引物设计软件使用

3 SYBR Green 法与Taqman法比较
优 点
对DNA模板没有选择性 ----适用于任何DNA 使用方便 -----不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜 对目标序列的高特异性 ------阴性结果确定 设计相对简单 ------与目标序列某一区 域互补 重复性比较好
缺 点
容易与非特异性双链/ 引物二聚体结合，产生假 阳性 但可以通过融解曲线的 分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高 只适合一特定的目标 委托公司标记，价格较 高 不易找到本底低的探针
二 同源性比对
引物最好在模板DNA的保守区内设计
NCBI Reference Sequence: XM_706717.1 NCBI Reference Sequence: XM_706739.1
第三部分 Real-time PCR设计原则 设计原则
引物设计原则
一 引物长度（primer length） 二 产物长度（product length） 三 Tm值(melting temperature) 四 碱基分布的均衡性（composition） 五 引物二级结构（duplex formation and hairpin） 六 引物3’端与引物5’端 七 引物的保守性与特异性
2 引物设计界面
First you can design the primer manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
3引物搜索选项设定
引物类型 搜索模式 引物长度 5’引物位置范 围 3’引物位置范 围 产物大小范围
1即引物设计2限制性内切酶位点分析3dna基元motif查找4同源性分析primerpremier50简介primerpremier50简介primerpremier50安装primerpremier50安装preimerpremier启动界面loadsequenceprimerpremier50使用介绍primerpremier50使用介绍基本信息sequencenameoriginalsequenceusetwobuttondnaseqproteinseqproteinseqdanseq8种密码子偏好choose引物设计界面firstyoucandesignprimermanuallysensestrandantisensestrandusefulinformationprimer3引物搜索选项设定引物类型搜索模式5引物位置范产物大小范围引物长度搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信双击选中一对引物引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpindimerfalseprimingcrossdimer一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构因此最好的情况是最下面的分析栏没有引物编辑引物编辑editprimerhereanalysiseditresultaccepteditresultreturnmainwindowprimerexpress30的使用primerexpress30的使用第五部分引物设计实例第六部分心得体会
五 二级结构
1 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；
Hairpin发夹结构
2 引物自身不能配对，否则易形成引物二聚体； Cross dimer 引物二聚体
引物3 端与5 六 引物3’端与5’端
引物3’端 1.不可修饰 2.最好为C、G， 不能为T 引物5’端 1.可修饰 2.稳定性高
七 引物保守性与特异性
1保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可 能多的型别 2特异性：避免非特异性扩增 2
第四部分 引物设计软件安装与使用
一 Primer Premier 5.0简介 主要功能: 1、即引物设计 2、限制性内切酶位点分析 3、DNA 基元(motif)查找 4、同源性分析
二 Primer Premier 5.0安装
1 Tm值在58-60℃之间 2 两条引物的Tm值尽量接近，相差最 好不超过2℃
GC含量 四 GC含量
1 GC含量一般40-60%(45-55%)
– GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于 提高PCR的特异性 – GC含量太高也易于引发非特异扩增。
2 避免多个重复碱基，尤其是4或超过4个的G碱基 3 上下游GC含量需相接近

三 Primer Premier 5.0使用介绍
Load sequence
Preimer Premier 启动界面
1 基本信息
Original sequence Sequence name
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好
二 Real-time PCR原理及荧光标记 RealPCR原理及荧光标记 非特异性荧光标记： 非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记： 特异性荧光标记：
2、TaqMan
3、Molecular Beacon
1 SYBR Green 法工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
6 引物编辑
引物编辑
Edit primer here
Analysis the edit result
Accept the edit result Return to the main window
四 Primer Express 3.0的使用
第五部分 引物设计实例
第六部分 心得体会
PCR特异性： 引物与靶DNA 特异结合 PCR灵敏性： DNA聚合酶能 对引物进行有 效的延伸
引物的重要性
1 准备工作 2目的基因的获取 3引物设计的原则 4引物设计软件的 安装与使用
引物的定义
合成引物的步骤
第一部分 引物设计准备工作
一 PCR与Real-time PCR PCR与RealPCR技术 技术： 常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 扩增反应的终点产物 无法对起始模板准确定量， 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时 检测 实时定量PCR技术： PCR技术 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应 荧光信号的变化实时检测PCR 每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct Ct值和标 中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标 准曲线的分析对起始模板进行定量分析 准曲线的分析对起始模板进行定量分析 起始模板
SYBR Green SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光， 在此阶段采集荧光信号。
TaqMan法工作原理 2 TaqMan法工作原理
TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补 5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
1.加拿大Premier公司开 发 2.适用：常规PCR和 Real-time PCR
1.ABI公司开发RealtimePCR仪器配套引 物设计软件 2.适用：Real-time PCR 局限性： 主要适用Taqman法。 考虑到“探针，及探 针与上下游引物的联 系”！条件限制很窄
四 实验设计及引物设计软件的选定
RealReal-time PCR 引物设计
PCR技术原理 PCR技术原理
以拟扩增的DNA分子为 模板，以一对与模板5′ 末端和3′末端互补的寡 核苷酸片段为引物，在 DNA聚合酶的作用下， 按照半保留复制的原则 沿模板链延伸,合成新的 DNA
引物
引物设计是PCR 技术中至关重要的一环 引物设计是 引物： 人工合成的两段 寡核苷酸序列
Real-time PCR SYBR Green法
探讨RTA2基 因mRNA表达 水平与耐药性 的关系
Primer premier 5.0
第二部分 目的基因序列的获取 同源序列比对
一 目的基因序列的获取
1 先查蛋白相关信息 了解基因编码产物 （） 2 核酸序列信息 Genebank、EBI、DDBJ 3 文献
SYBR Green 法 SYBR Green 法 SYBR Green SYBR Green SYBR Green 法 SYBR Green 法 SYBR Green SYBR Green Taqman 法 Taqman 法 Taqman 法 Taqman 法
三 常用引物设计软件的比较
Primer premier 5.0 Primer express 3.0
一 引物长度
1 一般为18-25bp 2 不应大于38，因为过长会导致其延伸温度 大于74℃ 3 两条引物长度不超过4bp
二 产物长度
1 最佳长度：50-150bp 2 最好不超过400bp 原因： 扩增片段越短，有效扩增反应越容易实现， 且较短的扩增片段也可保证分析的一致性
Tm值 三 Tm值
4 搜索结果
28对引物 引物分值 100分为满分 每对引物的信 息
双击选中一对 引物
回到主窗口
5 引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
一对理想的引物应当不存在任何一种 上述结构，因此最好的情况是最下面 的分析栏没有 But …