连续监测法测定酶活性浓度 医学课件
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（二）IFCC推荐的测定方法
以色素原GCNA为底物，甘氨酰甘氨酸为受体，GGT催化γ谷氨酰基团从GCNA转移至甘氨酰甘氨酸上，并游离出2-硝基 -5-氨基苯甲酸。后者的生成量与样品中的GGT活性成正比关 系，故测定405nm处的吸光度增量可计算出GGT的活性。
GCNA 双甘氨酸 pGHG7T.72 硝基 5 氨基苯甲酸 L 谷氨酰 甘氨酰甘氨酸
第14页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
②2-硝基-5-氨基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为 7.96×103（pH为7.70），受pH和温度影响较大。若选择 401nm或405nm时需注意校正。
③由于产物摩尔消光系数较小，样品用量大，样品体积 分数0.0909，为了样品和反应液在37℃平衡，故需要孵育时 间180s和底物启动模式。
（一）测定方法概述
γ-L-谷氨酰对硝 基苯胺为底物
L-γ-谷氨酰-α（β） -萘胺为底物
方法灵敏度低， 底物溶解度差， 受溶血干扰较 大
可以连续监 测，有较好 的灵敏度和 准确性，但 底物溶解度 差
L-γ-谷氨酰-3-羧 基-4-硝基苯胺为
底物
IFCC推荐方 法
第12页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
CNPF AFU CNP(黄色) L - 岩藻糖
第22页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
CNPF法所采用CNP的解离常数(pKa)5.5与AFU的最适pH相 近，缩短了反应时间，无需样本空白，实现了AFU的连续监测 法测定。提高pH可提高CNP的离子化率，但过高的pH会影响 酶活性；该方法操作简便，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都 有所提高。溶血仍有干扰。
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
连续监测法
色素原 底物反
应
过氧化 物酶参 与反应
特殊反应
第5页
脱氢酶 参与反
应
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
第一节 色素原底物反应的连续监测法
水解酶类或转移酶类经酶促反应将无颜色的底物转变为有颜色的 产物，在一定波长具有吸收峰，通常把这类底物称为色素原底物。 特点是水解之前无颜色，水解之后释放的产物有色。 这类底物大多有自行慢慢分解的特点，因此要求底物避光保存， 检测的初始吸光度不能高于0.5。
在碱性溶液中ALP催化无色的4-NPP分裂出磷酸基团，生 成游离的对硝基苯酚(4-nitrophenol, 4-NP)，后者在碱性溶液 中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处连续 监测吸光度增高速率，计算ALP活性。
4 - NPP AMP ALP4 - NP X - OPO3H2
第9页
第6页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
一 碱性磷酸酶測定 二 γ-谷氨酰基转移酶测定 三 淀粉酶测定 四 α-岩藻糖苷酶测定 五 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶测定 六 甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定
第7页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
一、碱性磷酸酶測定 （alkaline phosphatase，ALP）
布氏法： ALP 作用于β-甘油磷酸钠产生磷酸根，定量磷 测定酶活性。少用 金-阿法：以磷酸苯二钠为底物， 经ALP作用生成酚，定 量酚测定活性。少用 皮-劳法：以4-硝基酚磷酸钠盐为底物，水解生成对硝基 酚，碱性条件下呈黄色，连续监测。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）IFCC推荐的测定方法
4-NP G7 AMS 4-NP G4,3 ,2 G5,4 ,3
4-NP-G4,3 ,2 葡萄 糖苷酶 4-NP-G4 G 4-NP
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
用半乳糖-2-氯-4-硝基苯酚-α-麦芽糖做底物，评价基本与 CNP-G3一样，而且不受内源性α-葡萄糖苷酶的干扰。明显的 溶血会使结果偏低，而高浓度的免疫球蛋白（Ig G>50g/L）会 对结果带来正向干扰。不管用何种方法，脂性血清中脂蛋白 会导致AMS结果偏低。另外，临床中还应注意巨淀粉酶血症 的存在，输注的羟乙基淀粉或右旋糖酐会导致巨型复合物的 产生。
3.多功能α-葡萄糖苷酶对PNP-G7的所有降解产物都有相同的 转换率，可以直接用PNP的摩尔吸光系数计算酶活性。
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第▣三二十、四章α-岩连续藻监糖测法苷测定酶酶测活性定浓（度 alpha-L-fucosidase，AFU）
（一）方法概述
荧糖苷底 物法
②以L-γ-谷氨酰对硝基苯胺（GNA）为底物，双甘氨酸为谷氨酰基的 受体，产物在碱性环境下呈黄色，可以连续监测，有较好的灵 敏度和准确性，但底物溶解度差,现已不推荐。
③以L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺（GCNA）为底物，GGT催化生成 的对硝基苯胺在碱性环境下呈黄色。
第11页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
第3页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
酶活性浓度的测定在临床生化检验中占有重要的地位，约 占测定总量的1/4到1/3。 测定方法主要有定时法和连续监测法两种。
– 由于定时法难以确定在选定的反应时间内是否处于线性期，反应 的时间都较长，检测效率低，因此，临床大多用连续监测法来测 定酶活性浓度。
第4页
第15页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
三、淀粉酶测定(α-Amylase, AMS)
（一）方法概述
以天然淀粉为底物：样品稀释法、时间滴定法、碘淀粉比 色法等。但天然淀粉的分子结构与葡萄糖的组成不确定而难 以标准化，测定的准确性和重复性都较差，而且线性范围窄 ，测定误差大。
α-葡萄糖苷酶-己糖激酶-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联法是最 早使用的连续监测法。
从理论上说这是一种最理想的测定方法，但易受内源性α葡萄糖苷酶的干扰。尿标本中细菌污染偶尔会干扰反应。
第17页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
以对硝基酚麦芽庚苷(4-NP-G7）为底物，经AMS催化水解为游离 的寡糖(G5，G4，G3)及葡萄糖残基减少的对-硝基苯酚寡糖苷 (4-NP-G2、4-NP-G3和4-NP-G4)。后者在α-葡萄糖苷酶催化下 ，进一步水解为葡萄糖和对-硝基酚(其摩尔数仅为酶解底物4NP-G7的1/3，其余2/3还结合在4-NP-G4中)。对-硝基酚的生成 量在一定范围内与α-淀粉酶活性成正比。
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
IFCC推荐法以4-NPP为底物，AMP为缓冲液。测定结果更 可靠，一般不需要做样品空白对照，干扰相对较小。
AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）和DEA（二乙醇胺）都是激 活型缓冲液，作为底物参与反应，所测的的ALP活性要比用 碳酸盐缓冲液高26倍。而DEA的激活作用比AMP更强。因 此使用不同缓冲液的方法测的ALP活性参考区间不同。
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
连续监测法测定酶活性浓度
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
教学目标与要求
掌握` 熟悉`
色素原底物反应、脱氢酶参与反应和过氧化物 酶参与反应的连续监测法测定酶活性的原理与 方法；ALP、GGT、AMY、ALT、AST、CK、 LD、ChE等酶活性的测定原理及其注意亊项。
第19页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
1.羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲系统中pH升高硝基苯酚的摩尔消 光系数也增大。不同的蛋白质体系中摩尔消光系数也有变化。
2.α-葡萄糖苷酶对底物有缓慢的水解作用，若将PNP-G7的非 还原端葡萄糖残基接上保护基团封闭，就可以阻止这种水解作 用，稳定性可提高5~9倍。
第27页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨 酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者在405nm波长下吸光度 的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比。
甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺 GPDA 甘氨酰脯氨酸 对硝基苯胺
第28页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
第13页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
GCNA第3位上含有亲水基团羧基，溶解度增加，而且底物 稳定性好，自身水解作用小，是IFCC的推荐方法。
①原IFCC推荐方法的测定条件pH为8.20，反应温度30℃； 若反应温度37℃时最适pH则为7.70，以甘氨酰甘氨酸和氢氧 化钠做缓冲体系；甘氨酰甘氨酸的作用既是缓冲液又可看成 是底物，与甘氨酸或甘氨三肽为受体相比，酶促反应速度可 以提高5倍。
（三）方法学评价
连续监测法具有简便快速，重复性好，线性范围宽，敏感 性高，结果准确等优点。底物稳定易溶，检测试剂为液体双 试剂，没有非酶水解现象，使用非常方便。
PNP-NAG法：
PNP NAG NAGase PNP 氨基葡萄糖苷
第24页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
以2-氯-4- 硝基酚-N-乙酰- beta-D-氨基葡萄糖苷为底物
，在NAG催化下水解产生CNP，色素原的pKa为5.5，与NAG酶 的最适pH4.6相近，在反应条件下色原呈色不需要加碱性呈色剂 ，反应进入线性期时通过连续监测405nm处吸光度的变化，用 摩尔吸光系数法计算酶活力单位。
以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法，例如对硝基 酚麦芽庚苷法，目前最为常用。
第16页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（一）方法概述
以2-氯-对硝基苯酚麦芽三糖苷（ CNP-G3 ）为底物，被淀粉酶水解释 放出2-氯-对硝基酚（CNP）。
淀粉酶水解CNP-G3的速度是G3的10倍，因而不需要用辅助 酶，直接水解产生CNP在405nm有光吸收，该法准确性较好。
CNPNAG NAGase CNP 氨基葡萄糖苷
第25页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
CNP的pKa为5.5，与NAG的最适pH一直，且有足够大的摩尔 消光系数，可以直接速率法分析，无需样品空白，但底物溶解 性差，稳定性不够，非酶水解较明显。
pH 7.0时CNP离子化率97%，pH 5.0时只有25%左右，因此吸 光度约为PNP法的1/4，而且离子化程度受pH影响较大，建议 在临床使用中，实际测定摩尔吸光系数，计算分析仪的K值， 提高检测结果的准确性。
测定可用血清或适量EDTA-Na2和草酸钠抗凝的血浆，肝素 和 柠檬酸盐抗凝剂不可使用。
第23页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（一）方法概述
固定时间法：
对硝基酚葡萄糖苷法 MCG-葡萄糖苷法
4-甲基伞形酮基乙酰氨基葡萄糖苷荧光法
五、N乙酰氨基 葡萄糖苷 酶测定
CPR-NAG法： CPR NAG NAGase CPR 氨基葡萄糖苷
注意饮食、抗凝剂、溶血、温度等的影响。
第10页
第二十二四、章 γ连-续谷监氨测法酰测基定酶转活移性浓酶度测定（γ-glutamyltransferase, GGT） （一）测定方法概述
①以L-γ-谷氨酰-α（β）-萘胺为底物，生成的α（β）-萘胺与 重氮试剂生成红色化合物。该方法灵敏度低，底物溶解度差， 受溶血干扰较大。
连续监测法
第21页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
AFU作用于2-Chloro-4-nitrophenyl- alpha-Lfucopyranoside（CNPF)生成2-氯-4-硝基酚（CNP）和α-L-岩 藻吡喃糖。405nm波长处吸光度的上升速率与AFU的活性成正 比，即可计算出样品中AFU的活性。
特殊反应类型的连续监测法测定酶活性的原理与 方法，四大类连续监测法测定除上述酶外，其它 酶活性的测定原理及其注意亊项。
了解`
上述各酶活性测定方法的历史演变及其优缺点。
第2页
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
主要内容
色素原底物反应的连续监测法 脱氢酶参与的连续监测法 过氧化物酶反应的连续监测法 特殊反应类型的连续监测法
第26页
第二十四六章 、连续甘监测氨法测酰定脯酶活氨性浓酸度 二肽氨基肽酶测定
（glycylproline dipeptidyl aminopeptidase，GPDA）
（一）方法概述 GDPA早期采用甘氨酰-L-脯氨酸-2-萘酰胺作为底物，由于 萘酰胺具有致癌作用而少用。 现发展了以甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺建立起来的方法有连 续监测法、非连续的直接比色法和间接比色法，其中以连续 监测法最为方便快捷 荧光法：灵敏度较高，可用于尿液中GPDA的测定。
以色素原GCNA为底物，甘氨酰甘氨酸为受体，GGT催化γ谷氨酰基团从GCNA转移至甘氨酰甘氨酸上，并游离出2-硝基 -5-氨基苯甲酸。后者的生成量与样品中的GGT活性成正比关 系，故测定405nm处的吸光度增量可计算出GGT的活性。
GCNA 双甘氨酸 pGHG7T.72 硝基 5 氨基苯甲酸 L 谷氨酰 甘氨酰甘氨酸
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
②2-硝基-5-氨基苯甲酸在410nm的摩尔消光系数为 7.96×103（pH为7.70），受pH和温度影响较大。若选择 401nm或405nm时需注意校正。
③由于产物摩尔消光系数较小，样品用量大，样品体积 分数0.0909，为了样品和反应液在37℃平衡，故需要孵育时 间180s和底物启动模式。
（一）测定方法概述
γ-L-谷氨酰对硝 基苯胺为底物
L-γ-谷氨酰-α（β） -萘胺为底物
方法灵敏度低， 底物溶解度差， 受溶血干扰较 大
可以连续监 测，有较好 的灵敏度和 准确性，但 底物溶解度 差
L-γ-谷氨酰-3-羧 基-4-硝基苯胺为
底物
IFCC推荐方 法
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
CNPF AFU CNP(黄色) L - 岩藻糖
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
CNPF法所采用CNP的解离常数(pKa)5.5与AFU的最适pH相 近，缩短了反应时间，无需样本空白，实现了AFU的连续监测 法测定。提高pH可提高CNP的离子化率，但过高的pH会影响 酶活性；该方法操作简便，测定时间短，灵敏度及抗干扰性都 有所提高。溶血仍有干扰。
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
连续监测法
色素原 底物反
应
过氧化 物酶参 与反应
特殊反应
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脱氢酶 参与反
应
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
第一节 色素原底物反应的连续监测法
水解酶类或转移酶类经酶促反应将无颜色的底物转变为有颜色的 产物，在一定波长具有吸收峰，通常把这类底物称为色素原底物。 特点是水解之前无颜色，水解之后释放的产物有色。 这类底物大多有自行慢慢分解的特点，因此要求底物避光保存， 检测的初始吸光度不能高于0.5。
在碱性溶液中ALP催化无色的4-NPP分裂出磷酸基团，生 成游离的对硝基苯酚(4-nitrophenol, 4-NP)，后者在碱性溶液 中转变成醌式结构，呈现较深的黄色。在波长405nm处连续 监测吸光度增高速率，计算ALP活性。
4 - NPP AMP ALP4 - NP X - OPO3H2
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
一 碱性磷酸酶測定 二 γ-谷氨酰基转移酶测定 三 淀粉酶测定 四 α-岩藻糖苷酶测定 五 N-乙酰氨基葡萄糖苷酶测定 六 甘氨酰脯氨酸二肽氨基肽酶测定
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
一、碱性磷酸酶測定 （alkaline phosphatase，ALP）
布氏法： ALP 作用于β-甘油磷酸钠产生磷酸根，定量磷 测定酶活性。少用 金-阿法：以磷酸苯二钠为底物， 经ALP作用生成酚，定 量酚测定活性。少用 皮-劳法：以4-硝基酚磷酸钠盐为底物，水解生成对硝基 酚，碱性条件下呈黄色，连续监测。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）IFCC推荐的测定方法
4-NP G7 AMS 4-NP G4,3 ,2 G5,4 ,3
4-NP-G4,3 ,2 葡萄 糖苷酶 4-NP-G4 G 4-NP
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
用半乳糖-2-氯-4-硝基苯酚-α-麦芽糖做底物，评价基本与 CNP-G3一样，而且不受内源性α-葡萄糖苷酶的干扰。明显的 溶血会使结果偏低，而高浓度的免疫球蛋白（Ig G>50g/L）会 对结果带来正向干扰。不管用何种方法，脂性血清中脂蛋白 会导致AMS结果偏低。另外，临床中还应注意巨淀粉酶血症 的存在，输注的羟乙基淀粉或右旋糖酐会导致巨型复合物的 产生。
3.多功能α-葡萄糖苷酶对PNP-G7的所有降解产物都有相同的 转换率，可以直接用PNP的摩尔吸光系数计算酶活性。
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第▣三二十、四章α-岩连续藻监糖测法苷测定酶酶测活性定浓（度 alpha-L-fucosidase，AFU）
（一）方法概述
荧糖苷底 物法
②以L-γ-谷氨酰对硝基苯胺（GNA）为底物，双甘氨酸为谷氨酰基的 受体，产物在碱性环境下呈黄色，可以连续监测，有较好的灵 敏度和准确性，但底物溶解度差,现已不推荐。
③以L-γ-谷氨酰-3-羧基-4-硝基苯胺（GCNA）为底物，GGT催化生成 的对硝基苯胺在碱性环境下呈黄色。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
酶活性浓度的测定在临床生化检验中占有重要的地位，约 占测定总量的1/4到1/3。 测定方法主要有定时法和连续监测法两种。
– 由于定时法难以确定在选定的反应时间内是否处于线性期，反应 的时间都较长，检测效率低，因此，临床大多用连续监测法来测 定酶活性浓度。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
三、淀粉酶测定(α-Amylase, AMS)
（一）方法概述
以天然淀粉为底物：样品稀释法、时间滴定法、碘淀粉比 色法等。但天然淀粉的分子结构与葡萄糖的组成不确定而难 以标准化，测定的准确性和重复性都较差，而且线性范围窄 ，测定误差大。
α-葡萄糖苷酶-己糖激酶-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶偶联法是最 早使用的连续监测法。
从理论上说这是一种最理想的测定方法，但易受内源性α葡萄糖苷酶的干扰。尿标本中细菌污染偶尔会干扰反应。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
以对硝基酚麦芽庚苷(4-NP-G7）为底物，经AMS催化水解为游离 的寡糖(G5，G4，G3)及葡萄糖残基减少的对-硝基苯酚寡糖苷 (4-NP-G2、4-NP-G3和4-NP-G4)。后者在α-葡萄糖苷酶催化下 ，进一步水解为葡萄糖和对-硝基酚(其摩尔数仅为酶解底物4NP-G7的1/3，其余2/3还结合在4-NP-G4中)。对-硝基酚的生成 量在一定范围内与α-淀粉酶活性成正比。
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
IFCC推荐法以4-NPP为底物，AMP为缓冲液。测定结果更 可靠，一般不需要做样品空白对照，干扰相对较小。
AMP（2-氨基-2-甲基-1-丙醇）和DEA（二乙醇胺）都是激 活型缓冲液，作为底物参与反应，所测的的ALP活性要比用 碳酸盐缓冲液高26倍。而DEA的激活作用比AMP更强。因 此使用不同缓冲液的方法测的ALP活性参考区间不同。
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
连续监测法测定酶活性浓度
第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
教学目标与要求
掌握` 熟悉`
色素原底物反应、脱氢酶参与反应和过氧化物 酶参与反应的连续监测法测定酶活性的原理与 方法；ALP、GGT、AMY、ALT、AST、CK、 LD、ChE等酶活性的测定原理及其注意亊项。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
1.羟乙基呱嗪乙硫磺酸缓冲系统中pH升高硝基苯酚的摩尔消 光系数也增大。不同的蛋白质体系中摩尔消光系数也有变化。
2.α-葡萄糖苷酶对底物有缓慢的水解作用，若将PNP-G7的非 还原端葡萄糖残基接上保护基团封闭，就可以阻止这种水解作 用，稳定性可提高5~9倍。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
GPDA催化底物甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺水解，生成甘氨 酰脯氨酸和黄色的对硝基苯胺，后者在405nm波长下吸光度 的升高，吸光度升高速率与GPDA活性成正比。
甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺 GPDA 甘氨酰脯氨酸 对硝基苯胺
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
GCNA第3位上含有亲水基团羧基，溶解度增加，而且底物 稳定性好，自身水解作用小，是IFCC的推荐方法。
①原IFCC推荐方法的测定条件pH为8.20，反应温度30℃； 若反应温度37℃时最适pH则为7.70，以甘氨酰甘氨酸和氢氧 化钠做缓冲体系；甘氨酰甘氨酸的作用既是缓冲液又可看成 是底物，与甘氨酸或甘氨三肽为受体相比，酶促反应速度可 以提高5倍。
（三）方法学评价
连续监测法具有简便快速，重复性好，线性范围宽，敏感 性高，结果准确等优点。底物稳定易溶，检测试剂为液体双 试剂，没有非酶水解现象，使用非常方便。
PNP-NAG法：
PNP NAG NAGase PNP 氨基葡萄糖苷
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
以2-氯-4- 硝基酚-N-乙酰- beta-D-氨基葡萄糖苷为底物
，在NAG催化下水解产生CNP，色素原的pKa为5.5，与NAG酶 的最适pH4.6相近，在反应条件下色原呈色不需要加碱性呈色剂 ，反应进入线性期时通过连续监测405nm处吸光度的变化，用 摩尔吸光系数法计算酶活力单位。
以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的测定方法，例如对硝基 酚麦芽庚苷法，目前最为常用。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（一）方法概述
以2-氯-对硝基苯酚麦芽三糖苷（ CNP-G3 ）为底物，被淀粉酶水解释 放出2-氯-对硝基酚（CNP）。
淀粉酶水解CNP-G3的速度是G3的10倍，因而不需要用辅助 酶，直接水解产生CNP在405nm有光吸收，该法准确性较好。
CNPNAG NAGase CNP 氨基葡萄糖苷
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（三）方法学评价
CNP的pKa为5.5，与NAG的最适pH一直，且有足够大的摩尔 消光系数，可以直接速率法分析，无需样品空白，但底物溶解 性差，稳定性不够，非酶水解较明显。
pH 7.0时CNP离子化率97%，pH 5.0时只有25%左右，因此吸 光度约为PNP法的1/4，而且离子化程度受pH影响较大，建议 在临床使用中，实际测定摩尔吸光系数，计算分析仪的K值， 提高检测结果的准确性。
测定可用血清或适量EDTA-Na2和草酸钠抗凝的血浆，肝素 和 柠檬酸盐抗凝剂不可使用。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（一）方法概述
固定时间法：
对硝基酚葡萄糖苷法 MCG-葡萄糖苷法
4-甲基伞形酮基乙酰氨基葡萄糖苷荧光法
五、N乙酰氨基 葡萄糖苷 酶测定
CPR-NAG法： CPR NAG NAGase CPR 氨基葡萄糖苷
注意饮食、抗凝剂、溶血、温度等的影响。
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第二十二四、章 γ连-续谷监氨测法酰测基定酶转活移性浓酶度测定（γ-glutamyltransferase, GGT） （一）测定方法概述
①以L-γ-谷氨酰-α（β）-萘胺为底物，生成的α（β）-萘胺与 重氮试剂生成红色化合物。该方法灵敏度低，底物溶解度差， 受溶血干扰较大。
连续监测法
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
（二）常用方法
AFU作用于2-Chloro-4-nitrophenyl- alpha-Lfucopyranoside（CNPF)生成2-氯-4-硝基酚（CNP）和α-L-岩 藻吡喃糖。405nm波长处吸光度的上升速率与AFU的活性成正 比，即可计算出样品中AFU的活性。
特殊反应类型的连续监测法测定酶活性的原理与 方法，四大类连续监测法测定除上述酶外，其它 酶活性的测定原理及其注意亊项。
了解`
上述各酶活性测定方法的历史演变及其优缺点。
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第二十四章 连续监测法测定酶活性浓度
主要内容
色素原底物反应的连续监测法 脱氢酶参与的连续监测法 过氧化物酶反应的连续监测法 特殊反应类型的连续监测法
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第二十四六章 、连续甘监测氨法测酰定脯酶活氨性浓酸度 二肽氨基肽酶测定
（glycylproline dipeptidyl aminopeptidase，GPDA）
（一）方法概述 GDPA早期采用甘氨酰-L-脯氨酸-2-萘酰胺作为底物，由于 萘酰胺具有致癌作用而少用。 现发展了以甘氨酰脯氨酰对硝基苯胺建立起来的方法有连 续监测法、非连续的直接比色法和间接比色法，其中以连续 监测法最为方便快捷 荧光法：灵敏度较高，可用于尿液中GPDA的测定。