211133768_高效液相色谱法测定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的基质干扰分析及定性确证

高效液相色谱法测定食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠的基质干扰分析及定性确证
丁　梅
（梅河口市食品药品检验检测中心，吉林梅河口 135000）
摘　要：目的：分析食品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠测定的基质干扰峰及定性确证。

方法：采用高效液相色谱法测定食品中的山梨酸、苯甲酸、糖精钠，当以乙酸铵溶液（20 mmol·L-1）+甲醇（95+5）为流动相出现可疑峰时，再以甲酸-乙酸铵溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸铵）+甲醇（92+8）为流动相分析可疑峰，在两种流动相（不同pH值）洗脱下，比较标液中目标峰与样品中可疑峰保留时间的一致性，定性确认样品中的可疑峰是否为目标峰。

结果：基质复杂的样品，单一以一种流动相的保留时间定性，容易出现假阳性情况，而以两种流动相保留时间综合定性验证，才能使样品检测结果更可靠。

结论：采用两种流动相洗脱下的保留时间进行综合定性分析，可有效避免样品基质干扰出现假阳性样品。

关键词：高效液相色谱法；山梨酸；苯甲酸；糖精钠；基质干扰峰；定性确证
Analysis and Qualitative Confirmation of Matrix Interference in the Determination of Sorbic Acid, Benzoic Acid, and Saccharin Sodium in Foods by High Performance Liquid
Chromatography
DING Mei
(Meihekou Food and Drug Testing Center, Meihekou 135000, China)
Abstract: Objective: To analyze the matrix interference peaks in the determination of sorbic acid, benzoic acid and saccharin sodium in foods and to qualitatively confirm them. Method: The sorbic acid, benzoic acid and saccharin sodium in foods were determined by HPLC. When the suspicious peak appeared in the mobile phase of ammonium acetate solution (20 mmol·L-1)+methanol (95+5), and then the mobile phase of formic acid-ammonium acetate solution (2 mmol·L-1 formic acid-20 mmol·L-1 ammonium acetate)+methanol (92+8) was used to analyze the suspicious peak. Compare the consistency of retention time between the target peak in the standard solution and the suspicious peak in the sample, and qualitatively confirm whether the suspicious peak in the sample is the target peak. Result: For samples with complex matrix, the retention time of one mobile phase alone can easily lead to false positive. However, the comprehensive qualitative verification of the retention time of two mobile phases can make the sample test results more reliable. Conclusion: Using the retention time under the elution of two mobile phases for comprehensive qualitative analysis can effectively avoid the false positive sample caused by sample matrix interference.
Keywords: high performance liquid chromatography; sorbic acid; benzoic acid; sodium saccharin; matrix interference peak; qualitative confirmation
苯甲酸、山梨酸、糖精钠是食品中应用最广泛、最常见的食品添加剂，在《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）[1]中明确规定了其使用范围和限量，被国家食品安全监管部门列
作者简介：丁梅（1970—），女，吉林梅河口人，大专，高级工程师。

研究方向：食品检验与分析。

为重点监测的检测项目。

目前食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠测定方法有液相色谱法[2-8]和气相色谱法[8-10]和超高效液相色谱串联质谱法[11]，其中高效液相色谱法因检验成本低、前处理简单、设备通用性和普及性好而成为主要检测方法之一。

目前色谱分析主要是以保留时间进行定性，对于基质复杂的样品，相同保留时间段常有基质干扰峰出现，尤其是以一种流动相洗脱下的保留时间进行定性往往会出现假阳性样品。

本文根据目标物的出峰时间会随着流动相pH值的不同而发生改变这一现象[12-13]，研究以乙酸铵溶液+甲醇（95+5）为流动相出现可疑峰时，再以（甲酸-乙酸铵溶液）+甲醇（92+8）为流动相分析可疑峰，通过不同pH的两种流动相洗脱下的保留时间进行综合定性分析，可以有效避免由样品基质干扰出现假阳性样品，在实际检测工作中效果较好。

1　材料与方法
1.1　仪器与试剂
LC20AT高效液相色谱仪（配紫外检测器，日本岛津公司）；重载数显型涡旋混合器（美国Talboys 公司）；KQ-500DE超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；KH20R-Ⅱ高速冷冻离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。

甲醇、甲酸（色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司）；标准物质苯甲酸、山梨酸、糖精钠（德国Dr.Ehrenstorfer公司）。

20 mmol·L-1乙酸铵溶液：称取1.54 g优级纯乙酸铵（Alfa Aesar），加1 000 mL水溶解，过0.22 μm 滤膜后备用。

甲酸-乙酸铵溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸铵）：在1 000 mL乙酸铵溶液（20 mmol·L-1）中加入75.2 μL甲酸，混合后过0.22 μm滤膜后备用。

1.2　色谱条件
色谱柱：Shimpack VP-ODS（5 μm，250 mm×4.6 mm）；检测波长：230 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL；流速：1.0 mL·min-1；流动相1：20 mmol·L-1乙酸铵溶液+甲醇（95+5）；流动相2：甲酸-乙酸铵溶液（2 mmol·L-1甲酸-20 mmol·L-1乙酸铵）+甲醇（92+8）。

1.3　标准溶液配制
苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准储备溶液：分别准确称取标准物质各0.01 g于10 mL容量瓶中，分别用甲醇溶解并定容，配制的储备液浓度均为1 mg·mL-1。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠混合标准溶液：分别准确吸取苯甲酸、山梨酸、糖精钠标准储备溶液适量，用超纯水逐级稀释配制混合标准溶液，其浓度为5 μg·mL-1。

1.4　样品处理
称取样品2 g（精确至0.001 g）于50 mL具塞刻度试管中，加入25 mL水，涡旋1 min，超声30 min，加亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各2 mL，混匀，加水定容至刻度，静置30 min。

取适量上清液于10 000 r·min-1离心5 min，过0.22 μm滤膜备用。

1.5　定性分析
以乙酸铵溶液+甲醇（95+5）为流动相，分别进样混标液和样液，经色谱柱分离后以保留时间定性，若出现可疑色谱峰时，再以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇（92+8）为流动相分析可疑峰，采用两种流动相洗脱下的保留时间进行综合定性分析，进一步定性验证样品中可疑色谱峰是否为目标峰。

2　结果与分析
2.1　以乙酸铵溶液+甲醇为流动相的检测结果
随机选取市售肉千子、蛋糕、冷面、红方样品，经前处理后，以乙酸铵溶液+甲醇（95+5）为流动相（流动相1）进行色谱分析，并与混合标准溶液色谱图进行比较。

以保留时间定性可知，肉千子中检出山梨酸，未检出苯甲酸、糖精钠（图1）；蛋糕中检出糖精钠，未检出苯甲酸、山梨酸（图2）；冷面中检出山梨酸，未检出苯甲酸、糖精钠（图3）；红方中检出苯甲酸，未检出山梨酸、糖精钠（图4）。

-10 000
0.0 5.010.015.020.025.030.0min
混合标准溶液（浓度5 μg·mL-1）
肉千子样品
-5 000
5 000
10 000
15 000
20 000
25 000
山
梨
酸
苯
甲
酸
糖
精
钠
30 000
35 000
40 000
45 000
50 000
uV
图1　肉千子样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）
-10 000
010 000
20 00030 00040 00050 00060 00070 0000.0
5.0
10.015.0
20.0
25.0
30.0
min
混合标准溶液（浓度5 μg ·mL -1）山梨酸
苯甲酸
糖精钠
uV
肉千子样品
图2　蛋糕样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）
0.0
-15 000
-10 000-5 00005 000
10 00015 00020 00025 00030 000 5.010.015.020.025.030.0min
山梨酸
苯甲酸
糖精钠
uV
混合标准溶液（浓度5 μg ·mL -1）
冷面样品
图3　冷面样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
-25 000
025 000
50 00075 000100 000125 000150 000山梨酸
苯甲酸
糖精钠
uV
混合标准溶液（浓度5 μg ·mL -1）红方样品
图4　红方样品和混合标准溶液色谱图（流动相1）
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
-10 000
10 000
20 00030 00040 00050 00060 00070 00080 0000uV 山梨酸苯
甲酸
糖精钠
肉千子样品
混合标准溶液（浓度5 μg ·mL -1）
图5　肉千子样品和混合标准溶液色谱图（流动相2）
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
-10 000
-7 5000-5 0000
-2 50002 500
5 0007 50010 00012 50015 00017 500
20 000
uV
山梨酸
苯
甲酸
糖精钠
蛋糕样品
混合标准溶液（浓度5 μg ·mL -1）
图6　蛋糕样品和混合标准溶液色谱图（流动相2）
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
-10 000
-5 000
05 000
10 000
15 00020 000uV
山
梨酸
苯甲酸
糖
精钠
冷面样品
混合标准溶液（浓度5 μg ·mL -1）
图7　冷面样品和混合标准溶液色谱图（流动相2）
2.2　以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇为流动相的定性确证
将上述肉千子、蛋糕、冷面、红方样品，以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇（92+8）为流动相（流动相2）进行色谱分析，并与混合标准溶液色谱图进行比较。

以保留时间定性可知，肉千子中未检出苯甲酸、山梨酸、糖精钠（图5）；蛋糕中未检出苯甲酸、山梨酸、糖精钠（图6）；冷面中检测出山梨酸，未检出苯甲酸、糖精钠（图7）；红方中未检出苯甲酸、山梨酸、糖
精钠（图8）。

由两种流动相保留时间综合定性分析得出，肉千子中山梨酸为假阳性，蛋糕中糖精钠为假阳性，冷面中山梨酸为阳性，红方中苯甲酸为假阳性。

2.3　样品检测结果
随机选取市售样品基质相对复杂的15种样品进行苯甲酸、山梨酸、糖精钠测定，分别以两种流动相洗脱进行色谱分析，定性结果见表1。

以乙酸铵溶
液+甲醇（95+5）为流动相时，15种样品中均检测出
表1　样品中山梨酸、苯甲酸、糖精钠定性确证结果
项目乙酸铵溶液+甲醇（95+5）甲酸-乙酸铵溶液+甲醇（92+8）苯甲酸山梨酸糖精钠苯甲酸山梨酸糖精钠肉千子未检出检出未检出未检出未检出未检出老式蛋糕未检出未检出检出未检出未检测未检出枣沙蛋糕未检出检出检出未检出检出未检出蛋糕未检出未检测检出未检出未检出未检出酥饼未检出未检出检出未检出未检出未检出月饼未检出检出未检出未检出检出未检出冷面未检出检出未检出未检出检出未检出玉米冷面未检出检出未检出未检出未检出未检出腐竹未检出检出未检出未检出未检出未检出复合调味料检出检出未检出检出检出未检出大酱未检出未检出检出未检出未检出未检出红方未检出未检出检出未检出未检出未检测葡萄酒检出未检出未检出未检出未检出未检出红方检出未检出未检出未检出未检出未检出青方
检出
未检出
未检出
未检出
未检出
未检出
5.0
10.0
15.0
20.0
25.0
30.0
min
25 000
50 00075 000100 000125 000150 000175 000200 000uV
山梨酸
苯甲酸
糖精钠
红方样品混合标准溶液（浓度5 μg ·mL -1） 图8　红方样品和混合标准溶液色谱图（流动相2）
食品添加剂；以甲酸-乙酸铵溶液+甲醇（92+8）为流动相时，15种阳性样品中有12种样品为假阳性，假阳性率80%。

这是由于基质复杂样品仅以一种流动相的保留时间进行定性时，容易出现假阳性样品，而以两种流动相保留时间综合定性验证，才能使样品检测结果更加准确可靠。

3　结论
本研究应用高效液相色谱法测定基质复杂样品中的山梨酸、苯甲酸、糖精钠，采用不同pH 的两种流动相洗脱下的保留时间进行综合定性分析，可有
效避免由样品基质干扰出现的假阳性样品的情况。

该方法在实际工作中得到了较好的应用，发挥了有效的作用。

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