重金属胁迫对作物DNA胞嘧啶甲基化的影响

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嘧啶转移酶的活性有所降低，但 % & 甲基胞嘧啶含量 却迅速升高 。 )*+ ,- ./0/123 4 认为叔丁基氢过氧化 铁 5 6782 & 9/2:; <:=83>783+*=7 & *83? 5 !@ @ 也能引起小
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DJ #J ! 叶片蛋白质提取和含量测定 分别称取蔗糖 DDJ C$ 0， 68*1"J L"L 0，抗坏血酸 半胱氨酸 "J "! 0， 氯化镁 "J "# 0， 定容至 D"" "J "$$ 0， 将 >) 调为 OJ E， 作为蛋白质提取研磨介质。 IP， 待胁迫处理 O = 后，分别称取经处理的小麦和水 稻剑叶 "J % 0，按 DQ E 的比例加入上述预冷的研磨介 质，在冰浴上研磨成匀浆，DL """ 8・I*? & D 冷冻离心 取上清液备用。 D" I*?， 采用考马斯亮兰 5 R#%" @ 染色法对各处理叶片中 的蛋白质含量进行测定。并将测定结果计算成 I0・ 0 & D ST。 DJ #J E AB. 提取 现代植物生理 AB. 提取采用 G6.M 法进行 5 见 《 学实验指南 》 ，科学出版社， DCCC 年 @ 。最后将沉淀 AB. 溶于 %" "P 6N 中， & #" U 保存备用。 DJ #J % AB. 中 % & 甲基胞嘧啶 5 %IG @ 百分含量测定 样品水解：取上述 AB. 样品 #" "P，加入 #" "P 在 $" U 水浴上水解 # <， 再加入 "J # I3;・P & D 的 )G;， &D ・ 的 中和水解液，离心取上 D" "P "J E I3; P BK4) 清液备用。 % & 甲基胞嘧啶含量测定：采用高效液相色谱法 进行 % & 甲基胞嘧啶百分含量的测定。色谱柱为 GD$ 键合柱 5 #%" II V DL II @ ，流动相由 %W 甲醇、EJ O% 并用磷酸 II3; 己烷基磺酸钠及 "J #W 三乙醇胺组成， &D 将 >) 值调为 %J %。流速为 "J O IP・I*? ， 检测波长 为 #O! ?I， 进样量为 #" "P。采用外标准和内标准法 确定胞嘧啶 5 G @ 和 % & 甲基胞嘧啶 5 %IG @ 的峰位。采 用外标准法， 通过比较样品和标样的峰面积确定胞嘧 啶和 % & 甲基胞嘧啶的含量。并根据式 %IG X 5 G H %IG @ V D""W 计算 %IG 百分含量。
牛胸腺 AB. 的甲基化水平提高
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。在植物学中也已
有一些有关 AB. 甲基化功能 ’ ! 、D" & D# ( 、 AB. 甲基化遗 传 ’ D! ( 、 AB. 甲基化转移酶的类型和结构 ’ DE ( 、 AB. 中 甲基胞嘧啶的分布 正常发育
’ D" ( ’ D% (
等的研究报道。一些研究证实
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。 ,-. 甲基化可能还与外来
基因的识别、 转基因沉默、 生物防御、 人类某些疾病有
收稿日期 ( !""! * ") * !< 作者简介 ( 葛才林 % $0<! — ’ ， 男， 江苏扬州人， 副教授， 在读博士， 主要 从事生物物理和作物逆境生理研究。
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葛才林等 Y 重金属胁迫对作物 AB. 胞嘧啶甲基化的影响
改变 AB. 甲基化水平能改变植株形态、影响植株的 。至于重金属胁迫对作物体内各器官 AB. 甲基化模式有何影响目前还未见报道。作者的 研究表明， 一定浓度的重金属胁迫能引起作物体内蛋 白质含量持续降低， 一些关键酶的活性也持续下降。 这一现象除了与重金属胁迫引起 AB. 损伤有关外， 是否还与 AB. 甲基化模式的改变有关 F 为此， 分别测 定了不同浓度的 ! 种重金属 5 G/# H 、 G=# H 、 )0# H @ 胁迫 对 小 麦 和 水 稻 各 器 官 AB. 中 % & 甲 基 胞 嘧 啶 含 量 5 %IG @ 的影响。
近年来，对 ,-. 甲基化修饰的研究已成为分子 生物学中的一个热点问题。法、 英、 美、 丹麦科学家的 联合研究证实， ,-. 甲基化是控制基因活力的主要 方式， 它对胚胎发育是否正常起着决定性作用。目前 认为， ,-. 甲基化具有下列生物功能： ,-. 甲基化可 调控基因表达， 控制胚胎发育。基因中的启动子和编 码区的过度甲基化能抑制基因的转录， 而去甲基化则 有利于基因表达。,-. 甲基化决定着染色体的结构 # ,-. 低甲基化可使染色质凝聚发生障碍，干扰中期 染色体的分离， 促进染色体不稳定， 使染色体断裂、 易 位和丢失 。,-. 甲基化可能还涉及到 ,-. 的复制
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调控和损伤修复的识别， 如甲基化可能控制复制原始 点的识别和利用， 也可能是错配修复系统中模板链和 新生链的识别标志 关。 许多研究表明， 重金属胁迫能对生物体内的生理 过程产生严重影响， 其原因不仅与重金属胁迫引起蛋 白质损伤有关， 也与 ,-. 损伤有关。 现已证实重金属 胁迫能引起 ,-. 断裂、 交联和 ,-. 期外合成 ‘ + * = a 。 有 关重金属对生物体内 ,-. 甲基化水平的影响，目前 的研究报道主要集中在医学领域， 重金属及过渡金属 络合物引起的人或实验动物细胞内 ,-. 甲基化水平 的改变。 如 :KK DN# VP84@E :# 18MR@ b 的研究表明， 重 金属镍处理中国仓鼠虽然在短期内使细胞中甲基胞
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材料和方法
DJ D 材料 供试重金属： G/# H 5 G/,4E ・%)# 4 @ ， G=# H 5 G=G;# ・ 均为化学纯。 #J %)# 4 @ ， )0 &)0 5 G)! G44 @ # ( ， 胞嘧啶和 % & 甲基胞嘧啶标样：色谱纯，由浙江
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大学核农学研究所提供 5 购自 ,*0IK 公司 @ 。 供试作物和品种： 水稻 5 !"#$% &%’()% @ 品种为扬稻 L 号 5 籼稻型 @ 及 C%DL 5 武育粳系列 - 粳稻型 @ ；小麦 5 *"(’(+,- ./0’(),- @ 品种为扬麦 D" 号。 DJ # 方法 DJ #J D 供试作物的培养 采用木村 M 培养液将准备移栽的稻苗和越冬后 的麦苗分别转移到培养液中进行水培， 培养液中的柠 檬酸铁换成相同浓度的 NA6. & 铁。在对水稻进行培 养时， 培养液中加入一定浓度的硅酸钠， 并将培养液 在对小麦进行培养时， 将培养液 >) 值调为 %J " 左右。 并用气泵向培养液增氧。每隔 O >) 值调为 LJ $ 左右， = 换培养液一次。 DJ #J # 重金属离子胁迫处理 待进入抽穗开花期，各选取长势、长相一致的 ! 株小麦， 将其转移到分别含有 "、 "J "%、 "J D、 "J !、 "J %、 DJ "、 #J " II3;・P G/ 、 G= 、 )0 的培养液中进行 胁迫处理； 同样各选取 ! 株水稻， 转移到分别含有 "、
农业环境保护 !""!# !$ % & ’ ( )"$ * )"+
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重金属胁迫对作物 ,-. 胞嘧啶甲基化的影响
葛才林 $，杨小勇 $，刘向农 !，孙锦荷 )，罗时石 $，王泽港 $
% $/ 扬州大学农学院， 江苏 扬州 !!+""0 ； 江苏 扬州 !!+""0 ； !/ 扬州大学测试中心， 浙江 杭州 )$""!0 ’ )/ 浙江大学核农学研究所，
!""#$% &" ’#()* +#%(, -%.#// &0 1#)#,/ &" +#%2*,(%3&0 30 456 &" 7.&8
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摘
要： 采用水培试验方法， 研究了重金属胁迫对小麦水稻 ,-. 胞嘧啶甲基化的影响。结果表明， 和对照相比， 12! 3 、
即引起叶和穗 ,-. 高甲基 14! 3 、 56! 3 能明显使小麦和水稻地上部叶片和幼穗中的 + * 甲基胞嘧啶 % +71 ’ 的含量增高， 化。 "/ $ 、 "/ + 7789・ : * $ 的 12! 3 和 14! 3 胁迫能使小麦根系 ,-. 中的 + * 甲基胞嘧啶的百分含量显著高于对照，而各 供试浓度的 56! 3 以及 $/ " 7789・ : * $ 的 12! 3 和 14! 3 胁迫则造成小麦根系 ,-. 中的 + * 甲基胞嘧啶的百分含量显著低 于对照， 使 ,-. 低甲基化。 关键词： 重金属胁迫；作物； ,-. 甲基化 中图分类号： ;+")/ !)$ 文献标识码： . 文章编号： $""" * "!<= % !""! ’ "& * ")"$ * "+
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结果与分析பைடு நூலகம்
#J D 重金属胁迫对小麦和水稻叶内蛋白质含量的影 响 图 D 和图 # 分别表示不同浓度的 G/# H 、 G=# H 、 )0# H 胁迫对小麦和水稻剑叶中可溶性蛋白含量的影 响。从图中可看出： 随 G/# H 、 G=# H 、 )0# H 浓度的增高小 麦和水稻剑叶中可溶性蛋白含量逐步下降， 尤其在较 低离子浓度范围内， 小麦和水稻叶中的蛋白质含量随 重金属胁迫 G/# H 、 G=# H 、 )0# H 浓度的提高而迅速降低。 引起的小麦和水稻叶内蛋白质含量的降低， 可能源于 其对基因表达的抑制， 进而抑制蛋白质合成。一方面 可能由于重金属胁迫导致 AB. 的损伤，另一方面可