盐酸替罗非班细菌内毒素检查项可行性研究

盐酸替罗非班细菌内毒素检查项可行性研究
张广伟１，张军霞１，范玲玲２，石勇志２
（１．河南省食品药品检验所，郑州４５０００３
２．河南润弘制药股份有限公司，郑州４５１１００）
摘要　目的：研究原料药盐酸替罗非班细菌内毒素检查方法，为该品种设立细菌内毒素检查项提供依据。

方法：参照《中国药典》２０１５年版四部通则１１４３细菌内毒素检查法，计算并设定本品细菌内毒素限值，选择两个厂家的鲎试剂分别对三批样品进行了干扰试验和细菌内毒素检查。

结果：盐酸替罗非班对ＴＡＬ与细菌内毒素的凝集反应有干扰作用，使用Ｔｒｉｓ缓冲液将供试品稀释至０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１可排除干扰。

结论：将盐酸替罗非班用Ｔｒｉｓ缓冲液稀释至０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１，即可排除干扰进行细菌内毒素检查，限值拟定为每１ｍｇ盐酸替罗非班中含内毒素的量应小于５ ０ＥＵ。

关键词：盐酸替罗非班；细菌内毒素；干扰试验；Ｔｒｉｓ缓冲液；鲎试剂
中图分类号：Ｒ９２１ ２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９－３６５６（２０２０）－５－０４５５－４
ｄｏｉ：１０ １９７７８／ｊ ｃｈｐ ２０２０ ０５ ０１５
Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｎｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
ｔｅｓｔｆｏｒｔｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
ＺＨＡＮＧＧｕａｎｇｗｅｉ１，ＺＨＡＮＧＪｕｎｘｉａ１，ＦＡＮＬｉｎｇｌｉｎｇ２，ＳＨＩＹｏｎｇｚｈｉ２
（１ ＨｅｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇｃｏｎｔｒｏｌ，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００３，Ｃｈｉｎａ；
２．ＨｅｎａｎＲｕｎｈｏｎｇＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ４５１１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｆｏｒｄｒｕｇｓｕｂｓｔａｎｃｅｏｆｔｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏ ｃｈｌｏｒｉｄｅａｎｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｔｈｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒａｄｍｉｓｓｉｏｎｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｉｎｉｔｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄ：Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｏｆｔｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｗａｓｓｅｔａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｇｅｎｅｒａｌｃｈａｐｔｅｒ１１４３ｉｎＣｈＰ２０１５ ＶｏｌⅣ．Ｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｅｓｔｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｆｏｒｔｈｒｅｅｂａｔｃｈｅｓｏｆｓａｍｐｌｅｓａｎｄｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｗａｓｔｅｓｔｅｄｗｉｔｈｔｗｏｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ′ＴＡＬｒｅａｇｅｎｔｓｓｅｐｅｒａｔｅｌｙ Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＴｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅｈａｄｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｎｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎＴＡＬｒｅａｇｅｎｔａｎｄｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ，ａｎｄｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｅｌｉｍｉｎａｔｅｄｂｙｄｉｌｕｔｉｎｇｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｔｏ０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１ｗｉｔｈＴｒｉｓｂｕｆｆｅｒ Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｔｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ′ｓｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｎｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｃａｎｂｅｅｌｉｍｉｎａｔｅｄｂｙｄｉｌｕｔｉｎｇｔｈｅｓａｍｐｌｅｓｔｏ０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１ｗｉｔｈＴｒｉｓｂｕｆｆｅｒ，ａｎｄｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｃｏｎｔｅｎｔｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎ５ ０ＥＵｐｅｒｍｇｏｆｔｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｔｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄ；ｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ；ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｅｓｔ；Ｔｒｉｓｂｕｆｆｅｒ；ＴＡＬ
盐酸替罗非班（Ｔｉｒｏｆｉｂａｎｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）是替罗非班的盐酸盐，适用于不稳定型心绞痛或非Ｑ波心肌梗塞病人等，预防心脏缺血事件，同时也适用于冠脉缺血综合征病人进行冠脉血管成形术或冠脉内斑块切除术，以预防与治疗冠脉突然闭塞有关的心脏缺血并发症。

盐酸替罗非班是一种非肽类的血小板糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ受体的可逆性拮抗剂，该受体是与血小板聚集过程有关的主要血小板表面受体，盐酸
第一作者简介：张广伟，副主任药师；研究方向：药检药理、毒理。

Ｔｅｌ：０３７１ ６０３０２８３１；Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｇｗｒｅｎ＠１２６ ｃｏｍ
替罗非班阻止纤维蛋白原与糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ的结合，因而阻断血小板的交联及血小板的聚集［１ ２］。

本实验探讨盐酸替罗非班建立细菌内毒素检查项的可行性，现报道如下。

１　仪器与试药
１ １　仪器
ＥＴ ９６内毒素凝胶法测定仪（天津市天大天发科技有限公司）；ＺＨ ２型自动漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）。

１ ２　试药
盐酸替罗非班（原料药，批号１７１００９、１７１０１８、１７１０２７，河南润弘制药股份有限公司生产）。

鲎试剂（ＴＡＬ，批号１７０６０１２，规格为０ ５ｍＬ，灵敏度０ ２５ＥＵ·ｍＬ－１，湛江博康海洋生物有限公司；批号１７０３０９，规格为０ ５ｍＬ，灵敏度０ ２５ＥＵ·ｍＬ－１，厦门鲎试剂生物科技股份有限公司）。

细菌内毒素工作标准品（ＷＳＥ，规格为８０ＥＵ，批号１５０６０１ ２０１７８３，中国食品药品检定研究院）。

细菌内毒素检查用水（ＢＥＴ用水，批号１６０７０４０，规格为５ｍＬ，湛江博康海洋生物有限公司）。

Ｔｒｉｓ缓冲液（批号１７０３２３０，规格４ｍＬ，湛江安度斯生物有限公司）。

２　方法与结果
２ １　供试品细菌内毒素限值（Ｌ）的确定
根据细菌内毒素限值的计算公式：Ｌ＝Ｋ／Ｍ，其中Ｋ为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂的Ｋ值为５ＥＵ·（ｋｇ·ｈ）－１，Ｍ为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，人均体重按６０ｋｇ计算。

参照厂方提供的本品制剂盐酸替罗非班注射液拟用于临床的适应症及用法用量的说明，滴注速率０ ４μｇ·（ｋｇ·ｍｉｎ）－１为本品成人一次最大给药剂量（按１ｈ计），将本品溶于０ ９％氯化钠注射液或５％葡萄糖注射液中，终浓度为５０μｇ·ｍＬ－１（按５００ｍＬ计），则Ｌ＝Ｋ／Ｍ＝５ＥＵ·（ｋｇ·ｈ）－１／０ ４×６０μｇ（ｋｇ·ｈ）－１＝２０８ ３ＥＵ·ｍｇ－１。

考虑到本品为急救用药和联合用药等多种因素，严格控制本品的内毒素含量，提供可靠的临床用药安全保证，结合厂方提供的研究资料，本品内毒素限值拟定为：每１ｍｇ盐酸替罗非班中含内毒素的量应小于５ ０ＥＵ。

２ ２　鲎试剂灵敏度的复核
按照《中华人民共和国药典》２０１５年版四部通则１１４３细菌内毒素检查法要求复核所用鲎试剂，结果均符合规定。

见表１。

表１　鲎试剂灵敏度复核结果
Ｔａｂ １　ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴＡＬ
鲎试剂（ＴＡＬ）标示灵敏度（λ）／
（ＥＵ·ｍＬ－１）
内毒素浓度（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｃｏｎｃｅｒｔｒａｔｉｏｎ）／（ＥＵ·ｍＬ－１）
０ ５０ ２５０ １２５０ ０６２５
阴性对照
（ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ）
复核灵敏度（λｃ）／
（ＥＵ·ｍＬ－１）
１７０６０１２０ ２５＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－０ ３５１７０３０９０ ２５＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－０ ４２
２ ３　干扰试验预试验
根据凝胶法市售鲎试剂灵敏度在０ ５～０ ０３ＥＵ·ｍＬ－１，计算出有效稀释浓度为０ １～０ ００６ｍｇ·ｍＬ－１。

由于盐酸替罗非班在水中微溶或极微溶，在预实验中，精密称取盐酸替罗非班适量，加内毒素检查用水适量，涡旋，使完全溶解，制成１ ０ｍｇ·ｍＬ－１浓度的盐酸替罗非班溶液，再依次用内毒素检查用水分别稀释至０ ５、０ ２５、０ １２５、０ ０６２５、０ ０３１２５ｍｇ·ｍＬ－１，分别用两家公司生产的鲎试剂（灵敏度均为０ ２５ＥＵ·ｍＬ－１），依法进行干扰试验预试验。

结果见表２。

从预试验结果看，供试品以上浓度溶液均出现干扰，需采用适宜方法排除干扰。

精密称取盐酸替罗非班适量，加内毒素检查用水适量，涡旋或超声，使完全溶解，制成１ ０ｍｇ·ｍＬ－１浓度的盐酸替罗非班溶液，再依次用Ｔｒｉｓ缓冲液分别稀释至０ ５、０ ２５、０ １２５、０ ０６２５ｍｇ·ｍＬ－１，分别用两张鲎试剂（灵敏度均为０ ２５ＥＵ·ｍＬ－１），依法进行干扰试验预试验。

结果见表３。

从以上试验结果看，供试品以上浓度溶液均未出现干扰，可采用预实验的最大不干扰浓度０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１进行正式干扰试验。

２ ４　干扰试验
根据预试验结果，将盐酸替罗非班用细菌内毒素检查用水制成１ ０ｍｇ·ｍＬ－１，再用Ｔｒｉｓ缓冲液稀释成０ ５和０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１供试品溶液备用，用０ ５ｍｇ·ｍＬ－１盐酸替罗非班溶液与相应浓度的细菌内毒素标准品溶液等量稀释制成２λ、１λ、０ ５λ、
０ ２５λ的供试品内毒素溶液。

使用两个厂家鲎试剂与上述供试品内毒素溶液反应，并同时制备相应的供试品溶液对照和阴性对照，依法进行干扰试验［５］。

结果见表４。

表２　细菌内毒素干扰预试验结果
Ｔａｂ ２　Ｔｈｅｐｒｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
鲎试剂批号（ｂａｔｃｈＮｏ ｏｆＴＡＬ）
供试品浓度（Ｔｅｓｔｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｃｏｎｃｅｒｔｒａｔｉｏｎ）／（ｍｇ·ｍＬ－１）
供试品内毒素浓度（ＰＰＣ）／（ＥＵ·ｍＬ－１）
０ ５０ ０６
供试品溶液
（ＮＰＣ）
阴性对照
（ＮＣ）
阳性对照
（ＰＣ）
１７０６０１２０ ５－－－－－－－－＋＋
０ ２５－－－－－－
０ １２５－－－－－－
０ ０６－－－－－－
０ ０３－－－－－－
０ ０１５－－－－－－１７０３０９０ ５－－－－－－－－＋＋
０ ２５－－－－－－
０ １２５－－－－－－
０ ０６－－－－－－
０ ０３－－－－－－
０ ０１５－－－－－－
表３　细菌内毒素干扰预试验结果
Ｔａｂ ３　Ｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
鲎试剂批号（ｂａｔｃｈＮｏ ｏｆＴＡＬ）
供试品浓度（Ｔｅｓｔｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｃｏｎｃｅｒｔｒａｔｉｏｎ）／（ｍｇ·ｍＬ－１）
供试品内毒素浓度（ＰＰＣ）／（ＥＵ·ｍＬ－１）
０ ５０ ０６
试品溶液
（ＮＰＣ）
阴性对照
（ＮＣ）
阳性对照
（ＰＣ）
１７０６０１２０ ２５＋＋－－－－－－＋＋
０ １２５＋＋－－－－
０ ０６＋＋－－－－
０ ０３＋＋－－－－１７０３０９０ ２５＋＋－－－－－－＋＋
０ １２５＋＋－－－－
０ ０６＋＋－－－－
０ ０３＋＋－－－－
表４　细菌内毒素干扰试验结果
Ｔａｂ ４　Ｔｈｅｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
鲎试剂批号（ｂａｔｃｈＮｏ ｏｆＴＡＬ）供试品批号
（ｂａｔｃｈＮｏ
ｏｆｓａｍｐｌｅ）
供试品浓度
（Ｔｅｓｔｐｒｏｄｕｃｔｓ
ｃｏｎｃｅｒｔｒａｔｉｏｎ）／（ｍｇ·ｍＬ－１）
内毒素浓度（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｃｏｎｃｅｒｔｒａｔｉｏｎ）／
（ＥＵ·ｍＬ－１）
０ ５０ ２５０ １２５０ ０６
ＮＣＥｔλ／Ｅｔ
１７０６０１２ＢＥＴ水／＋＋＋＋－－－－－－／符合要求（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａ）１７１００９０ ２５＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－－０ ５０ ５
１７１０１８０ ２５＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－０ ２５１ ０
１７１０２７０ ２５＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－０ ３５０ ７１１７０３０９ＢＥＴ水／＋＋－－－－－－－－／
符合要求（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａｔ）１７１００９０ ２５＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－０ ４２０ ６
１７１０１８０ ２５＋＋＋＋＋＋＋＋－－－－－－－－－－０ ２５１ ０
１７１０２７０ ２５＋＋＋＋－－－－－－－－－－－－－－０ ５０ ５
注：λ为鲎试剂标示灵敏度，Ｅｔ为供试品溶液制成的内毒素溶液的反应终点浓度的对数值（λｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｏｆＴＡＬ；Ｅｔｉｓｔｈｅｌｏｇａｒｉｔｈｍｏｆｔｈｅｅｎｄｐｏｉｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎｐｒｅｐａｒｅｄｆｒｏｍｔｈｅｔｅｓｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）
结果表明，选用两个厂家鲎试剂，对盐酸替罗非班采用Ｔｒｉｓ缓冲液稀释的方法进行干扰试验，供试品溶液在０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１及以下浓度，对两种鲎试剂和内毒素的凝集反应均无干扰。

２ ５　细菌内毒素检查
根据干扰试验结果和本品细菌内毒素限值５ ０ＥＵ·ｍｇ－１，使用两个厂家鲎试剂，先将供试品用细菌内毒素检查用水溶解制成１ ０ｍｇ·ｍＬ－１的溶液，再用Ｔｒｉｓ缓冲液稀释至０ ０５ｍｇ·ｍＬ－１，对上述３批样品进行内毒素检查，试验结果成立，均符合规定。

试验结果见表５。

表５　细菌内毒素检查结果
Ｔａｂ ５　Ｔｈｅｔｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎ
鲎试剂批号（ＴＡＬｂａｔｃｈ
Ｎｏ ）供试品批号
（ｂａｔｃｈＮｏ
ｏｆｓａｍｐｌｅ）
供试品浓度
（Ｔｅｓｔｐｒｏｄｕｃｔｓｃｏｎｃｅｒｔｒａｔｉｏｎ）／
（ｍｇ·ｍＬ－１）
阴性对照
（ＮＣ）
阳性对照
（ＰＣ）
供试品
阳性对照
（ＰＰＣ）
供试品
（ＮＰＣ）
结论
（ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ）
１７０６０１２１７１００９０ ０５－－＋＋＋＋－－符合规定（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａ）１７１０１８０ ０５＋＋－－符合规定（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａ）
１７１０２７０ ０５＋＋－－符合规定（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａ）１７０３０９１７１００９０ ０５－－＋＋＋＋－－符合规定（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａ）１７１０１８０ ０５＋＋－－符合规定（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａ）
１７１０２７０ ０５＋＋－－符合规定（ｍｅｅｔｔｈｅｃｒｉｔｅｒｉａ）
３　结论
盐酸替罗非班原料药对鲎试剂与内毒素的凝集反应有干扰作用，采用Ｔｒｉｓ缓冲液将供试品溶液稀释至０ ２５ｍｇ·ｍＬ－１，即可排除干扰进行细菌内毒素检查，限值拟定为每１ｍｇ盐酸替罗非班中含内毒素的量应小于５ ０ＥＵ。

４　讨论
采用两个不同厂家的鲎试剂对３个批次的盐酸替罗非班原料药进行干扰试验，试验结果显示盐酸替罗非班对ＴＡＬ与细菌内毒素的凝集反应有干扰作用，经内毒素检查用水稀释仍不能排除干扰，Ｔｒｉｓ缓冲液作为一种专为细菌内毒素检查而设计的一种ｐＨ调节剂，能有效缓冲被检查溶液的ｐＨ值，从而消除了ｐＨ因素对检查的影响。

盐酸替罗非班在水中微溶或极微溶，因此在进行干扰预实验前，应根据市售鲎试剂的灵敏度范围和拟定的内毒素限值确定溶液的稀释浓度范围，选择合适的溶解浓度，并可以采用超声的方法溶解［３ ４］，实验表明超声溶解的方法并不会对细菌内毒素的检查产生影响。

参考文献
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ＺＨＡＮＧＴＴ，ＧＡＯＳ，ＳＨＡＯＣＪ，ｅｔａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌｅｎｄｏｔｏｘｉｎｔｅｓｔｆｏｒｐａｃｌｉｔａｘｅｌ［Ｊ］．ＤｒｕｇＳｔａｎｄＣｈｉｎａ，２０１４，１５（５）：３５９
［５］　中华人民共和国药典２０１５年版 四部［Ｓ］．２０１５：１５４ＣｈＰ２０１５ ＶｏｌⅣ［Ｓ］．２０１５：１５４
（收稿日期：２０２０ ０３ １１）。