多肽的化学合成

树脂的选择
将固相合成与其他技术分开来的最主要的特征是固 相载体，能用于多肽合成的固相载体必须满足如下 要求：
必须包含反应位点（或反应基团）； 必须对合成过程中的物理和化学条件稳定； 允许在不断增长的肽链和试剂之间快速、不受阻碍的接触； 提供足够的连接点，以使每单位体积的载体给出有用产量的
脂或对乙酰基苄脂树脂；
• Boc保护α-氨基的氨基酸衍生物共价交联到树脂上，用TFA 脱除Boc，三乙胺中和游离的氨基末端
用此法合成的肽能保持光学纯度。
2、偶联剂缩合法
• 偶联剂本身是一种脱水剂，能够促进羧基和氨基 之间的缩合反应
• 缩合剂可以直接与一个羧基被保护的氨基酸和一 个氨基被保护的氨基酸一起反应；
N，Ｎ’ －二环己基碳二亚胺
N=C=N
dicyclohexylcarbodimide (DCC)
DCC先与一份子氨基酸的羧基反应，形成类似酸酐的中间产 物，中间产物再与第二分子氨基酸的氨基作用，形成肽键
ZNHCHCOOH + DCC + NH2CHCOOCH 2C6H5
R
R'
接肽
O
O
ZNHCHCN HCHCOCH2C6H5
H2 / Pd-C
R
R'
去保护基
O
O
+
NH3CHCN
HCHCO-
R
R'
反应中产生的二环已脲（DCU），不溶于大多数有机溶 剂，容易与产物分离。
3、脱保护基
脱保护基的方法形形色色，其重要性不亚于多肽的合成。 三氟乙酸（TFA）是最常用的脱保护基试剂，可以脱除一 些不耐酸的保护基如Boc、tBu等。 TFA法比较温和，副反应少，因此得到越来越多的应用。 不足是用量比较大。
接肽
H+
（1mol）
C6H5CH2OC-NHCH2C-NHCH2COOH
SOCl2
去保护基
H2 Pd/C
O C6H5CH3 + CO2 + H3N+CH2C-NHCH 2COO-
H+
[C6H5CH2OCOOH] + 2 H3N+CH2COO-
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2、羧基的保护
• 与氨基保护基比较，羧基保护基种类较少； • 一般以盐或酯的形式加以保护； • 常用的有钾盐、钠盐、三乙胺盐等； • 常用的酯类有：甲酯和乙酯、苄酯 、叔丁酯； • 叔丁酯是近年来最常用的羧基保护基。
CH3
ClCOOC2H5
O
OO
BOCNHCHC-N HCHCOCOEt
CH3 R
H3N+CHCOO-
R'
CH3 R
OHale Waihona Puke OBOCNHCHC-N HCHCNHCHCOO H H+
CH3 R
R'
O
O
N+H3CHC-NHCHCNHCHCOO -
CH3 R
R'
（4） 叠氮法
氨基酸酯与肼作用生成酰肼，酰肼与亚硝酸作用则生成叠 氮化合物，这个叠氮化合物与另一氨基酸酯作用即能缩合成二 肽。此法可称为叠氮法；
（2）用叔丁氧羰基保护
t-Boc是常用的氨基保护基。 二叔丁基二碳酸酯与氨基酸作用，形成t-Boc-氨基酸，可 以有效地保护氨基； t-Boc基可以在温和的酸性条件下，以气态形式被除去。
O (CH3)3COC-
t-Butoxycarbonyl 简写BOC
在多肽中的应用
R
O
OR
H3N+-CH-COO- (CH3)3COCCl -OH, 25oC (CH3)3COC-HN-CH-COO-
返回
氨基酸 Ala(A) Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C) Gln(Q) Glu(E) Gly(G) His(H) Ile(I) Leu(L) Lys(K) Met(M) Orn(O) Phe(F) Pro(P) Ser(S) Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val(V)
液相合成法最经典的例子是牛胰RNaseA的合成。
多肽的固相合成法 Solid phase peptide synthesis
以往的多肽合成是在溶液中进行的； 自从1962年麦瑞菲尔德-Merrifield发展新的固相多肽合成 方法以来，经过不断的改进和完善，到今天固相法已成为多 肽和蛋白质合成中的一个常用技术，表现出了经典液相合成 法无法比拟的优点。 固相合成法的特点是不必纯化中间产物，合成过程可以连 续进行，已经发展成为多肽自动合成仪。
O CH2 O C Cl
Benzoxycarbonyl（简写Z）
Z在弱酸性条件下比较稳定，但在催化氢解条件 下容易被除去。产物也容易分离。
反应过程
O
O
+NH3CH2CO2-
C6H5CH2OCCl
OH- 上保护基
C6H5CH2OC-NHCH2COO-
H+
O
O
C6H5CH2OC-NHCH2CCl
O
O
+NH3CH2CO2-, OH-
R’-NH2
1、羧基活化法
• 羧基的羟基不是一个好离去的基团； • 羧基本身不是一个最好的酰基化剂； • 羧基的活化是将羧基转变成一个活泼的羧基衍生物，提
高羧基的酰化能力。 • 叠氮法、混合酸酐法和活化脂法均是温和的方法，已经
被广泛应用于肽的合成
（1）酰氯法
• 最早使用的方法； • 氨基酸的酰氯容易与氨基作用形成肽键； • 由于反应过程中容易引起氨基酸消旋化，实际
（一）氨基酸常用的保护方法
多肽合成必须解决下面四个问题
1.氨基保护 2. 羧基保护 3. 侧链保护 4. 接肽方法
保护基必须具备的条件
易在预定的部位引入，在接肽时能起保护作用； 在某特定的条件下，保护基很易除去； 引入和除去保护基时，分子中的其它部位
不会受到影响，特别是已接好的肽键。
1、氨基的保护
羧基的亲电能力，使更容易形成酰胺键。
实例：对硝基苯酯，就是一个更为活泼的酯基
O (CH3)3COCCl + N+ H3CHCOO -
O
HO
NO2
(CH3)3COCNHCHCOOH
CH3 O (CH3)3COCNHCHCOO
H3N+CHCOOR
NO2
CH3
O BOCNHCHC-N HCHCOOH
N(C2H5) 3
固相合成法的类型
• 在固相合成绝大多数常用二氯甲烷为溶剂； • a-氨基用Boc（叔丁氧羰基）保护的称为Boc固相合成法， • a-氨基用Fmoc（芴甲氧羰基）保护的称为Fmoc固相合成法。
丁氧羰基（Boc）固相合成法
• 侧链保护基采用苄醇类； • 常用树脂为氯甲基化聚苯乙烯树脂或羟甲基化聚苯乙烯树
常用氨基保护基的方法：酰化 最广泛应用的氨基保护基(PG)是叔丁氧甲酰基(t-Boc)
三苯甲基、对甲苯磺酰基、芴甲氧羰基（Fmoc)，可用 HBr/CH3COOH在室温下除去； 苄氧酰基（CBz），通过催化加氢或用金属钠在液氨中处理 除去；
（1）用芴甲氧羰基保护
Ｎ’－芴甲氧羰基（Fmoc）基团作为保护基的优点： Fmoc基团可被碱脱除 对酸稳定，用三氯乙酸较强酸处理不受影响； 仅用温和的碱处理，通过β-消除反应即可脱去，不需要三级胺 中和； Fmoc基团有特征性的紫外吸收，易于监测反应的进行，给使 用仪器自动化合成多肽带来许多方便。
3、侧链的保护
功能性基团
—— 胍基Guanidine N 酰胺amide 羧基carboxyl 疏基sulfhydryl 酰胺amide 羧基carboxyl
—— 咪唑imidazole
——
—— 氨基amino
—— 氨基amino
——
—— 羟基hydroxyl 羟基hydroxyl 吲哚indole 苯基phenol 羟基hydroxyl
这些树脂只有导入反应基团，才能直接连上第一个氨基酸； 根据所导入反应基团的不同，又把这些树脂及树脂衍生物分 为氯甲基树脂、羧基树脂、氨基树脂； 氨基酸的固定主要是通过保护氨基酸的羧基同树脂的反应基 团之间形成的共价键来实现的。
高分子载体共价键形成的方法
氯甲基树脂：通常先制得保护氨基酸的四甲铵盐或钠盐、钾 盐、铯盐，然后在适当温度下，直接同树脂反应或在合适的有 机溶剂如DMF或DMSO中反应； 羧基树脂，通常加入适当的缩合剂如DCC或羧基二咪唑，使 被保护氨基酸与树脂形成共酯以完成氨基酸的固定； 氨基树脂或酰肼型树脂，加入适当的缩合剂如DCC后，通过 保护氨基酸与树脂之间形成的酰胺键来完成氨基酸的固定。
肽，并且必须尽量减少被载体束缚的肽链之间的相互作用。
固相法合成多肽的高分子载体
主要有三类： 聚苯乙烯-苯二乙烯交联树脂 聚丙烯酰胺 聚乙烯-乙二醇类树脂及衍生物
聚苯乙烯树脂
CH CH2 CH CH2 CH CH2
CH CH2 CH CH2 CH CH2
CH CH2
COOH NH2
CH2Cl
固相法合成多肽的高分子载体作用
应用价值小。
（2）混合酸酐法
• 氨基酸的羧基可以转化成酸酐； • 酸酐有两个亲电中心，在形成肽键时能够产生几乎等量的
副产物，应用不对称酸酐可以克服此缺点； • 氨基被保护的氨基酸在低温且有叔胺的存在下与氯甲酸乙
酯生产成混合酸酐能与另一个氨基酸脂缩合成肽 • 在无水溶剂中可以减小消旋，保持很低的水平。
上保护基
NH2
O R O CH3
CH3CHCOOH (CH3)3COC-NH-CH-CNHCHCOOH
接肽（过程略）
CF3COOH 去保护基
R O CH3 (CH3)3C+ + CO2 + +NH3CHCNHCHCOO -
（３）用苄氧酰基（或称苯甲氧基甲酰氯）保护
C6H5CH2OH+COCl2（光气)
多肽的化学合成
多肽的化学合成
• 多肽的化学合成，是按照设计的氨基酸顺序，通过定向形成 酰胺键方法得到目标多肽分子；
• 氨基酸之间形成酰胺键的反应相当复杂； • 要成功的合成具有特定氨基酸顺序的多肽，必须采用定向形
成酰胺键方法，即对暂时不参予形成酰胺键的氨基和羧基， 以及侧链活性基团进行保护。同时还要对羧基进行活化。
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实例：巯基的保护
巯基经常用苄基和对甲氧苄基，如下式苯甲基保护
C6H5CH2Cl
HSCH2 + ZNHCHCOOR
CH2SCH2C6H5 上保护基 ZNHCHCOOR
Na, NH3(l)
去保护基
CH2SH ZNHCHCOOR 空气中氧化
CH2S ZNHCHCOOR
SCH2 ZNHCHCOOR
固相合成法的基本原理
• 先将所要合成目标肽链的C-末端氨基酸的羧基以共价键形式 与一个不溶性的高分子树脂相连；
• 然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与；另一分子氨基酸的 羧基作用（用DCC做偶联剂）形成肽键；
• 重复（缩合→洗涤→去保护→中和和洗涤→下一轮缩合）操 作，达到所要合成的肽链长度，最后将肽链从树脂上裂解下 来，经过纯化等处理，即得到目标的多肽。
CH3
C6H5CH2CHCOOH NH2
接肽
O CH2C6H5 ZNHCHCN HCHCOOH
CH3
H2/Pd-C
O CH2C6H5 N+ H3CHCNHCHCOO-
CH3
（3）活化酯法
• 普通的氨基酸烷基酯就可以酰化另一氨基酸的氨基； • 氨基被保护的氨基酸对硝基苯脂能与另一氨基酸的氨基缩合
成肽，此法作用温和、产率较高； • 但如不够活泼时，可以在酯基内加入强吸电子基因，以增加
保护基团 None Pbf, Mtr, Pmc Trt, Mebh, Tmob OtBu, OAI° Trt, Acm°,tBu°,Stbu Trt, Mbh, Tmob OtBu, OAI° None Trt, Boc None None Boc, Aloco,Fmoc° None
Boc None None tBu tBu Boc tBu none
（三）多肽的固相合成
• 液相合成法 • 固相合成法
液相合成法
可以分为逐步延长法（stepwise elongation)和片段缩合法 (fragment condensation)。
前者常用于合成小肽，后者用于合成比较长的肽链。其中 的片段缩合法可以分为大片段缩合法、较大片段缩合法和 较小片段缩合法三种。
保护基可以在钠、液氨作用下除去。
（二）肽键的形成方法
具有游离氨基的组分称为氨基组分，具有游离羧基的组 分称为羧基组分。
肽键生成的原理是：将N-保护氨基酸或肽的羧基转化 成活化型的RCOX，使得羰基碳原子带有较强的正电性而有 利于氨基组分对它进行亲核反应生成肽键。
RCOOH—— RCO－X ——— RCONHR’＋ HX
Z-氨基酸的三乙胺盐和氯代甲酸酯反应生成混合酸酐
H3N+CHCOOCH3
-OH, 25oC
C6H5CH2OCOCl
ZNHCHCOOH CH3
N(C2H5)3 -5-0oC
[ZNHCHCOO-]N+ H(C2H5)3 CH3
ClCOOC2H5 -(C2H5)3N•HCl
OO ZNHCHCOCOC 2H5