血清型、主要编码蛋白等方面作了简要的介绍。

1.轮状病毒的血清和分子结构轮状病毒是一种非囊膜的双链RNA病毒，它包括三个包衣的外壳，直径大约70毫米，具有二十面体的对称性，在电子显微镜下表现为“车轮状”。

轮状病毒由11个片段组成，每个片段均编码（VP1~VP4;VP6;VP7）及6个非结构蛋白（NSP1~NSP6),VP1-VP3是该病毒的核心蛋白。

VP6是一种特殊的抗体， VP4、VP7是影响该病毒毒性的主要因素，并能诱发人体中和抗体的生成。

按VP6抗原型轮状病毒可划分为A型GE型，A型轮状病毒最容易受人类感染。

比如非洲和亚洲，每年有453,000个儿童因轮状病毒感染而死亡。

根据VP4血凝素抗原与VP7中和抗原的差异，可以将其划分为G型（24种）和P型（33种）。

G1P[8]、G2P[4]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[8]等，而我国G1P[8]、G3P[8]是最常见的。

2轮状病毒基因中的关键蛋白与作用2.1主要的非结构蛋白质和功能能轮状病毒NSP1（NSP1）是由5个基因组片段编码的，它在病毒感染细胞时起到了一定的抑制作用。

NSP1对IRF3、IRF5的抑制作用；IRF7、NF-KB对宿主细胞IFN-I的表达有一定的抑制作用。

轮状病毒LLR疫苗株非结构蛋白NSP4基因稳定性研究

ａｎｄｐｒｏｖｉｄｅａｂａｓｉｓｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆｖａｃｃｉｎｅ．ＭｅｔｈｏｄｓＲｏｔａｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎＬＬＲｗａｓｓｕｂｃｕｈｕｒｅｄｉｎｐｒｉｍａｒｙｂｏｖｉｎｅ
ＬＬＲ株ＮＳＰ４基冈全长
将ＬＬＲ株轮状病毒毒种ＬＬＲ３８代在原代牛肾细胞上连续传至４９代，提取第３８、４３、４４、４９代病毒ＲＮＡ。通
过ＲＴ — ＰＣＲ扩增ＮＳＰ４基因片段，将其克隆入质粒ｐＧＥＭ— Ｔ中，进行序列测定与分析。结果
ｋｉｄｎｅｙｃｅｌｌｓｆｒｏｍｐａｓｓａｇｅ３８（ＬＬＲ３８）ｔｏｐａｓｓａｇｅ４９，ａｎｄｔｈｅｖｉｒａｌＲＮＡｓｏｆｐａｓｓａｇｅｓ３８，４３，４４ａｎｄ４９ｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄｏｆｒ
同源性分别为８３．５％～８７．５％、８５．２％～８７．５％、６５．９％～６７．８％、２７．６％～３０．８％、７７．８％；系统发生树显示ＬＬＲ
株与Ａ基因群ＲＶ在一个分支内。结论
轮状病毒ＬＬＲ疫苗株在原代牛肾细胞上连续传代ＮＳＰ４基因遗传特性极
ＴｈｅｓｔｕｄｙｏｎｈｅｒｅｄｉｔｙｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕａｌｐｒｏｔｅｉｎＮＳＰ４

猪轮状病毒 NSP4的细胞定位及在细胞凋亡中的作用

ｇａｓｔｒ０ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ［Ｊ］．ＮｏｖａｒｔｉｓＦｏｕｎｄＳｙｍｐ，２００１（２３８）：８２ — ９６．
ａ１ｌＪＭ，ＭｉｔｃｈｅｌｌＤＭ，ＧｉｂｂｏｎｓＴＦ，ｅｔａ１．ＲｏｔａｖｉｒｕｓＮＳＰ４．Ａｍｕｌｔｉ — ［３］Ｂ
１．１．１细胞系和质粒
永生化猪小肠上皮细胞系
重的危害。近年的研究证明，猪轮状病毒也有传染
人的可能性ｌ１］，因此，猪轮状病毒在公共卫生学方面具有重要的意义。
轮状病毒（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ，ＲＶ）的非结构蛋白ＮＳＰ４
正常电化学离子梯度来改变细胞内离子浓度，这些
病毒的孑Ｌ形成蛋白归类为ｖｉｒｏｐｏｒｉｎｓ。Ｈｙｓｅｒ发现
ＮＳＰ４（４７－９１ａａ）有ｖｉｒｏｐｏｒｉｎ的结构特征，ＮＳＰ４（４７－Ｂｉｏｗｅｓｔ公司产品；Ｂａｘ和Ｂｃｌ一２抗体，美国Ｐｒｏｔｅｉｎ — ９１ａａ）变异体能在内质网形成一个跨膜的水孔，破ｔｅｃｈ公司产品；ＢＣＡ试剂盒、ＲＩＰＡ裂解液、ｃａｓｐａｓｅ－
４
动物医学进展

轮状病毒肠毒素NSP4：一个多功能糖蛋白

不同病毒株基因型的重组ＮＰＳ４蛋白也证实，有不同来源的重所组ＮＰＳ４蛋白对于新生小鼠都具有肠毒素活性。
１２ＮＳ４蛋白的结构特征．Ｐ
一
般认为，在基因型ＡＤ型中其ＮＰ — Ｓ４大部分位于细胞胞
ｄａｒｅ．ＴｅＳ４ｐｏｅｎｏｒｕＡｏｔｖｒｓｈｓｂｅｅｏｎｚｄａｖｒｅｔｒｔｘｎｉｒｈａｈＮＰｒｔｉｆｇｏｐｒａｉａｅｎｒｃｇｉｕｅｓａｉｌａｎｅｏｏｉ．ＴｅｏｓｒｃｕａｒｔｉｈｎｎｔｔｒｐｏｅｎｕｌＮＰｌｙｎｉｏｔｎｌｉｉｐｔｏｅｅｉａｄｍｏｐｏｅｅｉ．Ｉｔｉａｉｌ，ｔｅａｖｎｅｆｔｅｍｕｔｕｃｉｎｌＳ４ｐａｓａｍｐｒａｔｒｅｎｖｒｏｌａａｇｎｓｓｎｒｈｇｎｓｓｎｈｓｒｃｅｈｄａｃｓｏｌｆｎｔａｈｔｈｉｏｇｙｏｒｔｉＰｒｅｉｗｅ．ｌｃｐｅｎＮＳ４ｗｅｅｒｖｅｄｏ
复杂性，Ｓ４对Ｒ的形态发生和致病作用是至关重要的，还ＮＰＶ它可诱发有效的免疫应答，成为有效Ｒ疫苗的发展目标。可Ｖ
个结构蛋白（Ｐ、Ｐ、Ｐ、Ｐ、Ｐ、Ｐ）５个非结构蛋白Ｖ１Ｖ２Ｖ３Ｖ４Ｖ６Ｖ７和（Ｓ１ＮＰ、Ｓ３ＮＰ、Ｓ５。Ｒ非结构蛋白ＮＰＮＰ、Ｓ２ＮＰ、Ｓ４ＮＰ）ＶＳ４由基因片段１（１）码ｌ对ＮＰ０或１编ｌｌ。Ｓ４的研究揭示了这个多功能蛋白的

猪轮状病毒病原学研究进展

84猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2013年第12期猪轮状病毒属于呼肠孤病毒科轮状病毒属，是引起多种新生动物和幼龄动物腹泻的重要肠道病原之一，也是感染1～5日龄仔猪或断奶仔猪的常见病原。

以厌食、呕吐、腹泻和脱水、体重减轻为特征，引起仔猪的死亡，成年猪掉膘，饲料报酬降低，增加人工费和药费的开支等。

若与传染性胃肠炎和大肠杆菌混和感染则病情加重,死亡率增高。

1 猪轮状病毒形态成熟完整轮状病毒粒子略呈圆形，没有囊膜，为65～75 nm 的二十面体对称。

电镜观察，病毒的中央为核酸构成的芯髓，呈致密的六角形棱心，直径为37～40 nm。

轮状病毒粒子由3层衣壳组成：内衣壳（VP2）、中间层衣壳(VP6)和外层衣壳（VP4和VP7）。

中间层衣壳(VP6)有32个呈放射状排列的圆柱形壳粒组成，壳粒由此向外呈辐射状排列。

外衣壳厚约20 nm，为连接于壳粒末端的光滑薄膜状结构，使该病毒形成车轮状外观，轮状病毒为此而得名（见图1、图2）。

在感染的粪样和细胞培养物中存在2种形式的病毒粒子，只有3层衣壳的光滑型（S 型）粒子，具有感染性[1]，直径为75 nm。

外层衣壳被除去，就会导致感染性丧失，表明钙离子通过使外层衣壳VP7稳定，对轮状病毒粒子的稳定性起着关键作用[2]。

不同类型的病毒，稳定外层衣壳所用钙的浓度不一样[3]。

没有外层衣壳的双层粒子（R 型）是很小的，边缘粗糙，直径为65 nm。

病毒核酸基因由11 个不连续的猪轮状病毒病原学研究进展王振玲1，李显和2（1.北京农业职业学院，北京房山 102442；2.北京市大兴区魏善庄镇动物防疫畜牧水产技术推广站，北京大兴 102611）摘要：轮状病毒不仅感染猪、牛、羊、禽等动物，同时还感染人。

轮状病毒的持续存在，不仅严重威胁养殖业的发展，同时威胁到肉食品和人类的安全，成为世界科学家们研究的焦点。

对轮状病毒形态、分类、理化性质和生物学特性、致病机理等病原学等内容进行了综述。

轮状病毒不同基因型NSP4的免疫原性研究

轮状病毒不同基因型NSP4的免疫原性研究
轮状病毒不同基因型NSP4的免疫原性研究
NSP4作为轮状病毒的致泻相关蛋白,其在疫苗研究中的作用近年来深受瞩目.为比较不同基因型非结构蛋白NSP4的免疫原性,构建了四种基因型的重组表达质粒pCI-97B6、pCI-97S36、pCI-97S34和pCI-97SZ8,在细胞水平进行瞬时表达检测后,进一步免疫小鼠,检测血清IgG 抗体滴度和亚型.结果表明利用真核表达质粒表达的NSP4蛋白既可以诱导体液免疫反应,又可以诱导细胞免疫反应,但以体液免疫为主,不同基因型NSP4具有不同的免疫原性.
作者：王大燕王健伟魏强王彦斌屈建国洪涛 WANG Da-yan WANG Jian-wei WEI Qiang WANG Yan-bin QU Jian-guo HONG Tao 作者单位：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,北京,100052 刊名：中国生物工程杂志ISTIC PKU英文刊名：CHINA BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2006 26(4) 分类号：Q789 关键词：轮状病毒 NSP4 免疫原性疫苗。

猪轮状病毒病原学研究进展

养范丨21倍轮状病遵（丨Mrrine r o t a v i r u s , H V )属于呼肠孤病:海科、轮状婉海厲, 是一种引起猪群发生消化道疾病的病#，乂称胃肠炎，一般发生于I ~ 8周龄的仔猪群，引起腹泻、呕吐、食欲废绝、脱水等症状。

猪轮状病毒1974年第一次从猪粪便中分离得到后陆续各N 出现该病逛的报道，呈现全球分布，引起r 世界各国的重视。

而中国是在1982年被阙玲玲在台湾m 欠发现，随后全丨_各省陆续出现该病毒的相关报道。

对于猪轮状病逛还没饤特效的治疗药物，未研制出优质的疫苗，研究前景十分可观作为人畜共患病原，丨《V 极大危害着人类和动物的健康，威胁人类生命健丨康安全，导致巨大的经济损失，是全球范_内一个重要的公共卫生N 题。

1病原学l .i 形态学特征病毒粒子外观为形似车轮的圆形病#粒子，无囊膜，二十面体对称。

电镜观察，病毐粒子中间由核酸构成的芯髓，核酸被32个圆柱形呈放射状排列的壳粒包裹，最外层由光滑的薄层样结构构成，芯髓的大小约37 ~ 40纳米，呈致密的六角形。

病毒粒子由三层衣壳构成，由内层衣壳 (VP 2和VP 3)、中间衣壳(VP 6)、外层衣壳(VP 7 和VP 4)组成。

在感染粪便和细胞培养物中可见具有感染性的三层衣壳病毒颗粒(光滑S 型）和无感染性的双层衣壳病毒颗粒（粗糙R 型），具有S 型的病毒颗粒直径为75纳米，没有外层衣壳的R 型病毒颗粒直径为75纳米。

1.2基因组结构和功能轮状病毒的核酸基因由11个分节段的双链RNA (dsRNA )组成，大小约18.2 kh ,其每个片段大小约为660~3300hp ,被第一层蛋白质外壳(VP 2结构蛋白）和依赖性RNA 聚合酶(VP 1结构蛋白）包裹，编码6种结构蛋白（VP 1〜V I W V F W V F 7)和6种非结构蛋白（NSP 1~ NSP 6),只有第11个节段含有编码NSP 5和 NSP 6的两种开放阅读框(OFK )，其余的节段只含有一种开放阅读框，且只编码一种蛋白。

211246892_轮状病毒NSP4胞质区在杆状病毒系统的表达及其黏膜佐剂效应评价

谢力等轮状病毒NSP4胞质区在杆状病毒系统的表达及其黏膜佐剂效应评价第 5 期轮状病毒NSP4胞质区在杆状病毒系统的表达及其黏膜佐剂效应评价①谢力曾韦锟李臣② 孔璟王纪爱陈伟伟李鸿钧③ 孙茂盛③（昆明学院医学院，昆明 650214）中图分类号 R373.2 文献标志码 A 文章编号 1000-484X （2023）05-0917-05［摘要］目的：应用Bac -to -Bac 杆状病毒系统表达轮状病毒（RV ）非结构蛋白NSP4的胞质区（CF ）片段（47~175 aa ），并初步检测其黏膜免疫佐剂效应。

方法：将RV NSP4-CF 基因片段定向克隆至转座载体pFastBac1，转化DH10Bac 并筛选重组杆粒Bac -NSP4-CF 。

脂质体介导Bac -NSP4-CF 转染sf9细胞，收获细胞并传代培养。

测定病毒滴度，Western blot 检测目的蛋白表达情况。

纯化后的重组NSP4-CF 与卵清蛋白（OVA ）滴鼻共免疫小鼠，并检测其黏膜免疫佐剂效应。

结果：在杆状病毒系统中成功获取了NSP4-CF 重组蛋白，Western blot 检测可见约16 kD 的特异性条带；重组NSP4-CF 与OVA 共免疫小鼠后，小鼠血清OVA 特异性IgG 、IgA 抗体水平与肠道SIgA 水平较OVA 单独免疫组均有升高（P <0.05）；ELISPOT 检测结果表明NSP4-CF 佐剂组（5 µg ）分泌IFN -γ的脾细胞平均数均高于OVA 组（P <0.05）。

结论：经昆虫细胞表达系统可获得RV NSP4胞质区（47~175 aa ）重组蛋白，该蛋白与模式抗原经黏膜途径免疫小鼠具有增强系统免疫应答与黏膜免疫应答的佐剂活性，为进一步研究RV -NSP4佐剂活性区域及其分子机制提供了实验基础。

［关键词］佐剂；轮状病毒；NSP4胞质区；杆状病毒；黏膜免疫Expression of rotavirus NSP4 cytoplasmic fragment in baculovirus system and its mucosal adjuvant effectsXIE Li ， ZENG Weikun ， LI Chen ， KONG Jing ， WANG Ji'ai ， CHEN Weiwei ， LI Hongjun ， SUN Maosheng. Medical School of Kunming University ， Kunming 650214， China［Abstract ］ Objective: To express cytoplasmic fragment （CF ）of rotavirus （RV ） NSP4 protein （47~175 aa ） by applying Bac -to -Bac baculovirus vector system ， and evaluate mucosal adjuvant effects of this recombinant protein. Methods: RV NSP4-CF gene frag⁃ment was directional cloned into shuttle vector pFastBac1， then pFastBac -NSP4-CF plasmids were transformed into E.coli DH10Bac cells. Recombinant bacmid Bac -NSP4-CF was selected to transfect sf9 insect cells via lipofectin reagent. Sf9 cells were harvested and passaged serially. The virus titers were determined ， and recombinant NSP4-CF protein was analyzed by Western blot. Afterwards ，mice were immunized by model antigens ovalbumin （OVA ） with purified NSP4-CF so that the antigen -indued mucosal immune and adjuvant effects of NSP4-CF could be evaluated. Results: Recombinant protein of NSP4 cytoplasmic region was successfully expressed in bacu⁃lovirus system ， and a specific band of 16 kD was detected by Western blot. Levels of mouse serum OVA specific IgG ， IgA antibody and intestinal SIgA immunized with recombinant NSP4-CF and OVA were significantly higher than those in OVA alone immunization group （P <0.05）. Results of ELISPOT assay showed that average number of splenocytes secreting IFN -γ in NSP4-CF adjuvant group（5 µg ） was higher than that in OVA group （P <0.05）. Conclusion: Recombinant protein of RV NSP4-CF （47~175 aa ） can be obtainedby insect cell expression system. The protein has adjuvant properties to enhance systemic and mucosal immune responses via mucosal route in mice. This provides experimental basis on further research to locate its bioactivity region and clarify the adjuvant effects mecha⁃nism of the RV -NSP4. .［Key words ］ Adjuvant ；Rotavirus ；NSP4 cytoplasmic fragment ；Baculoviru ；Mucosal immunity添加安全高效的佐剂是解决黏膜疫苗有效应答不足的首选策略。

我国各血清型轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分析

我国各血清型轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分
析
徐倏;王健伟;张忠浩;何金生;董京芳;温乐英;洪涛
【期刊名称】《中华实验和临床病毒学杂志》
【年(卷),期】2001(015)002
【摘要】目的对我国血清学调查中发现的四型(G型)轮状病毒NSP4序列进行测定和分析，了解NSP4的基因类型和变异状况。

方法利用银染测序方法对G1、G2、G3、G9型毒株NSP4 Cdna序列进行测定。

结果四个血清型毒株NSP4的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为78.8%，93.5%；83.0%，95.5%。

G1、G3、G9型标本多属Wa组；G2型标本多属KUN组。

NSP4的变异主要位于VP4结合域内的135-145位氨基酸。

结论Wa组和KUN组是我国主要的两种NSP4基因型。

【总页数】3页(P132-134)
【作者】徐倏;王健伟;张忠浩;何金生;董京芳;温乐英;洪涛
【作者单位】中国预防医学科学院病毒学研究所形态室;中国预防医学科学院病毒学研究所形态室;北京友谊医院儿科;中国预防医学科学院病毒学研究所形态室;中国预防医学科学院病毒学研究所形态室;中国预防医学科学院病毒学研究所形态室;中国预防医学科学院病毒学研究所形态室
【正文语种】中文
【中图分类】R37
【相关文献】
1.我国人轮状病毒不同基因型NSP4的致病性研究
2.轮状病毒非结构蛋白NSP4研究进展
3.2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析
4.人轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分析
5.轮状病毒我国地方株NSP4基因与病毒毒力关系的探讨
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轮状病毒非结构蛋白与病毒复制相关性研究进展

轮状病毒非结构蛋白与病毒复制相关性研究进展杨梅【期刊名称】《临床儿科杂志》【年(卷),期】2011(29)9【摘要】Rotavirus is composed of six structural proteins and six nonstructural proteins. Six structural proteins comprise the intact virus particles. Six nonstructural proteins are expressed merely in the ce[is infected with rotavirus,but not expressed in the mature viral particle. They only play roles in the viral replication. This article summarizes the roles of nonstructural proteins in the process of viral replication.%轮状病毒由6个结构蛋白和6个非结构蛋白组成.6个结构蛋白架构了整个病毒颗粒,6个非结构蛋白仅仅在轮状病毒感染的细胞中出现,而不出现在成熟的病毒结构中.非结构蛋白只是在病毒复制过程中发挥作用.该文就轮状病毒6种非结构蛋白在病毒复制过程中所起的作用作一综述.【总页数】3页(P895-897)【作者】杨梅【作者单位】蚌埠医学院第一附属医院儿科,安徽蚌埠,233004【正文语种】中文【中图分类】R725【相关文献】1.Viperin蛋白可通过影响非结构蛋白与脂筏的关联抑制丙型肝炎病毒复制 [J], 吴显芳;王珊珊;潘婷婷;易志刚;袁正宏2.轮状病毒非结构蛋白NSP4研究进展 [J], 王大燕;于修平;王健伟;洪涛3.水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns6在病毒复制中的功能 [J], 陈倩;张玲华;黄海宁;魏太云;谢联辉4.水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns6在病毒复制中的功能 [J], 陈倩;张玲华;黄海宁;魏太云;谢联辉;5.细胞RNA解旋酶DDX1与冠状病毒非结构蛋白14相互作用并促进病毒复制[J], Xu L因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

猪轮状病毒NSP4基因原核与真核表达载体的构建及其表达研究的开题报告

猪轮状病毒NSP4基因原核与真核表达载体的构建及其表
达研究的开题报告
猪轮状病毒是一种常见的猪类消化道病毒，其中NSP4基因编码一种子细胞定位在内质网膜上的糖蛋白，与病毒致病性密切相关。

本文旨在构建猪轮状病毒NSP4基
因原核与真核表达载体，并利用这些载体进行NSP4的表达研究。

首先，我们将利用RT-PCR技术从猪轮状病毒基因组中扩增NSP4基因，并克隆
至pGEX-4T-1原核表达载体中。

在此基础上，我们将利用PCR技术扩增NSP4基因并克隆至pET-28a(+)真核表达载体中，并在大肠杆菌中进行过表达。

通过蛋白质SDS-PAGE电泳和Western blotting技术，我们将验证NSP4蛋白的表达情况及其确切的分
子量。

接下来，我们将通过细胞共转染技术将NSP4基因真核表达载体转移到Vero E6
细胞中，以验证NSP4蛋白在真核细胞中的表达情况以及其在内质网膜上的定位情况。

利用免疫荧光染色技术，我们将观察NSP4蛋白在细胞中的分布情况，并与内质网膜
标记物进行共定位实验。

最后，我们将采用ELISA技术检测NSP4蛋白在不同时间点及不同浓度下在细胞中的表达情况，并进行相关数据分析，以进一步探究NSP4蛋白在猪轮状病毒致病过
程中的作用及其分子机制。

本研究将为近年来猪轮状病毒的研究提供新的实验手段，为病毒致病机理的深入研究提供新思路。

2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析

2007年至2008年昆明地区腹泻患儿轮状病毒非结构蛋白基因特征的分析刘梅;杨娟;赵亚玲;侯宗柳;戚勤;周丽芳;黄永坤【期刊名称】《昆明医科大学学报》【年(卷),期】2012(033)002【摘要】目的探讨轮状病毒非结构蛋白(NSP4)基因的特征及变异情况.方法在2007年和2008年昆明医学院第一附属医院儿科住院的96例秋冬季腹泻患儿中,随机选取轮状病毒阳性的12例(其中2007年6例,2008年6例)患儿粪便标本,采用RT-PCR扩增NSP4基因,并进行测序,测序结果用DNAassist软件对核苷酸序列进行翻译,并用Clustal-mp软件与Genbank Datebase中的4株人RV(Wa、KUN、AU-1、Hochi)、3株动物RV(EW、OSU、SAll)和中国北京、上海、广州的流行株的NSP4序列进行分析比较.结果 (1)选取的2007年6份和2008年6份样本均可以扩增出NSP4的全长片段,测序表明:2007年6份样本中有5株属于Wa株,1株属于KUN株;2008年6份样本中也有5株属于Wa株,1株属于KUN 株.10株Wa株与来自GenBank Database的4株人RV(wa、KUN、AU-1、Hochi)和3株动物RV(EW、OSU、SAll)同源性分别为96.3%、85.3%、84.7%、95.1%和57.7%、92%、82.8%,与中国北京、上海、广州的流行株同源性均在95%以上;2株KUN株与以上来自GenBank Database的标准株的同源性分别为85.3%、98.2%、82.8%、85.9%、60.1%、85.3%、94.3%,和其他地区流行株的同源性为85%左右; (2)以Wa株为参考,10株Wa株的NSP4基因变异发生在第34位氨基酸,第76位氨基酸,第141位氨基酸,第145位氨基酸,第161位氨基酸和第169位氨基酸;以KUN株为参考,2株KUN株的NSP4基因变异仅在第87位氨基酸和第140位氨基酸.结论 2007年和2008年昆明地区流行株NSP4基因为Wa组和KUN组,以Wa组为主.%Objective To study the genetic characteristics and genetic variation of the nonstructural protein NSP4 of Human rotavirus strains. Methods We selected twelve positive RV samples among 96 infants with diarrhea who were hospitalized in the Department of Peadiatrics, the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University from October to December in 2007 and 2008. NSP4 genes was amplified by RT- PCR and then cDNAs were sequenced. The homology of the nucleotide sequences of the NSP4 genes were analyzed by DNA assist and Clustal-mp. Results (1) NSP4 gene was amplifie from 12 (6 of 2007 and 6 of 2008) RV positive samples. Among the twelve Kunming strains, the nucleotide homologies of the ten Wa strains to the four HRV standard strains(Wa, KUN, AU-1 and Hochi) and three animal RV (EW, OSU and All) were 96.3%, 85.3%, 84.7%, 95.1% and 57.7% , 92%, 82.8%. Compared with the epidemic strains in other different areas of China, the nucleotide homology of the NSP4 gene was over 95%. Compared with the standard strains from the above GenBank Database, the nucleotide homology of the two KUN strain were 85.3%, 98.2%, 82.8%, 85.9% and 60.1%, 85.3%, 94.3%. And compared with the epidemic strains other different areas of China, the nucleotide homology of the NSP4 gene was about 85%. (2) 6 unique conserved amino acids of 10 Wa strains differing from Wa at aa34, aa76, aal41, aal61 and aal69 were identified within NSP4; 2 unique conserved amino acids of 2 KUN strains differing from KUN at aa87 and aal40 were identified within NSP4. Conclusions Among the NSP4 of the twelveKunming strains, the genotypes are Wa strain and KUN strain. The most dominant genotype ofNSP4 is Wa strain.【总页数】4页(P80-83)【作者】刘梅;杨娟;赵亚玲;侯宗柳;戚勤;周丽芳;黄永坤【作者单位】昆明医学院第一附属医院儿科,云南,昆明,650032;昆明医学院第一附属医院儿科,云南,昆明,650032;昆明医学院第一附属医院儿科,云南,昆明,650032;昆明市延安医院中心实验室,云南,昆明,650000;昆明医学院第一附属医院儿科,云南,昆明,650032;昆明医学院第一附属医院儿科,云南,昆明,650032;昆明医学院第一附属医院儿科,云南,昆明,650032【正文语种】中文【中图分类】R723.11【相关文献】1.深圳地区腹泻患儿A群轮状病毒感染情况分析 [J], 阳红梅;刘秀菊;裴园园;冉健2.西安地区学龄前腹泻患儿轮状病毒快速检测分析 [J], 毛瑞;曹三成;刘婉;宁沛雯;王娟3.郴州地区腹泻患儿感染A群轮状病毒的特点分析 [J], 史文元;徐桂珍;徐玉娟;朱军民4.温州地区767例腹泻患儿A群轮状病毒感染分析 [J], 陈韩;李小龙;王薇薇;郑文静;王金果;余方友5.烟台地区2013年腹泻患儿轮状病毒、肠道腺病毒病原学检测结果分析 [J], 朱铭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

轮状病毒非结构蛋白4的克隆、表达及其对胞内钙离子的干扰

轮状病毒非结构蛋白4的克隆、表达及其对胞内钙离子的干扰林玲;张盼;林祥芳;刘彩霞;杨锦红;李向阳【期刊名称】《中华微生物学和免疫学杂志》【年(卷),期】2013(000)008【摘要】目的构建轮状病毒（rotavirus， RV）非结构蛋白4（nonstructural protein 4， NSP4）和其第86～175位氨基酸肽段（86 to 175 amino acid peptide of nonstructural protein 4， NSP486-175）基因的原核表达系统，初步证实重组表达产物的生物学活性。

方法胶体金法筛选A组轮状病毒抗体阳性粪便，提取病毒RNA并逆转录为cDNA，PCR扩增出NSP4和NSP486-175基因，插入到表达载体pET-28a （＋）。

构建pET-28a（＋）-NSP4和pET-28a（＋）-NSP486-175原核表达载体，转化E．coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，Ni-NTA亲和层纯化及Western blot 鉴定。

Fluo-3 AM标记Caco-2细胞内游离的Ca2＋（ in-trancellular calcium，[Ca2＋]i），激光共聚焦显微镜检测NSP486-175蛋白对[Ca2＋]i的效应。

结果 NSP4和NSP486-175 DNA测序结果与 NCBI 中相关基因一致。

完整的 NSP4在大肠埃希菌中难以表达。

NSP486-175蛋白主要以可溶性方式存在，相对分子质量为10000。

外源性添加NSP486-175蛋白至Caco-2细胞荧光强度和分布改变。

结论构建了pET-28a（＋）-NSP4和pET-28a（＋）-NSP486-175表达载体，目的蛋白能够导致细胞内游离的Ca2＋失衡，初步证实具有生物学活性，可进一步用于轮状病毒致病机制及疫苗的相关研究。

%Objective To construct prokaryotic expression systems of genes of intact rotavirus non -structural protein 4 (NSP4) and 86 to 175 amino acidpeptide of NSP4 (NSP486-175) and to identify the bio-activities of the recombinant expression products .Methods Colloidal gold assay was used to screen group A rotavirus antibody-positive stools , from which the viral RNA was extracted and transcribed into cDNA .Then NSP4 gene andNSP486-175 gene were amplified by PCR and inserted into pET-28a(+) vector to construct the prokaryotic expression plasmids of pET-28a(+)-NSP4 and pET-28a(+)-NSP486-175 , which were transformed into E.coli BL21( DE3) and inducted by IPTG .The expressed NSP486-175 protein was purified by Ni-NTA af-finity chromatography and examined by Western blot .Fluo-3 AM ester was used to label intracellular free Ca2+( [ Ca2+] i) in Caco-2 cells and laser scanning confocal microscopy was performed to detect the effect of NSP486-175 protein on [Ca2+]i.Results DNA sequencing indicated that NSP4 gene and NSP486-175 gene were consistent with the corresponding sequences in NCBI .The intact NSP4 had difficulty in expressing in E.coli. NSP486-175 protein mainly existed in soluble form with a relative molecular weight of 10×103 .Fluorescence in-tensity and distribution were changed by exogenous addition of NSP 486-175 to cultured Caco-2 cells.Conclu-sion The expression vectors of pET-28a(+)-NSP4 and pET-28a(+)-NSP486-175 were successfully construc-ted and the target protein could induce [Ca2+]i imbalance.This phenomenon preliminarily indicates that the prokaryotic expressed NSP486-175 protein has biological activity and can be further used to elucidate rotavirus pathogenic mechanisms and perform vaccine research .【总页数】6页(P568-573)【作者】林玲;张盼;林祥芳;刘彩霞;杨锦红;李向阳【作者单位】325000 温州医学院附属第二医院检验科;325000 温州医学院附属第二医院检验科;325000 温州医学院附属第二医院检验科;325000 温州医学院附属第二医院检验科;325000 温州医学院附属第二医院检验科;325000 温州医学院附属第二医院检验科【正文语种】中文【相关文献】1.黄鳝生长激素基因cDNA的克隆及胞内真核表达载体的构建2.shRNA干扰肝癌细胞Kir6.2基因表达对细胞内钙离子浓度的影响3.三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因克隆及其表达分析4.干扰水稻瘤矮病毒（RGDV）非结构蛋白（Pns12）的表达抑制病毒在介体昆虫培养细胞内的复制5.PTEN表达下调对神经元胞内游离钙离子和神经元凋亡的研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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征与ＮＳＰ４基因型别的相关性。由于在ＲＶ感染后有针对ＮＳ４蛋白的免疫反应，同的Ｐ不ＮＳ４蛋白可能有不同的抗原性，为对ＮＳ４Ｐ因Ｐ
状病毒的基因组由ｌ１个双链ＲＮＡ节段组成，
一
２１ＮＳ４促进单壳颗粒进入内质阿腔及获．Ｐ得外层衣壳。研究提示口 “ＮＳ４是新型跨有］Ｐ
ＥＲ膜糖蛋白，作为胞浆中Ｉ的细胞内受可ＣＰ体，在ＩＰ出芽进入ＥＲ腔的过程中发挥辅并Ｃ助作用，用缺失突变和单克隆抗体技术已确利认了ＮＳＰ４的两个功能区：个是ＩＰ结合区．一Ｃ
型间差异较大而被列为新的一型，Ｐ４ＮＳＤ有
国外医学病毒学分册
轮状病毒非结构蛋白ＮＳ４研究进展Ｐ
山大医荤预科熹毒研所０主嚣综修校东学学蓦学荤学究形２主述洪坪中防学病（２１健国医院￣５室伟ｈ０）＆态室王审
［摘要］￣（ｏａｉｓＲＶ）病毒性愎泻的主要病因。ＮＳ４ｎｎｔｕｔｒｌｒｔｉ）为轮状病毒ｒｔｖｒ，ｕ是Ｐ（ｏｓｒｃｕａｐｏｅｎＩ作
内质网腔而同时获得一暂时性外膜，由ＶＰ并４和ＶＰ７形成病毒的外壳蛋白。
型。三型均含有一个ＯＲＦ并编码一含１５氨这７基酸的蛋白。Ｃｎｉｅ等的研究与上述结果ｕｌｆｆ
（ｎｏｌｓｃｒｔｕｕ，Ｒ）以出芽方式进入ｅｄｐａｍｉｅｉｌｍＥ，ｃ
ＮＳＢ则为７０ｂ，种差异是Ａ型基因３Ｐ４５ｐ这端非编码区单碱基的插入造成的。恒河猴ＲＶ
株（ＲＲＶ）然也是７１ｐ但它与其它株ＲＶ虽５ｂ，的同源性仅为８～８１，以披列为ＮＳＣ所Ｐ４
cunliffe等33的研究与上述结果一致也将nsp4划分为3个基因型并发现对应于1634位氨基酸和131148位氨基酸的区域变异较大而且4株动物和两株人一动物共患rv株的nsp4基因分别归于其中的一型显示了人与动物轮状病毒nsp4基因在进化上的密切关系
维普资讯
基因型，分别命名为ＮＳＡ、ＮＳＢ和Ｐ４Ｐ４ＮＳＣ。各型的型内核苷酸同源性均大于Ｐ４９％。ＮＳ４型的基因长度为７ｌｐ，０ＰＡ５ｂ而
基因型的研究有助于研究宿主的免疫反应机制
致，将ＮＳ４划分为３个基因型，发现对也Ｐ并
应于１￣３６４位氨基酸和１１１８位氨基酸的３￣４区域变异较大，且４株动物和两株人一物共而动患ＲＶ株的ＮＳＰ４基因分别归于其中的一型，显示了人与动物轮状病毒ＮＳＰ４基因在进化上的密切关系。进一步研究一发现，了上述３又除种ＮＳ４基因型外，Ｐ鼠的ＮＳ４序列与Ａ、ＣＰＢ、
起２岁以下儿童死亡的人数为８．７３万人。轮
发现只存在两个ＮＳ４基因型，基因型与患Ｐ但
儿是否有腹泻症状无关。过对３不９株从美国分离的人ＲＶ（ＨＲＶ）ＰＮＳ４基因分型，现存发在三型，Ａ型和Ｂ型为主，且同年分离的以并ＲＶ株有更高的同源性。Ｐ４基因各型既包括ＮＳ症状型又包括无症状型株，发现病毒毒力特未
ＮＳＰ４蛋白由基因１０编码。态发生中的作用，年来．近随着研究的深入，现其在ＲＶ致病机理和新发
型疫苗开发方面也扮演重要角色。
１ＮＳ４的基因特征ＰＫｉｋｏｒｗｏｄ等ｕ析了１分８株人和动物ＲＶ（中包括１其３株细胞培养适应株）Ｐ４的ＮＳｅＤＮＡ序列，现可分为２个主要及一个次要发
和ＨＢ的疫苗设计。随着研究的进展，能还Ｖ可会有新的ＮＳ４基因型披发现。Ｐ
２ＮＰＳ４与轮状病毒形态发生ＲＶ有其独特的成熟过程。首先形成亚病
毒单壳颗粒，称内层壳粒（ｎｅａｓｄ也ｉｎｒｃｐｉｐｒｉｌ．ＣＰ）Ｉ趋向增生和扩大的内质网ａｔｅＩｃ，ＣＰ
的一种非结构蛋白，病毒形态发生和致病性中发挥重要作用，年来日益受到重视。本文就ＮＳ４的研究进展作在近Ｐ
一
综述。
轮状病毒（ＲＶ）人和动物病毒性腹泻的是最主要病因，发展中国家，状病毒引起的儿在轮童严重腹泻约占腹泻住院病例的ｉ３每年引／，