阿司匹林经核因子-κB信号通路抑制胃癌细胞株AGS生长

阿司匹林经核因子-κB信号通路抑制胃癌细胞株AGS生长李永金;姚红波;陶燕;陈永昌
【摘要】目的研究阿司匹林是否通过阻断核因子-κB(NF-κB)信号通路对胃癌细胞AGS增殖及周期产生影响.方法培养胃癌细胞株AGS,MTT 法检测阿司匹林在不同浓度和不同作用时间下对AGS细胞增殖的影响;流式细胞术检测阿司匹林对细胞周期的影响;western blotting和免疫荧光法检测阿司匹林对AGS细胞NF-κB p65表达的影响.结果阿司匹林在0.1～10mmol/L浓度区间内,随浓度增加和时间延长,对AGS细胞的抑制率逐渐增加.细胞周期中DNA合成前期(G0/G1期)的细胞比例增加,DNA合成期(S期)细胞比例下降.随阿司匹林浓度增加和作用时间延长,AGS 细胞NF-κB p65的表达渐降.结论阿司匹林抑制胃癌细胞AGS的增殖,诱导细胞G0/G1期阻滞,其作用机制可能是通过阻断NF-κB信号通路实现的.
【期刊名称】《临床检验杂志》
【年(卷),期】2010(028)004
【总页数】3页(P291-293)
【关键词】阿司匹林;胃癌细胞;核因子-κB;细胞周期
【作者】李永金;姚红波;陶燕;陈永昌
【作者单位】江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江,212013;江苏大学基础医学与医学技术学院,江苏镇江,212013
【正文语种】中文
【中图分类】Q253
阿司匹林对胃肠道肿瘤具有预防作用，能抑制肿瘤增殖[1-2]。

目前很多研究提示，阿司匹林能通过NF-κB信号通路发挥抗肿瘤作用。

NF-κB是广泛存在于体内多种细胞的核转录因子，参与炎症、细胞增殖、细胞周期的调控与细胞凋亡等多种生理和病理过程的基因调控，在受到各种激活因子如肿瘤坏死因子(TNF)刺激时，NF-
κB与抑制分子解离而被活化，p50-p65二聚体进入细胞核发挥基因调控作用[3-4]。

本实验研究阿司匹林对胃癌细胞AGS增殖的抑制作用和对NF-κB p65表达
及对细胞周期的影响，初步探讨其抑瘤机制。

1 材料和方法
1.1 材料与仪器人胃癌细胞株AGS由上海细胞生物研究所提供。

小牛血清(兰州
民海生物公司)，DMEM(Gibco公司)。

NF-κB p65抗体(碧云天生物技术研究所)，羊抗兔IgG(中杉公司)，TRITC标记anti-rabbit IgG(Santa Cruze公司)。

阿司匹林(Sigma公司)。

流式细胞分选仪(FACSAria，BD公司)；酶联仪(Bio-Rad公司)；CO2培养箱为(Forma Scientic，USA)。

1.2 细胞培养人胃癌细胞株AGS用含10%小牛血清的DMEM培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。

待细胞铺满瓶底后，用
2.5 g/L胰蛋白酶和0.2 g/L EDTA的混合消化液分散成单细胞，传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。

1.3 MTT实验取对数生长期的AGS细胞，用上述消化液消化后制成单细胞悬液，计数，调整细胞密度为4×104/ml，接种于96孔培养板上，每孔200 μl(每孔8 000个)，取不含细胞的培养液作空白调零。

将96孔板置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后，各孔分别加入终浓度为0.1、1、5和10 mmol/L的阿司匹林，以不含阿司匹林的培养液作为阴性对照，各组设3个复孔。

分别培养24、48、72 h后，各孔加入5 g/L的MTT 20 μl，继续培养4 h，吸除孔内液体，各孔加
入150 μl DMSO，震荡10 min后，测570 nm波长处吸光度(A)值，并计算阿司匹林对AGS细胞的抑制率。

抑制率=[(1-实验组A值)/对照组A值均值]×100%。

实验重复3次。

1.4 流式细胞仪检测阿司匹林对细胞周期的影响将AGS细胞接种在6孔板内，待细胞长满板底后各孔内分别加入终浓度为0.1、1、5和10 mmol/L的阿司匹林溶液，共培养24 h。

用胰酶消化后收集细胞，细胞用PBS洗涤2次，1 000 r/min，离心5 min。

加入4 ℃预冷的70%乙醇，混匀，4 ℃过夜。

1 500 r/min离心10 min，去除乙醇。

PBS洗涤2次，1 000 r/min，离心5 min。

弃上清加入400 μl PBS重悬细胞，加入终浓度为50 μg/ml的RNase和碘化丙啶(PI)，常温避光染
30 min，流式细胞仪检测。

1.5 western blotting法检测NF-κB p65的表达收集不同浓度阿司匹林处理24
h及10 mmol/L阿司匹林作用不同时间的AGS细胞，参照我们先前的方法提取
核蛋白[5]，电泳分离蛋白后转膜，封闭。

一抗为1∶500稀释的抗NF-κB p65抗体；内参照为抗GAPDH抗体(1∶5 000)；二抗为HRP标记的羊抗兔IgG(1∶5 000稀释)。

按ECL化学发光试剂盒操作说明曝光，并使用GE公司的Typhoon 9400荧光差异蛋白表达检测分析系统扫描并保存图像。

用软件测得NF-κB p65
和GAPDH条带的灰度值，将两者的比值作为半定量结果(相对值)，作出直方图进行统计学分析。

1.6 免疫荧光法检测NF-κB p65的表达将AGS细胞接种在置于24孔细胞培养板中的盖玻片上，细胞融合密度为30%左右，培养24 h后加入不同终浓度的阿司匹林，继续培养24 h。

细胞用新配的40 g/L的多聚甲醛固定，4 ℃过夜，PBS洗3遍；用3 g/L的Triton X-100作用8 min以使细胞膜通透性增加；室温封闭1 h
后与1∶500稀释的抗NF-κB p65抗体4 ℃共育过夜；加入TRITC标记的二抗，室温温育1 h。

以上每步操作后均用PBS洗3遍。

用甘油封片后于荧光显微镜下
观察结果。

1.7 统计学分析数据以表示,用SPSS 11.5软件作统计分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 阿司匹林对AGS细胞株增殖的影响 AGS细胞株经阿司匹林作用24 h后，随
着阿司匹林从0.1 mmol/L增加到10 mmol/L，其对AGS细胞株增殖的抑制率从4.6%，增加到72.5%；在同一阿司匹林浓度组，随着阿司匹林作用时间的延长，
其对AGS细胞株增殖的抑制率逐渐增加，10 mmol/L的阿司匹林作用24、48、72 h，其对AGS细胞株增殖的抑制率分别为72.5%、79.6%、85.0%。

以上结果说明阿司匹林对AGS细胞株的抑制作用具有明显的量效和时效关系。

见表1。

表1 AGS细胞经不同浓度阿司匹林作用不同时间后测得的吸光度值注：*与对照组(0 mmol/L)比较，P<0.01。

阿司匹林浓度
(mmol/L)24h48h72h00．920±0．0081．098±0．0121．408±0．0060．10．878±0．007*0．983±0．029*1．144±0．007*1．00．821±0．009*0．88 7±0．025*0．982±0．013*5．00．470±0．035*0．484±0．008*0．573±0．026*10．00．253±0．013*0．224±0．015*0．211±0．009*
2.2 阿司匹林对胃癌细胞株AGS细胞生长周期的影响不同浓度阿司匹林作用于AGS细胞24 h后，细胞周期中DNA合成前期(G0/G1期) 的细胞比例增加，DNA合成期(S期)细胞比例下降，且随阿司匹林浓度的加大，变化更加明显(表2)。

表2 不同浓度阿司匹林对AGS细胞周期的影响注：与对照组(0 mmol/L)比较，
*P<0.05，**P<0.01。

阿司匹林浓度
(mmol/L)G0/G1SG2/M00．415±0．0120．393±0．0120．192±0．0220．1 0．459±0．009＊＊0．355±0．009＊＊0．186±0．0061．00．537±0．010＊＊0．286±0．012＊＊0．178±0．0195．00．614±0．007＊＊
0．227±0．018＊＊0．159±0．013*10．00．676±0．016＊＊
0．188±0．016＊＊0．136±0．008＊＊
2.3 阿司匹林对AGS细胞NF-κB p65表达的影响不同浓度阿司匹林与AGS细胞作用24 h，以及10 mmol/L的阿司匹林与AGS作用不同时间后，分别提取核蛋白，用western blotting检测NF-κB p65在核内的表达情况。

结果显示，阿司匹林能降低NF-κB p65在核内的表达，且随着阿司匹林浓度的增加和作用时间的延长，其表达明显降低(P分别<0.05及<0.01)。

见图1，图2。

注：**与对照组(0 mmol/L)比较，P<0.01，n=3。

图1 AGS细胞经不同浓度阿司匹林作用24 h后NF-κB p65的表达
注：**与对照组(0 h)比较，P<0.01，n=3。

图2 AGS细胞经10mmol/L阿司匹
林作用不同时间后NF-κB p65的表达
2.4 免疫荧光法检测NF-κB p65的表达免疫荧光检测结果显示，AGS细胞的胞
核可见红色荧光，随着阿司匹林浓度的增加和作用时间的延长，荧光强度逐渐减弱，在10 mmol/L的阿司匹林作用组，基本无荧光。

以10 mmol/L阿司匹林观察：
随作用时间的延长，荧光强度逐渐减弱。

作用达24 h时，NF-κB p65在核内的表达已非常低。

见图3，图4。

注：A,control； B～D,阿司匹林: 1 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L。

图3 AGS细胞经不同浓度阿司匹林作用24 h后NF-κB p65的表达(400×)
注：A,control； B,6 h； C,12 h；D,24 h。

图4 AGS细胞经10mmol/L阿司匹
林作用不同时间后NF-κB p65的表达(400×)
3 讨论
本研究通过MTT实验证实，阿司匹林对胃癌细胞AGS增殖有明显的抑制作用，
具有较好的量效和时效关系。

这与我们以前的报道[5]相似，说明阿司匹林能够抑
制胃癌细胞生长增殖。

在检测阿司匹林对胃癌细胞周期分布的影响时发现：不同浓
度阿司匹林组的G0/G1期的细胞比例明显高于对照组，DNA合成期(S期)细胞比例下降。

表明阿司匹林改变了AGS细胞的周期分布，使其阻滞在G0/G1期。

本实验结果表明，随着阿司匹林浓度的增加和作用时间的延长，细胞核内NF-κB p65表达明显降低。

提示阿司匹林对NF-κB信号通路的阻断导致AGS细胞在G1期停滞，从而抑制AGS细胞的增殖。

4 参考文献
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[5]姚红波，李永金，陶燕，等. 阿司匹林对胃癌细胞株SGC-7901增殖及核因子κB表达的影响[J]. 江苏大学学报(医学版), 2009, 19(1):39-42.。