铜(Ⅱ)-氟喹诺酮类抗生素螯合物与虎红体系的吸收和共振瑞利散射光谱及其分析应用研究

铜(Ⅱ)-氟喹诺酮类抗生素螯合物与虎红体系的吸收和共振瑞
利散射光谱及其分析应用研究
刘弘;李勤;杨季冬
【摘要】在pH 4.2～4.8的B-R缓冲介质中,莫西沙星(MXFX)和加替沙星(GTF)等氟喹诺酮类抗生素(FLQs)能与铜(Ⅱ)形成螯合阳离子,进一步与虎红(Tf)阴离子通过静电引力和疏水作用形成FLQs∶Cu(Ⅱ)∶Tf为1∶1∶1的离子缔合物,体系反应导致共振瑞利散射(RRS)显著增强并出现新的RRS光谱.两种药物的反应产物具有相似的光谱特征,最大RRS峰位于373 nm处,并在590 nm处有1个较小的散射峰.在373 nm处一定浓度的抗生素与散射增强(△I)成正比,MXFX和GTF的线性范围分别为0.031 ～7.8 mg/L和0.029～9.0 mg/L.据此建立了测定氟喹诺酮类药物的新方法,方法用于胶囊和人尿液中FLQs的测定并取得满意结果.同时对反应机理及RRS增强原因进行了讨论.%In pH 4. 2 -4. 8 Britton - Robinson( B - R) buffer solution, moxifloxacin( MXFX) and gatifloxacin(GTF) of fluoroquinolone antibiotics(FLQs) could react with Cu( II ) to form chelate cat-ions , which further bind with tetrachlorotetraiodo-fluoresceindisodium salt (Tf ) to form FLQs s Cu ( II ) : Tf ( 1:1:1) ion association complexes. The system reactions resulted in the great enhancement of resonance Rayleigh scattering( RRS) and new RRS spectra appeared. The reaction systems of two drugs had similar spectral characteristics, the maximum RRS wavelength situated at 373 nm, and one small scattering peak situated at 590 nm. The intensities of RRS at 373 run are proportional to the concentrations of antibiotics drugs in the ranges of 0. 031 - 7. 8 mg/L for MXFX and 0.029 -9.0 mg/L for GTF. Based on this, a new method was
developed for the determination of FLQs in capsule and human urine samples. The reaction mechanism and the reasons for RRS enhancement of the system were also investigated.
【期刊名称】《分析测试学报》
【年(卷),期】2012(031)005
【总页数】6页(P546-551)
【关键词】莫西沙星;加替沙星;虎红;铜(Ⅱ);共振瑞利散射
【作者】刘弘;李勤;杨季冬
【作者单位】西南大学化学化工学院,重庆400715;重庆三峡职业学院农业工程系,重庆404000;西南大学化学化工学院,重庆400715;西南大学化学化工学院,重庆400715;重庆三峡学院化学与环境学院,重庆404000
【正文语种】中文
【中图分类】O657.3;TO460.72
莫西沙星(MXFX)和加替沙星(GTF)是第4代新型广谱8-甲氧氟喹诺酮类抗生素，与前三代同类药物相比具有吸收快、体内分布广、血浆半衰期长、可每日一次给药［1］等药代动力学特点。

喹诺酮类抗菌药物已广泛用于临床治疗以及兽药和饲料添加剂［2］，为保证畜牧业健康发展和食品安全，对这类药物的痕量测定，特别是药物残留量的检测显得尤其重要。

该类药物的定量测定方法有分光光度法［2－3］、荧光分析法［4－5］、化学发光分析法［6－8］、高效液相色谱法(HPLC)［9－10］、电化学分析法和毛细管
电泳法［11］等。

但分光光度法灵敏度较低，不能满足痕量喹诺酮类药物的测定
要求，而HPLC法样品处理过程复杂。

因此，亟待开发灵敏度高、选择性好的新
检测方法。

共振瑞利散射(RRS)作为新的分析技术，已有较多的研究报道，刘绍璞教授等丰富和拓展了小分子之间借静电引力、电荷转移作用和疏水作用形成离子缔合物而产生强烈RRS信号方面的研究，并将其用于药物分析和环境分析等方面［12－15］。

本文提出的分析测定氟喹诺酮类药物的RRS新方法尚未见报道。

本研究考察了反
应体系对吸收光谱的影响、离子缔合反应的RRS光谱特征、适宜的反应条件及影
响因素，并进行了实际样品测定。

同时对离子缔合物的反应机理以及RRS增强的
原因进行了讨论。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂
F-2500型荧光分光光度计(狭缝宽度5 nm);U-4100紫外/可见/近红外分光光度计(日本日立公司);pHS-25C数显酸度计(上海宇隆仪器有限公司)。

虎红(Tf，上海三
爱思试剂有限公司)溶液:取适量的虎红溶于二次蒸馏水配制1.0×10－3 mol/L的
贮备溶液，再稀释成1.0×10－4 mol/L的工作溶液。

硫酸铜(CuSO4·5H2O，成
都化学试剂厂)溶液:配制1.0×10－3 mol/L的贮备溶液，使用时稀释至1.0×10－
4 mol/L作为工作溶液。

氟喹诺酮类抗生素(FLQs)标准溶液:分别称取适量的莫西沙星(MXFX，拜耳医药保
健有限公司)和加替沙星(GTF，江苏豪森药业)配制300 mg/L的储备溶液，再用水稀释配成30 mg/L的工作溶液。

Britton－Robinson缓冲溶液(pH 3.0～5.5):用0.04 mol/L H3PO4、H3BO3和CH3COOH与0.2 mol/L NaOH按照一定比例混合，配成不同pH值的缓冲溶液，并用酸度计校正pH值。

其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 实验方法
向10.0 mL比色管中依次加入pH 4.4的B－R缓冲溶液、1.0×10－4 mol/L的硫酸铜溶液、1.0×10－4 mol/L的虎红溶液各1.0 mL，同时加入适量的氟喹诺酮类抗生素标准溶液，加水稀释至刻度，摇匀，放置10 min。

在荧光分光光度计上以λex=λem进行同步扫描，记录散射光谱，并于373 nm处分别测量三元离子缔合物的RRS强度I和试剂空白的RRS强度I0，计算ΔI=I－I0。

同时记录反应体系的吸收光谱。

2 结果与讨论
2.1 光谱特征
2.1.1 紫外可见吸收光谱铜(Ⅱ)－氟喹诺酮类抗生素－虎红反应体系的吸收光谱见图1。

由图1A可见，Tf的最大吸收波长位于546 nm，两种抗生素本身具有相似的光谱特征，其吸收波长分别位于292 nm(MXFX)和290 nm(GTF)。

当Cu(Ⅱ)与FLQs反应形成二元螯合物时，药物本身的λmax不变，吸光度略微增大。

但当形成Cu2+－FLQs－Tf三元配合物时，相对Tf产生明显的褪色作用，546 nm处的吸光度明显降低，且降低程度与两种药物的浓度呈线性关系，可用于氟喹诺酮类抗生素的测定。

图1B是Cu2+－GTF－Tf体系以试剂作空白时系列药物浓度的褪色光谱图。

2.1.2 RRS光谱铜(Ⅱ)－氟喹诺酮类抗生素－虎红体系的RRS光谱如图2所示。

从图2A可以看出，MXFX和GTF本身以及Cu2+和Tf的RRS均很微弱，当形成Cu(Ⅱ)－FLQs－Tf三元离子缔合物时，溶液的RRS显著增强，并出现新的RRS 光谱。

两种体系具有相似的RRS光谱特征，最大散射波长均位于373 nm附近，并在590 nm处有1个较小的散射峰。

GTF体系的相对散射强度(ΔI)大于MXFX 体系。

图2B为不同浓度GTF的RRS光谱，373 nm处散射强度(ΔI)值在一定范围
内与FLQs的浓度呈线性关系，可用于药物的定量测定。

图1 Cu2+－FLQs－Tf体系(A)和Cu2+－GTF－Tf体系(B)的吸收光谱Fig.1 Absorption spectra of Cu2+－FLQs－Tf system(A)and Cu2+－GTF－Tf system(B)c(Tf)=c(Cu2+)=1.0×10－5mol/L，pH 4.4;ing water as reference:1.GTF，2.Cu2+ －GTF，3.MXFX，4.Cu2+ －MXFX，5.Tf，6.Cu2+ －Tf，7.Cu2+ －GTF－Tf，8.Cu2+ －MXFX －Tf，ρ(drugs):3.0 mg/L;ing blank reagent as reference:ρ(GTF)(1 －5):3.0，3.6，4.2，4.8，5.4 mg/L
图2 Cu2+－FLQs－Tf体系(A)和Cu2+－GTF－Tf体系(B)的RRS光谱Fig.2 RRSspectra of Cu2+－FLQs－ Tf system(A)and Cu2+－GTF－Tf
system(B)c(Tf)=c(Cu2+)=1.0×10－5 mol/L，pH 4.4;A:1.GTF，2.Cu2+ －GTF，3.MXFX，4.Cu2+ －MXFX，5.Tf，6.Cu2+－Tf，7.Cu2+－MXFX－Tf，8.Cu2+－GTF－Tf;ρ(drugs):3.0mg/L;B:ρ(GTF)(1 －6):0，0.6，1.8，3.0，4.2，5.4
mg/L
2.2 适宜的反应条件
2.2.1 溶液酸度的影响考察了溶液的酸度对两种反应体系散射增强(ΔI)的影响，结
果见图3。

结果表明，两种体系的适宜反应酸度范围相似，当pH值在4.2～4.8
之间时，各体系的ΔI达到最大。

但溶液pH值大于4.8和小于4.2时ΔI均减小，不利于药物的测定。

本实验选用pH 4.4的缓冲溶液作为反应介质，缓冲溶液的最佳用量为1.0 mL。

2.2.2 缓冲类型的优化在最佳pH值条件下，考察了B－R、Na2HPO4－柠檬酸、NaAc－HCl、NaAc－HAc 4种缓冲溶液作为反应介质对反应体系ΔI的影响，结
果表明用B－R缓冲溶液作为反应介质的效果最好。

同时在反应体系中加入少量阴离子表面活性剂，发现阴离子表面活性剂的加入对体系反应无明显影响。

2.2.3 Cu2+用量的影响考察了Pd(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Cu(Ⅱ)对两种FLQs药物体系
RRS强度的影响。

结果表明不同金属离子所形成结合产物的RRS光谱特征相似，
但其引起的RRS增强程度不同，大小顺序为:Cu(Ⅱ)＞Pd(Ⅱ)＞Hg(Ⅱ)。

因此实验选用Cu(Ⅱ)作为配位离子。

由实验得知，2种反应体系中Cu2+的最佳浓度为0.4×10－5～1.6×10－5 mol/L。

当浓度小于0.4×10－5 mol/L时，Cu2+与药物不能充分结合，大于1.6×10－5 mol/L时体系空白将增大，故实验中Cu2+的最佳浓度为1.0×10－5 mol/L。

2.2.4 Tf浓度的影响考察了Tf浓度对2种体系ΔI值的影响。

实验结果表明，Tf
的浓度在0.4×10－5～1.3×10－5 mol/L 时2种体系的ΔI值均达到最大。

当浓
度小于0.4×10－5 mol/L时反应不完全，大于1.3×10－5 mol/L时空白增大，不利于药物的测定。

故本实验选用Tf的浓度为1.0 ×10－5 mol/L。

2.2.5 离子强度的影响用1.0 mol/L的NaCl溶液研究离子强度对体系RRS散射
强度的影响。

发现NaCl浓度小于0.3 mol/L时，试剂空白和体系的RRS强度均
对结合产物的散射强度无影响，但进一步增大NaCl的浓度会导致ΔI值逐渐降低。

2.2.6 温度的影响及共振瑞利散射强度的稳定性考察了温度对体系RRS强度的影响，结果表明在10～30℃条件下，RRS强度无明显变化。

因此，选择在室温条件下进行实验。

室温下，10 min后可使散射强度达到最大且在24 h内稳定。

图3 pH值对Cu2+－FLQs－Tf体系的影响Fig.3 Effect of pH value on Cu2+－FLQs－Tf systems ρ(drugs):1.5 mg/L;c(Tf)=c(Cu2+)=1.0 ×10－5 mol/L，pH 4.4
图4 Cu2+－GTF－Tf体系的RRS和吸收光谱的叠加图Fig.4 RRSand absorption spectra of Cu2+－GTF－ Tf system 1.absorption
spectra;2.RRS;ρ(GTF):3.0 mg/L;c(Cu2+)=c(Tf)=1.0×10－5 mol/L;pH 4.4
2.3 离子缔合反应
用摩尔比法和等摩尔连续变化法分别测定了三元离子缔合物的组成比，结果为
MXFX(GTF)∶Cu2+∶Tf=1∶1∶1。

在本实验的弱酸性介质中，GTF等氟喹诺酮类抗生素以中性分子型体存在［9］。

当Cu(Ⅱ)等金属离子与其反应时，通常是与4位羰基和3位羧基形成稳定的6元环结构螯合物，Cu2+与药物反应时，取代羧基的1个质子而形成1价螯合阳离子［Cu·GTF］+。

同时Cu2+与染料反应生成具有与药物相似的反应功能团(羰羧官能团)，可生成三元螯合物［Cu·GTF］·Tf。

2.4 RRS增强的原因
2.4.1 吸收光谱对RRS的影响由于RRS是由散射与光吸收发生共振而产生的散射－吸收－再散射过程，因此RRS光谱应与吸收光谱密切相关，从体系的RRS与吸收光谱的比较(图4)可以看出体系的RRS位于体系的吸收带中，显示了该反应体系的RRS光谱与吸收光谱之间存在较好的对应关系。

因此产生了共振增强效应，使散射强度显著增大，这是产生RRS的必要条件。

2.4.2 分子体积增大形成三元离子缔合物之前，氟喹诺酮类药物的分子量不大，如GTF为375.4，但当其与Cu2+和Tf形成三元离子缔合物后，分子量增大至1 456.54。

当体积难于计算时，根据简化的瑞利散射定律，散射强度与其质量成正比［10］:I=KcMI0。

其中，I为散射光强度，I0为入射光强度，K为比例系数，c 为散射分子浓度，M为分子量。

因此散射微粒分子量的增大也是引起散射增强的又一重要原因。

2.4.3 疏水界面的形成 Cu2+、虎红和氟喹诺酮均具有较强的亲水性，因此能很好地溶于水中形成水合物，而当形成三元离子缔合物后，三者所带的电荷被中和形成电中性配合物，整个离子缔合物由于其芳基骨架的疏水性可能与水之间形成疏水界面，这种疏水界面的形成有利于散射增强［16－17］。

将此水溶三元体系换成非水的醇溶体系实验，则RRS光谱大辐减弱，进一步证明了疏水界面的形成是导致散射增强的另一原因。

2.5 方法的灵敏度
在最佳实验条件下，将不同浓度的氟喹诺酮药物与Cu(Ⅱ)、虎红反应，测定吸收光谱(SP)和共振瑞利散射强度，以ΔA、ΔI对氟喹诺酮的浓度绘制工作曲线，其光谱响应特征结果见表1。

与SP法相比，RRS法具有更高的灵敏度。

表1 2种方法的分析性能对比Table1 Related parameters of the calibration graphs and the detection limits for fluoroquinolones?
2.6 方法的选择性及分析应用
2.6.1 共存物质的影响以GTF为例，研究了共存物质对测定的影响，当相对误差不超过5%时，共存物质的允许倍量见表2。

由表2可见，常见的金属离子、酸根离子、糖类、尿素及氨基酸等的允许量较大，但少量的Fe3+和Al3+却干扰比较严重，Co2+、Mn2+也有干扰。

若样品中存在此类金属离子，可加入1.0 mL 0.1 mol/L的NaF溶液掩蔽处理，因此方法具有良好的选择性，可用于药物分析。

表2 共存物质的影响(ρGTF=3.0 mg/L)Table2 Effects of coexistence substances(ρGTF=3.0 mg/L)a:1.0 mL of 0.1mol·L －1 NaF is added?
2.6.2 药物制剂中氟喹诺酮的含量测定取20粒加替沙星胶囊(湖北百亨迪药业有限公司，规格:0.1 g/粒)，倾出内容物，混匀，精密称取适量，溶于一定量水中，离心取上层清液，用适量水洗涤2～3次，并入上层清液，定容。

取适量按RRS方法测定，结果见表3。

2.6.3 尿样中MXFX的测定取正常人新鲜尿样，离心，取上层清液1.0 mL，按照实验方法测定尿样中的GTF，结果见表4。

方法显示了较好的准确度和精密度，加标回收率为98%～101%，RSD为1.6%～2.4%。

表3 胶囊中加替沙星的测定结果Table3 Results for the determination of GTF in tablet capsule (n=5)?
表4 尿样中GTF的测定结果Table4 Results for the determination of GTF in urine samples (n=5)?
3 结论
在弱酸介质中，Cu(Ⅱ)与氟喹诺酮类抗生素反应形成螯合物，然后与虎红形成离子缔合物，反应引起RRS的显著增强，吸收光谱发生褪色。

实验结果表明反应体系形成1∶1∶1的离子缔合物，且RRS光谱增强的强度和吸收光谱褪色程度均与药物浓度成正比，据此建立了一种简单快速灵敏的测定痕量氟喹诺酮药物的新方法。

方法可用于片剂、胶囊、滴眼液、针剂和人体尿样中氟喹诺酮类药物的测定，具有较好的应用前景。

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