应用紫外指纹图谱分析技术鉴别白僵蚕_冀宪领

2006;32(1)蚕 业 科 学 CANYE KEXUE
收稿日期:2005-08-23
资助项目:山东省科技厅三 工程项目[编号鲁科农字(2002)228]。

作者简介:冀宪领(1971-),男,山东,博士研究生,讲师。

Te:l 0538-*******,E -ma i :l gyp @s dau .edu .cn
通讯作者:牟志美,教授,博士生导师。

Te:l 0538-*******,E -ma i :l z m ei m u@s .cn
应用紫外指纹图谱分析技术鉴别白僵蚕
冀宪领1 盖英萍2 牟志美1 王更先1 李 波
1
(1山东农业大学林学院蚕学系,泰安 271018;
2
山东农业大学生命科学学院,泰安 271018)
摘 要 基于为白僵蚕的质量控制提供依据,研究了紫外指纹图谱技术在白僵蚕鉴别上的应用。

将不同品种、不同季节的白僵蚕及健蚕的水溶性提取液、脂溶性提取液和醇溶性提取液用紫外分光光度法在200~400n m 波长范围内扫描,用白僵蚕的各提取液对小白鼠进行抗惊厥试验。

结果表明,白僵蚕的醇溶性提取液的紫外指纹图谱可以对白僵蚕进行鉴别。

关键词 家蚕;白僵蚕;白僵菌;抗惊厥;紫外指纹图谱
中图分类号 S886 9 文献标识码 B 文章编号 0257-4799(2006)01-0067-07
Analysis ofU ltraviolet F i n gerpri nt Spectra on
W hiteM uscard i ne S ilk wor m
JI X ian -L i n g 1 GA I Y i n g -P i n g 2 MU Zh-i M e i 1* WANG G eng -X ian 1 LI Bo
1
(1D e p ar t m ent of Sericult ure ,College of Forestry,Shandong A gricult ural Uni versity,Taian Shandong 271018,China ;
2
Co llege of L i fe Science ,Shandong Agr ic u ltural University,T ai an Shandong 271018,China )
A bstrac t P urpo se o f t h is paper is to app l y t he u ltrav i o l e t fi ngerpr i nt spectra i n identifi cation o f wh ite m uscard i ne sil k -w or m.F rac tions ex tracted by w ate r ,fat and ethano l from no r m al sil k w or m s and w hite muscardi ne silk w or m s o f d ifferen t va -rieti es and reari ng seasons w ere scanned fro m 200n m to 400nm w ith u ltrav io l e t spectrophotome try and used in ant-i convu-l s i on experi m ent on m i ce .T he resu lts show t hat wh ite m uscard i ne silk wo r m can be i den tified by u ltrav iolet fi nge rprint spec -tra of e t hano l ex tracts .
K ey wo rds B o m byx m or i ;W h ite m uscard i ne sil k w or m;B eauver i a bassiana ;A nt-i convu lsi on ;U ltrav i o l e t fingerpri nt spectra
白僵蚕是蚕蛾科家蚕(B o m byx m ori L .)4~5龄
的幼虫感染或人工接种白僵菌[B eauveri a bassiana (B alsa mo)Vu il.l ]而致死的干燥体,为传统的中药,亦称僵虫、天虫和姜虫等。

早在《神农本草经》中已有白僵蚕的记载。

僵蚕具有熄风止痉、活血通络、化痰散结等功效
[1]
,在临床上广泛应用于治疗高温惊
厥、癫痫、抽搐、血管神经性头痛、咳嗽、哮喘等症。

现代药理研究发现其具抑菌、抗惊厥、抗凝、抑瘤等
作用[2]。

近年来,应用僵蚕治疗糖尿病及其并发症、脂肪肝、高血压、肝炎、颈椎骨质增生、蛋白尿、息肉、牙周炎、前列腺增生、慢性咽炎、鼻炎、乳腺炎等疾病也均有研究报道,并取得了良好的疗效
[3]。

由
于僵蚕用途广泛,疗效显著,近年来研制的含有僵蚕的成药品种迅速增加。

据统计,在我国513种常用成药中,含有僵蚕的有49种,其中64种儿科成药中,有29种用僵蚕,且常年外销出口。

僵蚕作为一味常用中药,其质量的好坏直接关系着人的生命安全。

但是,目前市场上对僵蚕的质量控制还缺少一个依据,难以区分僵蚕的真伪。

中药的质量评价一直是中药研究与应用的难点
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与重点问题,制约着中药的现代化和国际化。

现行的中药质量控制模式包括2000版中国药典,基本上是以测定某一有效成分或指标成分为目标的分析方法,但从中医药的多组分整合调节作用的观点看,指标成分的控制难以真正控制中药功效。

近年来,国外对中草药产品的质量评价提倡指纹图谱,国内学者也致力于中药质量控制方法的研究[4]。

中药指纹图谱是对中药材或中成药进行适当处理后,采用一定的分析手段,将中药的特性和有效成分采用图谱的形式描绘出来的使每味中药都拥有其特定标准的图谱,是一种综合的、可量化的色谱测定手段,可对中药材或制剂进行定性和定量的研究,用以评价和控制中药质量[5]。

中药指纹图谱的研究国外早已开展,并且取得了成就[6,7]。

紫外光谱作为中药鉴别的辅助手段近年来发展较快,有成本低、操作便捷等特点[8]。

中药紫外光谱特征的差异在一定程度上反映了中药化学成分的差异,可用于正伪品的鉴别。

本试验旨在应用紫外光谱技术为僵蚕的质量控制建立一个标准的行之有效的紫外指纹图谱。

1 材料与方法
1.1 供试蚕品种
家蚕一代杂交种镇 珠 春 蕾、872 871、114 113、鲁七 9202,均由山东农业大学蚕学实验站提供。

其中,镇 珠 春 蕾包括春季饲养和秋季饲养,其余品种均为春季饲养。

1.2 试验用鼠
昆明系小鼠,SPF级(无特征病原体动物),由中澳合资山东米歇尔生物制品有限公司提供。

1.3 白僵蚕的制备
5龄起蚕饷食前,用浓度为1 108mL-1的球孢白僵菌活性液均匀喷洒蚕体,以蚕体湿润为度,喷完后饷食,其后保持高温多湿的环境。

将僵死蚕挑出自然风干,待蚕体变硬,体表长出白僵菌白色分生孢子后,100 烘干备用。

健康蚕于5龄第5天100 烘干备用。

1.4 白僵蚕及健蚕不同提取液的制备[2,3]
1.4.1 水溶性提取液的提取 分别称取10g白僵蚕和健康蚕,磨碎,放入三口烧瓶中,加100mL重蒸水,搅拌、回流提取45m i n后,提取液离心(3000r/ m in)10m in,将上清液移入干净的烧杯,残渣移入三口烧瓶中,加80mL重蒸水(原料质量浓度为0 125g/mL)二次提取30m in,提取液离心(3000 r/m i n)10m in,合并2次上清液,定容至250mL。

残渣供脂提用。

1.4.2 脂溶性提取液的提取 将方法 1.4.1 中水提后的残渣用水漂洗至无色。

然后移入三口烧瓶中,加100mL95%乙醇,加热至沸,回流提取1.5h,将提取液离心(3000r/m i n)10m in。

将上清液定容至100mL。

1.4.3 醇溶性提取液的提取 分别称取10g白僵蚕和健康蚕,磨碎,放入三口烧瓶中,加入100mL 75%乙醇,加热至沸,回流提取1.5h,提取液离心(3000r/m i n)10m i n,将上清液定容至100mL。

1.5 白僵蚕各不同提取液对小白鼠抗惊厥作用
1.5.1 给药方法 取镇 珠 春 蕾秋季白僵蚕不同提取液,浓缩成含0.7g/mL生药的样品溶液。

将小白鼠随机分成4个组,分别为样品1、2、3组及对照组。

每组8只,雌雄各一半。

试验设3次重复。

灌胃前先饥饿12h,称量。

样品1、2、3组按20.9g/ kg分别灌胃水溶性提取液、脂溶性提取液和醇溶性提取液,给药体积为30mL/kg;对照组灌服等体积的蒸馏水,每天1次,连续给药7d。

1.5.2 抗惊厥试验于第7天给药30m in后,将各小鼠称量后皮下注射硝酸士的宁1.5m g/kg,观察小白鼠惊厥前潜伏时间,计算灌药前后体重的变化。

1.6 紫外指纹图谱的建立
将各品种、各季节的白僵蚕及健康蚕的各种提取液分别取1mL,稀释15倍,在200~400nm波长范围内扫描,得紫外指纹图谱。

2 结果与分析
2.1 同一品种不同季节白僵蚕各种提取液的紫外指纹图谱
镇 珠 春 蕾春、秋季白僵蚕不同提取液紫外指纹图谱见图1-3。

春、秋季生产的白僵蚕水溶性提取液的紫外指纹图谱差异较大,而脂溶性提取液、醇溶性提取液的紫外指纹图谱相似。

但在相同波长下秋季生产的白僵蚕水溶性、脂溶性和醇溶性提取液的吸光度均比春季生产的白僵蚕的吸光度要大。

脂溶性提取液的吸光度较水溶性和醇溶性提取液的小。

因此,秋季生产的白僵蚕具有紫外吸收的可溶性物质可能比春季生产的白僵蚕含量丰富,具有紫外吸收的脂溶性物质含量较少。

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图1 镇 珠 春 蕾春蚕和秋蚕水溶性提取液的紫外指纹图谱
F i g .1 T he u ltrav iolet fi ng erpr i nt spectra of the w ater -so l uble frac tions from w hite muscardi ne
sil k w or m (Zhen Zhu Chun L ei)rea red in spri ng and au t u m
n
图2 镇 珠 春 蕾春蚕和秋蚕脂溶性提取液的紫外指纹图谱
F ig .2 The ultrav i o let fi ng erprint spectra of the fat -so luble fracti ons from w hite musca rdine
sil k w or m (Zhen Zhu Chun L ei)reared i n spr i ng and autu m
n
图3 镇 珠 春 蕾春蚕和秋蚕醇溶性提取液的紫外指纹图谱
F ig .3 The ultrav i o let fingerpri n t spectra of t he ethano-l so l ub l e fracti ons from wh ite m uscard i ne
silk wo r m (Zhen Zhu Chun Le i)reared i n spr i ng and autu m n
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2.2 同一季节不同品种白僵蚕各种提取液的紫外指纹图谱
春季生产的各品种白僵蚕不同提取液紫外指纹图谱见图4-6。

由图4可以看出,春季生产的不同品种的白僵蚕的水溶性提取液的紫外指纹图谱峰形相似。

不同品种都在222nm 和285n m 附近有2个吸收峰。

在222n m 附近,各品种的吸光值接近,在285nm 附近,各品种的吸光值有一定差别:114
113在222nm 和285nm 的吸光值之比为3 9,872 871为2 3,鲁七 9202为3 1,镇 珠 春 蕾为3 2。

春蚕各品种白僵蚕脂溶性提取液的紫外指纹图谱在208n m 附近都有一吸收峰,吸光值接近。

春季生产的各品种白僵蚕的醇溶性提取液的紫外指纹图谱都在231nm 和269nm 波长下有2个吸收峰。

在231n m 附近,各品种的吸光值接近,在269nm 附近,各品种的吸光值有一定差别:114 113在231
nm
图4 春蚕各品种水溶性提取液的紫外指纹图谱
F i g .4 T he u ltrav i o l e t fi ngerpr i nt spectra o f the w ate r -solub l e fracti ons from
wh ite muscardi ne sil k w or m o f diff e rent var i e ties reared in spri ng
图5 春蚕各品种脂溶性提取液的紫外指纹图谱
F i g .5 T he u ltrav io l et fi ngerpr i nt spectra o f the fat -so l ub l e fracti ons from
wh ite m uscard i ne sil k w or m o f d ifferent var i eties reared i n spr i ng
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图6 春蚕各品种醇溶性提取液的紫外指纹图谱
F i g .6 T he ultrav i o let fi ng erpr i nt spectra of the e t hano -l so l uble fractions fro m
wh ite m uscard i ne silk wo r m of d ifferen t varieties reared i n spr i ng
和269nm 的紫外吸光值比值为3 6,872 871
为图7 健康家蚕和白僵蚕水溶性提取液的紫外指纹图谱F ig .7 The ultrav i o let fingerpri n t spectra of t he wa ter -so l ub le fracti ons
fro m nor m a l sil kwo r m and wh ite muscardi ne sil k w or m
3 0,鲁七 9202为3 7,镇 珠 春 蕾为3.8。

因此,不同品种的白僵蚕具有紫外吸收的水溶性和醇溶性物质的含量存在一定的差别,而具有紫外吸
收的脂溶性物质的含量差别不明显。

从吸收峰的比值来看,各品种白僵蚕醇溶性提取液的紫外指纹图谱相似度大于水溶性提取液。

春季生产的白僵蚕具有紫外吸收的脂溶性物质含量相对较少。

2.3 健康家蚕和白僵蚕各种提取液紫外指纹图谱
872 871的健康家蚕和白僵蚕不同提取液紫外指纹图谱见图7-9。

健康家蚕和白僵蚕水溶性
提取液的紫外指纹图谱差异较大:在200~235nm 之间,两者的吸收曲线相吻;在大于235nm 处健康家蚕水溶性提取液的吸光值高于白僵蚕。

因此,健康家蚕具有紫外吸收的水溶性物质含量高于白僵
蚕。

健康家蚕和白僵蚕脂溶性提取液紫外指纹图谱相似,但白僵蚕脂溶性提取液的吸光值略高于健康蚕,所以,白僵蚕具有紫外吸收的脂溶性物质含量高于健康蚕。

健康家蚕的醇溶性提取液的紫外指纹图谱与白僵蚕的醇溶性提取液的紫外指纹图谱在200~240nm 内相吻合,但在波长大于240nm 处两者相差较大,在240~310nm 范围内健康家蚕醇溶性
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提取液的紫外吸光值大于白僵蚕,超过310nm 时,白僵蚕醇溶性提取液的紫外吸光值大于健康家蚕。

因此,在大于310nm 处具有紫外吸收的醇溶性物质
在白僵蚕中的含量高于健康家蚕。

图8 健康家蚕和白僵蚕脂溶性提取液的紫外指纹图谱F i g.8 T he ultrav i o let fingerpri nt spec tra o f the fa t -so l uble fractions
fro m nor m al s il kworm and wh ite m uscard i ne sil k w or
m
图9 健康家蚕和白僵蚕醇溶性提取液的紫外指纹图谱F i g .9 T he u ltrav io l e t fi ngerpr i nt spectra o f the ethano -l so l uble frac tions
fro m no r m al sil k w or m and wh ite m uscard i ne silk w or m
2.4 白僵蚕不同提取液的抗惊厥效果
2.4.1 白僵蚕不同提取液对小鼠抗惊厥的效果 实验表明,白僵蚕不同提取液对士的宁所致的小鼠惊厥出现时间均有不同程度的延长作用(表略)。

其中:1组(白僵蚕水溶性提取液)和3组(白僵蚕醇溶性提取液)对小鼠的抗惊厥作用尤为明显,与对照组比较差异较明显;2组(白僵蚕脂溶性提取液)和对照组差异不明显。

2.4.2 灌胃不同提取液对小鼠体重的影响 实验表明空白对照组小鼠体重增加12 7%,而灌胃白僵
蚕不同提取液的小鼠体重都有不同程度的减少,其
中:灌胃1组水溶性提取液的小鼠体重减少11 8%;灌胃2组脂溶性提取液和3组醇溶性提取液的小鼠体重分别减少6 1%和6 0%(表略)。

因此,白僵蚕水溶性提取液对小鼠的毒副作用较强。

综合 2.4.1 的分析认为,白僵蚕的有效提取液应为醇溶性提取液。

3 结论与讨论
3.1 中药指纹图谱是用来评价和控制中药质量的
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重要依据。

白僵蚕的脂溶性提取液和健康蚕的脂溶性提取液的紫外指纹图谱的差异很小,不宜做紫外指纹图谱;白僵蚕的水溶性和醇溶性提取液和健康蚕的水溶性和醇溶性提取液的紫外指纹图谱的差异较大,但不同品种水溶性提取液的紫外指纹图谱的相似度低于醇溶性提取液的紫外指纹图谱,且白僵蚕的水溶性提取液对小鼠的毒副作用较大,因此,白僵蚕的水溶性提取液也不宜做紫外指纹图谱;白僵蚕的醇溶性提取液和健康家蚕的醇溶性提取液的紫外指纹图谱差异大,不同品种醇溶性提取液的紫外指纹图谱相似度大,且对小鼠的镇静作用较明显,毒副作用也小,故可选择白僵蚕的醇溶性提取液做紫外指纹图谱,对白僵蚕的质量进行控制。

3.2 由于春、秋季气候条件及桑叶叶质不同,因此,家蚕和白僵菌的生理代谢也不相同,春季生产的白僵蚕和秋季生产的白僵蚕同作为一味中药,在药效上会有一定的差异。

同一品种春季生产的白僵蚕和秋季生产的白僵蚕的各种提取液的紫外指纹图谱虽然在某一特定波段下的吸收峰是一样的,但也有一定差别,其中秋季生产的白僵蚕各提取液的紫外吸收大于春季生产的白僵蚕,这种差异可能就是两个季节生产的白僵蚕的药效不同的反映,但其具体关系还有待进一步研究。

总体上看,秋季生产的白僵蚕和春季生产的白僵蚕在峰形上没有很大的差异。

这也说明,不管是春季还是秋季生产的白僵蚕,其都具有白僵蚕特有的药效功能。

春季生产的不同品种的白僵蚕的各种提取液的紫外指纹图谱其总体峰形是一样的,只是在特定波段下的紫外吸光度略有差异。

同是一个季节生产的白僵蚕,气候条件和叶质是一样的,吸光度的差异反映出来的很有可能就是各品种之间物质代谢的差异,而这些差异也可能反映各品种白僵蚕的药效差异。

3.3 通过健康蚕和白僵蚕的醇溶性提取液的紫外指纹图谱可以看出,在200~285nm波段范围内,健康蚕的紫外吸收比白僵蚕大,在大于285nm的波长紫外范围,白僵蚕的紫外吸收大于健康蚕。

白僵蚕的醇溶性提取液具有抗惊厥药效,而健康蚕的醇溶性提取液不具有抗惊厥效果,因此,在200~285n m内的紫外吸收可能是表明家蚕特征物质的紫外吸收,而在大于285nm的波长紫外范围的吸收则可能是药效的物质的特定吸收。

白僵蚕体内的药效物质可能在200~285nm内没有紫外吸收或吸光度很弱,而在大于285 nm的紫外波长范围内具有一定的紫外吸收。

3.4 中药紫外指纹图谱法鉴别、控制中药的质量,以中药全成分分子变化的总体效应为基础,以谱线组峰数、峰位值为依据,实现中药全成分动态变化整体性的质量控制,在一定意义上贴近了中医药理论整体观和中医用药的实际。

该法采用极性大小不同的溶剂浸泡样品,分别将水溶性成分和脂溶性成分按极性大小顺序从样品中浸泡出来,所测绘出的谱图能全面地反映出样品所含全成分的整体效应的差异性。

该法只用数种固定溶剂便可以对任何样品测试出指纹图谱,而达到鉴定样品的目的。

可以鉴定基原相近、缺乏形态特征的动植物药材[9]。

中药指纹图谱的基础是通过对大量样品的图谱的分析,找出药品的标志性峰或峰的特异性。

目前应用于生产上的家蚕品种繁多,且因为养蚕地域广阔、养蚕季节不同、白僵菌变异显著等,因此,不同品种、产地、季节、不同菌株生产的白僵蚕其指纹图谱必然存在差异。

本试验仅对紫外指纹图谱鉴定(别)白僵蚕质量的可行性进行了初步分析,要建立白僵蚕的标准紫外指纹图谱,还必须对大量的样品进行分析研究。

参考文献 (R e ferences)
[1] 黄海英,彭新君,彭延古.僵蚕的现代研究进展[J].湖南中医
学院学报,2003,23(4):62
[2] 王居祥,朱超林,戴红.僵蚕及僵蛹的药理研究与临床应用
[J].时珍国医国药,1999,10(8):637-638
[3] 余辉.僵蚕的新用[J].医学文选,1994,(2):56
[4] 梁鑫淼,徐青.中药药效组分的指纹图谱分析思路与方法
[J].中国天然药物,2003,1(1):57
[5] 郑恒,魏日胞,陈香美.中药质量标准与中药指纹图谱[J].中
国医院医学杂志,2003,23(2):112-113
[6] 聂晶,田颂九,王国荣.中药指纹图谱的研究现状[J].中草
药,2000,31(12):881-884
[7] 秦海林.中药物质基础整体特征的精细表达与解析 中药指
纹图谱的研究[J].世界科学技术-中药现代化,2002,4(4):12
-16
[8] 彭文进,黄沙澧.紫外指纹图谱技术在长生露口服液鉴别中的
应用[J].湖南中医药导报,2003,9(3):77
[9] 袁久荣,袁浩.中药质量控制与方法学研究[J].中国药学杂
志,2001,36(8):566-569
73
第1期冀宪领等:应用紫外指纹图谱分析技术鉴别白僵蚕。