《基因药物分析》PPT课件

一. 理化分析法 光谱分析法： 比色法，紫外、荧光分光 光度法等
色谱分析法： 高效液相，灌注色谱等
精品医学
14
➢ 化学分析法：重量法、滴定分析、电化学分析
❖ 重量法：根据样品中分离出的单质或化合物的重量测定 所含成分的含量。
1．提取法：用适宜的溶剂提取出样品中的某种成分，再蒸 去溶剂进行测定。
2．挥发法：利用被测组分具有挥发性，或将它转化为挥发 性物质来进行含量测定的方法。
多糖类：检查低聚糖、核酸、蛋白质等；
•原料药的检查
（生化药物）
酶类：酶催化反应基本产物分析，相关酶 的检查；
精品医学
8
•生产过程中杂质的检查（尤其是基因工程药物）
基因工程药物的生产涉及到生物材料和生物学过程，因 此可能会存在很多传统生产方法不可能存在的有害杂质。
如：原核细胞中表达的产品 如：动物细胞中表达的产品 可能含有内毒素、致敏原 可能含有DNA杂质或病毒
3
❖ 什么是基因工程药物（Genetic engineering drugs）？
发现
功能蛋白
预防、治疗某种疾病
基
因
的 调控基因的分离、纯化或人工合成
控制蛋白合成
繁
殖
DNA重组技术
表
导
达
入
可大量生产的受体细胞
细菌、酵母菌、 动植物及其细胞
精品医学
4
➢ 生化药物和基因工程药物的种类
生化药物
氨基酸、多肽、蛋白质 酶类与辅酶类 多糖类
应用：基因工程药物和其它大分子药物的分离纯化和分析
精品医学
23
二、 生化测定法
➢ 电泳法
❖ 定义：在电解质溶液中，带电粒子或离子在电场作用下， 以不同的速度向其所带电荷相反方向迁移的现象叫电泳。 ❖ 原理：基于溶质在电场中的迁移速度不同而进行的分析方法
❖ 分类： 根据电泳的分离特点及工作方式，电泳可分为三大类：
精品医学
30
► 空白和对照：
• 空白是指杂质反应和自发反应引起的变化量；
通过不加酶，或不加底物，或二者都加（但酶需经过失 效处理）；
提供未知因素的影响。
• 对照是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要用于 比较或标定。
精品医学
31
4. 测定方法：
i) 包括物理法、化学法和酶分析法
ii) 常用方法有：
基因工程药物质量控制必须结合最终产品、有效的 中间测试以及有效的方法来去除可能的杂质。
精品医学
9
3. 安全性检查
❖ 热原和细菌内毒素检查法 ❖ 异常毒性试验（异常毒性检查法）：
用一定剂量的药物按指定的操作方法和给药途径给予规定 体重的某种试验动物，观察其急性毒性反应。反应的判断以 试验动物死亡与否为终点。 ❖ 过敏试验——检查异性蛋白：
▪ 分离过程是以盐浓度增大的梯度洗脱法进行的；
▪ 柱效中等但具有较高质量的活性回收。
精品医学
21
3．高效凝胶过滤色谱法（HPGFC）
可用于多肽和蛋白质等生化药物分离，并测定分子量。
特点： ▪本法填料和样品间的相互作用在所有的液相色谱技术中， 是最温和的。 ▪ 在固定比例的水溶液中分离，流动相通常为缓冲液；
精品医学
6
第二节 质量检验的基本程序与方法
理化鉴别法
1.鉴别 生化鉴别法
生物鉴别法
化学鉴别法
显色、沉淀等
UV光谱法
HPLC法
肽图谱
电聚焦法 利用等电点差异
利用生物体进行试验来鉴别药物
精品医学
7
2. 杂质检查
❖ 一般杂质检查： 同化学药物 ❖ 特殊杂质检查：
以酶为试剂测定样品中酶 以外的其它物质的含量
精品医学
26
❖ 酶活力测定法
1. 概念：
酶活力：指酶催化一定化学反应的能力 A 酶 B
酶活力的测定即是测定一个被酶所催化的化学反应的速度
酶反应速度用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示
反应 速 d(C A 度 )d(C B ) dt dt
精品医学
27
精品医学
25
➢ 酶法
酶活力测定法 酶分析法
酶活力测定法
酶分析法
原理： 以酶能够高效、专一地催化某些化学反应为基础，通 过对酶反应速度的测定或生成物等浓度的测定而检测 相应物质的含量
定义： 以酶为分析对象 的分析方法
以酶为分析工具或分 析试剂的分析方法
目的： 测定某种酶的活力或 活性，用酶的活力单
位和比活性表示
热稳定性差的生化药物，尤其是具有生物活性的物质。
常用的HPLC法包括： 1．反相高效液相（RP-HPLC）：
主要用于分析肽类、氨基酸、蛋白质和多糖等的定量分析
常用的固定相、流动相、检测器
精品医学
20
2．高效离子交换色谱法（HPIEC）： 常用于分离分析蛋白质、多肽； 特点： ▪ 蛋白质、多肽的分离是根据其相应的离子化程度而 进行的；
精品医学
18
❖ 紫外分光光度法 样品或转化后的产物在某一波长处有最大吸收，在一定的
浓度范围内，其浓度与吸收度成正比，则可进行定量测定。
❖ 荧光分光光度法
样品或其衍生物经紫外光照射后发出荧光，利用荧光强度 进行定量；或利用衍生化反应和荧光淬灭进行测定。
精品医学
19
➢ 色谱分析法
❖ HPLC法： 特点：不破坏样品，适合分析高沸点、大分子、强极性和
精品医学
33
★ 连续测定
基于底物和产物在物理化学性质上的不同，在反应过 程中对反应系统进行直接连续检测的方法。
从准确性和测定效率看，连续法都比取样测定好。
取样测定法目前仍广泛采用，这是因为：
① 它不需要特殊仪器；
② 几乎所有酶反应都可根据产物或底物的化学性质找出 具体测定方法 ③ 由于色源底物和荧光源底物的发展，可在原来的底物 分子上接上相应的有色基团、发色基团或荧光基团。
方法： 1.样品配制： a.配制盐酸氨基葡萄糖对照品溶液； b.配制供试品溶液，水解并中和多余盐酸；
精品医学
17
2.显色反应： 精密量取两份对照品、供试品溶液，以水作为空白，在碱
性条件下与乙酰丙酮反应，再与对二甲氨基苯甲醛进行显色 反应；
3.吸光度测定： 在525nm的波长处分别测定对照品溶液与供试品溶液的
定义：每毫克蛋白质中所含的酶单位 数，用IU/（mg 蛋白质）表示
× 每毫克酶的
活力单位数
在酶高度纯净，酶的分子量已知时，可采用分子活力表示。
精品医学
28
3. 酶促反应的条件及影响因素：
★如何选择酶促反应的条件： 使所有待测定的酶分子都应该能够正常地发挥它的作用。
► 底物浓度影响：反应速率受到底物浓度影响 [S]＝100Km
► pH影响：pH影响酶的活性和反应方向
pH7 如：乳酸脱氢酶 pH10
乳酸 丙酮酸
精品医学
29
► 温度影响： 这一影响体现在两个方面
直接影响化学反应速度 影响酶
通常选用25℃，30℃或37 ℃（±0.1℃）
► 辅助因子影响：
有些酶需要金属离子，有些酶则需要相应的辅酶物质。 为了提高酶在反应系统中的稳定性，有时需要某些相应的 物质。如对巯基酶可加入二巯基乙醇、二巯基苏糖醇等。
▪ 分离是根据蛋白质或多肽在溶液中相应的有效粒径而进 行的。
精品医学
22
❖ 灌注色谱法：
20世纪90年代发展起来的用于分离纯化和分析的色谱新 技术。
特点：采用新的分离介质，允许液体传送流经介质的内表 面，样品直接灌注入介质颗粒中，大大消除了传统色谱分离 中扩散速率对分离容量和分辨率的负面影响，提高分离的速 度和效率。
有可能存在异性蛋白的药物应作过敏试验。
精品医学
10
❖ 降压物质检查法： 降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，
包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。
❖ 无菌检查法——检查药品及敷料是否染有活菌： 无菌检查指示控制制品染菌状况的一种检测手段。要
使药品真正达到无菌，首先应严格执行GMP管理制度。
❖ 电化学分析法——离子选择性电极分析法：
电极借助敏感膜对某一离子产生选择性的响应。
精品医学
16
➢ 光谱分析法
❖ 比色法：样品与显色剂可发生颜色反应，依颜色反应的强 度测定含量。
▪ 例：用比色法测定硫酸软骨素的含量
原理：样品先用盐酸水解生成氨基己糖，然后在碱性条件 下与乙酰丙酮反应，再与对二甲氨基苯甲醛反应产生红色， 以盐酸氨基葡萄糖为对照品，用比色法测定。
第十三章
生化药物
和
基因工程药物分析概念
精品医学
1
第一节 概 述
➢ 什么是生物药物
利用生物体、生物组织或器官等成分，综合运用生物学、 生物化学、微生物学、免疫学、物理化学合药学的原理与方 法制得的药物。
广义的生物药物包括各种天然生物活性物质以及人工合成 或半合成的天然物质类似物。
精品医学
2
➢ 什么是生化药物和基因工程药物？
酶类或蛋白质药物
测定： HPLC法 SDS-PAGE法(蛋白质)
精品医学
以体内或体外法测定参考 品的生物学活性 同时测定蛋白质含量，计 算特异比活性，以单位数 /毫克蛋白（IU/mg）标示
13
第三节 常用定量分析方法及其应用
主要包括理化分析法、生化测定法和生物检定法
化学分析法： 重量法、容量法、电化学 分析等
基因工程药物
主要成分为多肽或蛋白质
激素类及神经递质类
脂质类
细胞因子类
核酸及其降解物、衍生物 …
精品医学
酶类及凝血因子类
5
➢ 生化药物和基因工程药物的特点
❖ 来源均为生物体，并都具一定的生物活性和生物功能； ❖ 治疗疾病的针对性强、毒副作用小、易为人体吸收； ❖ 分子量大，且往往不是定值； ❖ 结构确证难； ❖ 质量对多种因素敏感，需进行全程质量控制； ❖ 需进行生物活性检查、安全性检查、效价检查等；
3．沉淀法：利用沉淀反应，将被测组分转化成难溶物，以 沉淀形式从溶液中分离出来，然后经过滤、洗涤、烘干或炽 灼，最后称重并计算其含量的方法。
精品医学
15
❖ 滴定分析法：根据样品中某些成分与标准溶液能定量地 发生酸碱中和、氧化还原或络合反应等进行测定
例：用电位滴定法测定L－盐酸精氨酸含量；
胰淀粉酶的效价测定：以淀粉为底物，经淀粉酶水解 后产生还原糖，在碱性溶液中还原糖又将斐林试剂中 的Cu2＋还原成Cu＋，多余的Cu＋在酸性溶液中与KI 作用析出碘，然后用硫代硫酸纳滴定所析出的碘，来 推算糖的含量，进而标定淀粉酶的效价。
2. 酶活力 评价指标
酶的活力单位（enzymatic activity unit）
定义：一定条件下，单位时间内转化一定 量底物所需酶的量。
酶在25℃以最适当的底物浓度、最适当的 缓冲液离子强度以及最适当的pH等条件 下，每分钟能转化1 μmol底物的酶量为一 个活性单位，用IU表示。
酶的比活性（specific activity）
吸收度，以两份的平均值，按下式计算：
氨基己糖 AW S 含 稀 量 释 ％ 0.倍 8＝ 3 数 0 19 0 ％ 0
A s
W
A、As分别为样品和对照品溶液吸收度的平均值； Ws为对照品溶液每lml中含盐酸氨基葡萄糖的量（mg）； W为供试品重量（mg）； 0.8309为氨基葡萄糖与盐酸氨基葡萄糖分子量的比值。
（l）自由界面电泳：
精品医学
24
★（2）区带电泳：在电泳过程中，应用各种不同的惰性支 持介质，在电场作用下，使具有不同泳动速度的组分形成各 自区带的电泳。
（3）高效毛细管电泳：是在一根内径约50μm的毛细管中， 在高压电场下进行样品分离分析的一种新型电泳技术。
❖ 常用方法：
根据所用的支持物不同可分为： 纸电泳法； 醋酸纤维素薄膜电泳法； 聚丙烯酰胺凝胶电泳法； 十二烷基硫酸纳（SDS）聚丙烯酰胺凝胶电泳法；
精品医学
11
❖ 基因工程药物中可能的杂质与污染物检查 可能的杂质：残留DNA、宿主细胞蛋白质、内毒素、蛋
白质突变体和蛋白裂解物等 可能的污染物：微生物、热原和病毒等
❖ 致突变试验 ❖ 生殖毒性试验
精品医学
12
4. 含量（效价）测定
含量测定 （％）
效价测定 (生物效价或酶活力单位）
适用对象：结构明确的小分子或水 解后变成小分子的药物
生化药物
Biochemical drugs
生物提取物
生命基本物质及其衍
生物、降解物、结构
生物-化学半合成 修饰物等
现代生物技术
生
物 药
生物技术药物 运用生物技术 Bio-technology 进行新药研发
drugs
如基因工程药物
物
生物制品
Biological products
生物技术
生物材料制备
精品医学
① 测定生成一定量产物所需的时 间，即终点法
适当条件下 将酶和底物混合
② 隔一定时间，间断或连续地测 定反应变化
③ 反应一定时间后停止反应，定 量测定底物减少或产物生成的量
精品医学
32
按取样和检测方式分为取样测定和连续测定：
★ 取样测定
酶反应开始后不同的时间，取出一定量反应液，并用 适当的方法停止其反应后，对产物和底物进行定量分析， 求得单位时间内酶促反应变化量的方法。 加入酶变性剂 加热使酶变性
精品医学